阅读说明：本技术 一种检测血清中18种脂肪酸的试剂盒 (Kit for detecting 18 fatty acids in serum ) 是由 成晓亮 李美娟 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测血清中18种脂肪酸的试剂盒及其应用。所述18种脂肪酸分别为：月桂酸、十四碳一烯酸、肉豆蔻酸、十六碳一烯酸、棕榈酸、α-十八碳三烯酸、γ-十八碳三烯酸、十八碳二烯酸、十八碳一烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳一烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、二十二碳五烯酸-ω6和二十二碳四烯酸；该试剂盒包括：洗脱液、校准品溶液、混合内标工作液、蛋白质沉淀剂、质控品。采用本发明试剂盒,样本无需衍生化处理,前处理简单,样本用量小,灵敏度高,特异性强,6.5分钟之内可同时检测18种脂肪酸,可用于临床上血清脂肪酸的诊断及健康评估。(The invention discloses a kit for detecting 18 fatty acids in serum and application thereof. The 18 fatty acids are respectively: lauric acid, tetradecenoic acid, myristic acid, hexadecenoic acid, palmitic acid, α -octadecatrienoic acid, γ -octadecatrienoic acid, octadecadienoic acid, octadecenoic acid, stearic acid, eicosapentaenoic acid, arachidonic acid, eicosatrienoic acid, eicosenoic acid, docosahexaenoic acid, docosapentaenoic acid- ω 3, docosapentaenoic acid- ω 6 and docosatetraenoic acid; the kit comprises: eluent, calibrator solution, mixed internal standard working solution, protein precipitator and quality control product. By adopting the kit, a sample does not need derivatization treatment, the pretreatment is simple, the sample dosage is small, the sensitivity is high, the specificity is strong, 18 fatty acids can be simultaneously detected within 6.5 minutes, and the kit can be used for clinical diagnosis and health assessment of serum fatty acids.)

一种检测血清中18种脂肪酸的试剂盒

技术领域

本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸的试剂盒。

背景技术

脂肪酸是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，它是构成人体脂肪和内脂的基本物质，是细胞膜磷脂的重要成分，直接调节细胞膜的组成及蛋白质与膜内受体。脂肪酸根据饱和度的不同可分为饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)。

饱和脂肪酸可以调节肠道运动，促进结肠细胞的增殖，也可增加肠道黏膜损伤处的循环血流，促进肠道黏膜结构和功能的修复；另外，短链饱和脂肪酸可治疗转流性结肠炎、远端溃疡性结肠炎和放射性结肠炎。但是，摄入过多量的饱和脂肪酸会增加高胰岛素血症的风险以及患乳腺癌的危险，同时会导致血胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高，继发引起动脉管腔狭窄，形成动脉粥样硬化，增加患冠心病的风险。

单不饱和脂肪酸可以降低血糖、降胆固醇和人体低密度脂蛋白(LDL)的水平，降低血小板的聚集率，减少机体内自由基脂质超氧化物的作用，也具有降低血糖的作用。单不饱和脂肪酸改善了内皮白细胞黏附因子的基因表达，从而可预防动脉粥样硬化，降低患冠心病的危险性。同时，由于单不饱和脂肪酸是神经元细胞膜组成成分，它能够维持神经元细胞膜的完整性，因此，单不饱和脂肪酸能够防止记忆力下降。还有研究表明单不饱和脂肪酸有效降低血清总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的水平；增强心肌细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性；在一定程度上保持心肌细胞线粒体膜、核膜和肌丝结构的完整性。在形态或功能上对梗阻性黄疸心脏起到一定的保护作用。

多不饱和脂肪酸是脑的成长、细胞间相互作用、第二信息向乙酰胆碱的应答及神经传导功能等脑功能发育不可缺少的物质，可用于治疗精神***症。另外，多不饱和脂肪酸有利于膜的流动性，更有利于胰岛素的透膜吸收与受体的结合。同时多不饱和脂肪酸可使低密度脂蛋白降低(LDL)，高密度脂蛋白略有降低，从而降低患动脉粥样硬化，降低患冠心病的风险。

