阅读说明：本技术 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试剂盒 (Kit for detecting antidepressant drug in serum by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry technology ) 是由 成晓亮 李美娟 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试剂盒,前处理过程简单,成本低,且灵敏度高、特异性强,4.5min之内完成抗抑郁药物的分离和检测,准确度与精密度基本满足要求,可用于临床上抗抑郁药物的定量分析,为临床上抗抑郁药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。(The invention relates to a kit for detecting antidepressant drugs in serum by using an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry technology, which has the advantages of simple pretreatment process, low cost, high sensitivity and strong specificity, completes the separation and detection of the antidepressant drugs within 4.5min, basically meets the requirements on accuracy and precision, can be used for quantitative analysis of clinical antidepressant drugs, and provides a reliable detection method for monitoring the treatment concentration of the antidepressant drugs in clinic.)

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试 剂盒

技术领域

本发明属于血清检测技术领域，具体涉及超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试剂盒。

背景技术

目前抑郁症常用的治疗药物根据其作用机制分为：去甲肾上腺素再摄取抑制剂、5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(SSRI)、5-HT和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素和特异性的5-HT能抗抑郁药(NaSSA)、5-HT2受体拮抗药和5-HT再摄取抑制剂、去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂和褪黑素受体激动药。

国内外文献报道中测定人血清或血浆中抗抑郁药的方法主要有HPLC-UV法、GC-MS法和LC-MS/MS法，比如文献“Quantification of 33 antidepressants by LC-MS/MS—comparative validation in whole blood,plasma and serum”报道一种液液萃取检测33种抗抑郁药方法，但是前处理需要液液萃取，氮吹浓缩等复杂程序，每个样本采集需要30分钟。比如，中国专利(CN 108982714 A)公开了“一种简便高效检测人血浆中文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛浓度的方法”，该发明是将500μL血浆样本加入***进行液液萃取，然后氮吹后复溶进样，再通过高效液相荧光法检测待测物浓度；此发明前处理费时费力，样本用量大，而且单个样本的分析时间较长。另，中国专利(CN 109655568 A)公开了一种“高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒”，该发明虽前处理简单，但使用外标法定量，准确性差。再比如，西北药学杂志2019年11月第34卷第6期题为“LC-MS/MS法同时测定人血浆中氟西汀、去甲氟西汀、帕罗西汀和氟伏沙明的质量浓度”，该发明使用200μL血浆进行蛋白沉淀，样本用量大；使用罗红霉素作为所有待测物的内标，缺乏普遍适用性和准确性，可能会存在基质效应干扰；4种药物的线性范围均相同，未经临床验证，缺乏合理性。此外，因为临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量要少，且进样量大会严重污染仪器，增加仪器维护成本。本发明采用单一方法评估不同抗抑郁药将会大大简化和方便实验室监测，满足临床的需求。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试剂盒，

所述抗抑郁药物分别为：安非他酮(BPP)、阿戈美拉汀(AML)、羟安非他酮(HBPP)、去甲替林(NTP)、o-去甲文拉法辛(NVLF)、米安色林(MAS)、米氮平(MTZ)、文拉法辛(VLF)、阿米替林(ATP)、多虑平(DXP)、去甲氟西汀(NFXT)、度洛西汀(DLX)、氟西汀(FXT)、氟伏沙明(FVX)、西酞普兰(CTP)、帕罗西汀(PXT)、曲唑酮(TZD)、伏硫西汀(VXT)；

上述抗抑郁药物对应的同位素内标物分别为：安非他酮-d9(BPP-d9)、阿戈美拉汀-d6(AML-d6)、羟安非他酮-d6(HBPP-d6)、o-去甲文拉法辛-d6(NVLF-d6)、去甲替林-d3(NTP-d3)、米安色林-d3(MAS-d3)、米氮平-d3(MTZ-d3)、文法拉辛-d6(VLF-d6)、阿米替林-d3(ATP-d3)、多虑平-d3(DXP-d3)、去甲氟西汀-d5(NFXT-d5)、度洛西汀-d7(DLX-d7)、氟西汀-d5(FXT-d5)、氟伏沙明-d3(FVX-d3)、西酞普兰-d4(CTP-d4)、帕罗西汀-d6(PXT-d6)、曲唑酮-d6(TZD-d6)和伏硫西汀-d8(VXT-d8)。

所述的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：水(含0.001％～0.1％甲酸)；流动相B：甲醇(含0.001％～0.1％甲酸)；

(2)校准品样本：

七个不同浓度点的校准品样本：

S1:包含AML/MAS/CTP/PXT各1ng/mL，BPP/HBPP/TZD各10ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各2ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各5ng/mL，NVLF20 ng/mL，FVX4 ng/mL，VXT 0.5ng/mL；

S2:包含AML/MAS/CTP/PXT各2.5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各25ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各5ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各12.5ng/mL，NVLF 50ng/mL，FVX 10ng/mL，VXT 1.25ng/mL；

S3:包含AML/MAS/CTP/PXT各5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各50ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各10ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各25ng/mL，NVLF 100ng/mL，FVX 20ng/mL，VXT 2.5ng/mL；

S4:包含AML/MAS/CTP/PXT各25ng/mL，BPP/HBPP/TZD各250ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各50ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各125ng/mL，NVLF 500ng/mL，FVX 100ng/mL，VXT12.5ng/mL；

S5:包含AML/MAS/CTP/PXT各50ng/mL，BPP/HBPP/TZD各500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各100ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各250ng/mL，NVLF 1000ng/mL，FVX 200ng/mL，VXT25ng/mL；

S6:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL；

S7:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL；

(3)混合内标工作液：

包含有200ng/mL BPP-d9、20ng/mL AML-d6、200ng/mL HBPP-d6、100ng/mL NVLF-d6、50ng/mL NTP-d3、20ng/mL MAS-d3、50ng/mL MTZ-d3、100ng/mL VLF-d6、100ng/mL ATP-d3、50ng/mL DXP-d3、100ng/mL NFXT-d5、50ng/mL DLX-d7、100ng/mL FXT-d5、100ng/mLFVX-d3、20ng/mL CTP-d4、20ng/mL PXT-d6、200ng/mL TZD-d6和10ng/mL VXT-d8的甲醇溶液。

(4)蛋白质沉淀剂：

甲醇、乙腈中的任意一种，或甲醇和乙腈的混合溶液；

(5)质控品：

含有抗抑郁药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，

QC(L)中包含：20ng/mL BPP、2ng/mL AML、20ng/mL HBPP、4ng/mL NTP、2ng/mLMAS、4ng/mL MTZ、10ng/mL VLF、10ng/mL ATP、4ng/mL DXP、10ng/mL NFXT、4ng/mL DLX、10ng/mL FXT、8ng/mL FVX、2ng/mL CTP、2ng/mL PXT、20ng/mL TZD、1ng/mL VXT和40ng/mLNVLF；

QC(M)中包含：200ng/mL BPP、20ng/mL AML、200ng/mL HBPP、40ng/mL NTP、20ng/mL MAS、40ng/mL MTZ、100ng/mL VLF、100ng/mL ATP、40ng/mL DXP、100ng/mL NFXT、40ng/mL DLX、100ng/mL FXT、80ng/mL FVX、20ng/mL CTP、20ng/mL PXT、200ng/mL TZD、10ng/mLVXT和400ng/mL NVLF；

QC(H)中包含2000ng/mL BPP、200ng/mL AML、2000ng/mL HBPP、400ng/mL NTP、200ng/mL MAS、400ng/mL MTZ、1000ng/mL VLF、1000ng/mL ATP、400ng/mL DXP、1000ng/mLNFXT、400ng/mL DLX、1000ng/mL FXT、800ng/mL FVX、200ng/mL CTP、200ng/mL PXT、2000ng/mL TZD、100ng/mL VXT和4000ng/mL NVLF。

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试剂盒，

所述抗抑郁药物分别为BPP、AML、HBPP、NTP、NVLF、MAS、MTZ、VLF、ATP、DXP、NFXT、DLX、FXT、FVX、CTP、PXT、TZD、VXT；

所述的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：0.001％～0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.001％～0.1％甲酸甲醇溶液；

(2)混合标准溶液以及空白血清基质；

混合标准溶液包含有100000ng/mL BPP、10000ng/mL AML、100000ng/mL HBPP、20000ng/mL NTP、10000ng/mL MAS、20000ng/mL MTZ、50000ng/mL VLF、50000ng/mL ATP、20000ng/mL DXP、50000ng/mL NFXT、20000ng/mL DLX、50000ng/mL FXT、40000ng/mL FVX、10000ng/mL CTP、10000ng/mL PXT、100000ng/mL TZD、5000ng/mL VXT和200000ng/mLNVLF；

检测前按照使用说明书中记载的配方将所述的混合标准溶液用空白血清基质稀释配制成七个不同浓度点的校准品样本S1～S7和低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)：

S1:包含AML/MAS/CTP/PXT各1ng/mL，BPP/HBPP/TZD各10ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各2ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各5ng/mL，NVLF20 ng/mL，FVX4 ng/mL，VXT 0.5ng/mL；

S2:包含AML/MAS/CTP/PXT各2.5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各25ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各5ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各12.5ng/mL，NVLF 50ng/mL，FVX 10ng/mL，VXT 1.25ng/mL；

S3:包含AML/MAS/CTP/PXT各5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各50ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各10ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各25ng/mL，NVLF 100ng/mL，FVX 20ng/mL，VXT 2.5ng/mL；

S4:包含AML/MAS/CTP/PXT各25ng/mL，BPP/HBPP/TZD各250ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各50ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各125ng/mL，NVLF 500ng/mL，FVX 100ng/mL，VXT12.5ng/mL；

S5:包含AML/MAS/CTP/PXT各50ng/mL，BPP/HBPP/TZD各500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各100ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各250ng/mL，NVLF 1000ng/mL，FVX 200ng/mL，VXT25ng/mL；

S6:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL；

S7:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL；

QC(L)中包含：20ng/mL BPP、2ng/mL AML、20ng/mL HBPP、4ng/mL NTP、2ng/mLMAS、4ng/mL MTZ、10ng/mL VLF、10ng/mL ATP、4ng/mL DXP、10ng/mL NFXT、4ng/mL DLX、10ng/mL FXT、8ng/mL FVX、2ng/mL CTP、2ng/mL PXT、20ng/mL TZD、1ng/mL VXT和40ng/mLNVLF；

QC(M)中包含：200ng/mL BPP、20ng/mL AML、200ng/mL HBPP、40ng/mL NTP、20ng/mL MAS、40ng/mL MTZ、100ng/mL VLF、100ng/mL ATP、40ng/mL DXP、100ng/mL NFXT、40ng/mL DLX、100ng/mL FXT、80ng/mL FVX、20ng/mL CTP、20ng/mL PXT、200ng/mL TZD、10ng/mLVXT和400ng/mL NVLF；

QC(H)中包含2000ng/mL BPP、200ng/mL AML、2000ng/mL HBPP、400ng/mL NTP、200ng/mL MAS、400ng/mL MTZ、1000ng/mL VLF、1000ng/mL ATP、400ng/mL DXP、1000ng/mLNFXT、400ng/mL DLX、1000ng/mL FXT、800ng/mL FVX、200ng/mL CTP、200ng/mL PXT、2000ng/mL TZD、100ng/mL VXT和4000ng/mL NVLF；

(3)混合内标工作液：

包含有200ng/mL BPP-d9、20ng/mL AML-d6、200ng/mL HBPP-d6、100ng/mL NVLF-d6、50ng/mL NTP-d3、20ng/mL MAS-d3、50ng/mL MTZ-d3、100ng/mL VLF-d6、100ng/mL ATP-d3、50ng/mL DXP-d3、100ng/mL NFXT-d5、50ng/mL DLX-d7、100ng/mL FXT-d5、100ng/mLFVX-d3、20ng/mL CTP-d4、20ng/mL PXT-d6、200ng/mL TZD-d6和10ng/mL VXT-d8的甲醇溶液。

(4)蛋白质沉淀剂：

甲醇、乙腈中的任意一种，或甲醇和乙腈的混合溶液；

(5)使用说明书：包含校准品样本S1～S7和低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)的配制方法。

在一种优选方案中，上述流动相A为0.005％-0.05％甲酸水溶液，优选为0.01％甲酸水溶液。

在一种方案中，蛋白沉淀剂为甲醇和乙腈体积比1:1～3的混合溶剂，优选为甲醇和乙腈体积比1:2的混合溶剂。

本发明提及的混合标准溶液按照如下方法制备：将5mg/mL安非他酮标准品母液、2mg/mL阿戈美拉汀标准品母液、5mg/mL羟安非他酮标准品母液、2mg/mL去甲替林标准品母液、0.2mg/mL米安色林标准品母液、4mg/mL米氮平标准品母液、5mg/mL文拉法辛标准品母液、2mg/mL阿米替林标准品母液、2mg/mL多虑平标准品母液、5mg/mL去甲氟西汀标准品母液、2mg/mL度洛西汀标准品母液、5mg/mL氟西汀标准品母液、4mg/mL氟伏沙明标准品母液、0.5mg/mL西酞普兰标准品母液、2mg/mL帕罗西汀标准品母液、5mg/mL曲唑酮标准品母液、1mg/mL伏硫西汀标准品母液和1mg/mL O-去甲文拉法辛标准品母液以甲醇溶液配制成包含有100000ng/mL安非他酮、10000ng/mL阿戈美拉汀、100000ng/mL羟安非他酮、20000ng/mL去甲替林、10000ng/mL米安色林、20000ng/mL米氮平、50000ng/mL文拉法辛、50000ng/mL阿米替林、20000ng/mL多虑平、50000ng/mL去甲氟西汀、20000ng/mL度洛西汀、50000ng/mL氟西汀、40000ng/mL氟伏沙明、10000ng/mL西酞普兰、10000ng/mL帕罗西汀、100000ng/mL曲唑酮、5000ng/mL伏硫西汀和200000ng/mL O-去甲文拉法辛的混合标准溶液。

本发明提及的混合内标工作液按照如下方法制备：将1mg/mL BPP-d9、0.1mg/mLAML-d6、0.1mg/mL HBPP-d6、0.1mg/mL NVLF-d6、0.1mg/mL NTP-d3、0.1mg/mL MAS-d3、0.1mg/mL MTZ-d3、0.1mg/mL VLF-d6、0.1mg/mL ATP-d3、0.1mg/mL DXP-d3、0.1mg/mLNFXT-d5、0.1mg/mL DLX-d7、0.1mg/mL FXT-d5、0.1mg/mL FVX-d3、0.1mg/mL CTP-d4、0.1mg/mL PXT-d6、0.1mg/mL TZD-d6和0.01mg/mL VXT-d8的同位素内标母液用甲醇溶液配制成包含有2000ng/mL BPP-d9、200ng/mL AML-d6、2000ng/mL HBPP-d6、1000ng/mL NVLF-d6、500ng/mL NTP-d3、200ng/mL MAS-d3、500ng/mL MTZ-d3、1000ng/mL VLF-d6、1000ng/mLATP-d3、500ng/mL DXP-d3、1000ng/mL NFXT-d5、500ng/mL DLX-d7、1000ng/mL FXT-d5、1000ng/mL FVX-d3、200ng/mL CTP-d4、200ng/mL PXT-d6、2000ng/mL TZD-d6和100ng/mLVXT-d8的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混合均匀得混合内标工作液。

本发明提及的基质为血清或动物的血清。

本发明提及的空白血清基质为无抗抑郁药物的空白血清。

上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的应用也在本发明的保护范围之内。

具体检测方法如下：

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的方法，

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗抑郁药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗抑郁药物的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：水(含0.001％～0.1％甲酸)；

流动相B：甲醇；

色谱柱：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至25:75；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由25:75匀速渐变至3:97；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由3:97匀速渐变至85:15。流速为0.2～0.5mL/min，每个样品采集时间为4.5min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～10μL；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中抗抑郁药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，4.5min之内完成抗抑郁药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.005％～0.05％甲酸水溶液，流动相B为0.005％～0.05％甲酸甲醇溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.01％甲酸水溶液，流动相B为0.01％甲酸甲醇溶液。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.001％～0.1％甲酸水溶液和0.001％～0.1％甲酸甲醇溶液作为流动相，色谱柱型号：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，4.5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用安非他酮-d9(BPP-d9)、阿戈美拉汀-d6(AML-d6)、羟安非他酮-d6(HBPP-d6)、o-去甲文拉法辛-d6(NVLF-d6)、去甲替林-d3(NTP-d3)、米安色林-d3(MAS-d3)、米氮平-d3(MTZ-d3)、文法拉辛-d6(VLF-d6)、阿米替林-d3(ATP-d3)、多虑平-d3(DXP-d3)、去甲氟西汀-d5(NFXT-d5)、度洛西汀-d7(DLX-d7)、氟西汀-d5(FXT-d5)、氟伏沙明-d3(FVX-d3)、西酞普兰-d4(CTP-d4)、帕罗西汀-d6(PXT-d6)、曲唑酮-d6(TZD-d6)和伏硫西汀-d8(VXT-d8)作为内标，和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中抗抑郁药物时的重现性、准确度均较好。

在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.4mL/min。

进一步地，柱温为30～50℃，优选为45℃。

更进一步地，进样体积为0.2～10μL，优选为1μL。

在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物时，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：水(含0.01％甲酸)；

流动相B：甲醇(含0.01％甲酸)；

色谱柱：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，见表1；所述梯度洗脱过程如下：在0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至25:75；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由25:75匀速渐变至3:97；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由3:97匀速渐变至85:15；流速为0.4mL/min，每个样品采集时间为4.5min，柱温为45℃，进样体积为1μL。

表1流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标；各个目标物的去簇电压和碰撞电压等参数，见表2：

表2抗抑郁药物检测质谱参数

在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为甲醇、乙腈中的任意一种，或甲醇与乙腈混合溶液。

优选地，蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液，其中甲醇与乙腈的体积比1:1～3，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:2。

采用本发明的技术方案，优势如下:

采用本发明的试剂盒检测血清中抗抑郁药物时，前处理过程简单、灵敏度高、样本用量少、单个样品分析时间短、通量高，4.5min之内完成血清中18种抗抑郁药物的分离和检测，采用同位素内标定量法准确度高，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上联合用药的药代动力学及临床研究，为临床上抗抑郁药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。

附图说明

图1为抗抑郁药物标准品的提取离子流色谱图。

图2为血清中抗抑郁药物的提取离子流色谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

一、实验材料与仪器

1.材料

方法学研究实验的样本来自于南京鼓楼医院2019年10月份门诊收集的血清样本。

(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。

(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；色谱柱：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)(Phenomenex Corporation)。

(3)标准品：涉及的所有抗抑郁药物的标准品购买信息，见下表3。

表3标准品购买信息

(4)质控品：含有抗抑郁药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表1所示。

二、液质条件

(1)色谱条件：流动相A：水(含0.01％甲酸)；流动相B：甲醇(含0.01％甲酸)。色谱柱型号：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表4。流速为0.4mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。

(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标，各目标物的去簇电压和碰撞电压等参数。各目标待测物的质谱采集参数见表2。

三、实验过程

(1)标准品配制：

分别准确移取一定体积的抗抑郁药物标准母液，加入555μL甲醇溶液，充分混匀得到1mL混合标准溶液，浓度参下表4。

表4混合标准溶液的配制

(2)标曲的配制：

将上述混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品样本S1～S7，配制过程如下：

取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。

所述校准品样本S1～S7中各物质浓度分别如前所述。

(3)混合内标工作液配制

分别准确移取一定体积的抗抑郁药物同位素内标母液，加入860μL甲醇溶液，混匀得到1mL混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混合均匀得混合内标工作液。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用；见下表5。

表5混合内标工作溶液配制

(4)质控品配制：

质控品溶液为含有抗抑郁药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中:QC(L)为中浓度质控以空白血清基质稀释至10倍；QC(M)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至500倍；QC(H)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至50倍。抗抑郁类药物质控品对应浓度详见发明内容部分的记载。

(5)样品处理

1)校准品前处理：每个校准品样品取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL甲醇/乙腈＝1:2(V/V)，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

2)血清样品前处理：方法同校准品前处理。

3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后跟血清样品前处理方法一致，此处不再赘述。

分析试剂盒中各组分见表7。

表7抗抑郁类药物分析试剂盒组分的制备(100人份)

四、方法验证

1.提取离子流色谱图：抗抑郁药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗抑郁药物标准品的提取离子流色谱图，图2为血清中抗抑郁药物的提取离子流色谱图。

2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗抑郁药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.990以上，满足定量要求，见表8。

表8抗抑郁药物线性回归方程及线性相关系数

3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗抑郁药物的加标回收率在91.60％-109.88％之间，5次重复试验的RSD在0.75％-7.81％范围，统计结果见表9。

表9抗抑郁药物加标回收率结果

4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗抑郁药物标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定抗抑郁药物的浓度，批内精密度为1.20-10.81％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.95-12.74％，结果见表10。

五、讨论

本研究建立了一种超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)，同时测定人体血清中18种抗抑郁药物的方法。针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。

以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗抑郁药物的加标回收率为91.60％-109.88％之间，5次重复试验的RSD为0.75％-7.81％，准确度良好。

方法的重现性结果表明，抗抑郁药物的批内精密度为1.20-10.81％，批间精密度为2.95-12.74％，方法的重现性良好。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离。且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅50μL。

总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，4.5min之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗抑郁药物的定量分析，为临床上抗抑郁药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。