在正常情况下，人体内脂肪酸是一种稳定的化学组分，处于相对平衡的状态，生物体内脂肪酸的改变能够诱导神经生理认知和其他行为的变化，尤其是必需脂肪酸含量的变化。而某些脂肪酸(如亚油酸亚麻油酸等高级脂肪酸)对人体保健极为重要，但人体又不能自行合成，根据检测含量的高低，可通过饮食营养加以调节，提高人体健康和防止疾病的发生。

目前国内外有关脂肪酸检测的报道盛多，涉及食品、药品、环境、医疗卫生和临床应用等多个领域，检测方法包括气相色谱发(GC)、气相色谱质谱发(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，检测的样本类型也多种多样，涉及食品、环境、药品、血液等。但是不同领域、不同样本类型所涉及的脂肪酸检测的样本前处理方法、检测方法和检测流程各不相同，检测意义和参考区间也大不相同，没有可比性。

现有技术中也有一些基于LC-MS/MS的检测脂肪酸的方法。CN 102539592 A公开了一种检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，该方法存在一定的缺陷，如只能检测极长链脂肪酸，对于疾病诊断和临床意义有限；前处理步骤复杂，且需要经过衍生，在临床检测中难以应用。CN 110146627 A公开了一种高效液相色谱串质谱联用技术检测人干血斑中4种游离脂肪酸的分析试剂盒，该检测方法检测的化合物种类较少，仅能检测4种游离脂肪酸，对于疾病诊断和临床意义有限；提取震荡时间达30分钟，提取后的样本浓缩再进行衍生，衍生时间达30分钟，之后浓缩上机检测，一针分析时间12分钟，前处理和检测时间过长，难以用于临床检测。CN 109239238 A公开了一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法，该检测方法检测的种类多，但是前处理所有步骤都需要在冰上操作，前处理和上机的所需容器都为玻璃材质，操作困难、成本高且不易于开展大样本检测；其次，检查数据中部分化合物加标回收率低于80％，不符合临床检测标准；该试剂盒中的流动相含有高浓度的盐，对仪器和耗材损伤极大，难以长期应用。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸的试剂盒及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸的试剂盒，

所述18种脂肪酸分别为：月桂酸、十四碳一烯酸、肉豆蔻酸、十六碳一烯酸、棕榈酸、α-十八碳三烯酸、γ-十八碳三烯酸、十八碳二烯酸、十八碳一烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳一烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、二十二碳五烯酸-ω6和二十二碳四烯酸；

该试剂盒包括：洗脱液、校准品溶液、混合内标工作液、蛋白质沉淀剂、质控品；

所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为0.01～0.5％甲酸-水溶液，洗脱液B为乙腈和异丙醇的混合液，乙腈和异丙醇的体积比为1:2～5:1；

所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血清基质配制的月桂酸、十四碳一烯酸、肉豆蔻酸、十六碳一烯酸、棕榈酸、α-十八碳三烯酸、γ-十八碳三烯酸、十八碳二烯酸、十八碳一烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳一烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、二十二碳五烯酸-ω6和二十二碳四烯酸的混合溶液；

所述混合内标工作液为浓度已知的由甲醇配制的月桂酸-d3、棕榈酸-d3、十八碳一烯酸-13C18、硬脂酸-d3、二十碳三烯酸-d6、二十二碳六烯酸-d5和二十碳五烯酸-d5的混合溶液；

所述质控品包括包括浓度已知的由空白血清基质配制的月桂酸、十四碳一烯酸、肉豆蔻酸、十六碳一烯酸、棕榈酸、α-十八碳三烯酸、γ-十八碳三烯酸、十八碳二烯酸、十八碳一烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳一烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、二十二碳五烯酸-ω6和二十二碳四烯酸的混合溶液。

进一步地，所述洗脱液A为0.01％甲酸-水溶液，洗脱液B为体积比为5:1的乙腈和异丙醇的混合液。

进一步地，所述空白血清基质为1～10％BSA水溶液；优选为5％BSA水溶液。

进一步地，所述校准品溶液包括7种浓度配比的混合溶液。

进一步地，所述混合内标工作液中月桂酸-d3、棕榈酸-d3、十八碳一烯酸-13C18、硬脂酸-d3、二十碳三烯酸-d6、二十二碳六烯酸-d5和二十碳五烯酸-d5的浓度分别为月桂酸-d35μM、棕榈酸-d3 50μM、十八碳一烯酸-13C18 10μM、硬脂酸-d3 20μM、二十碳三烯酸-d6 10μM、二十二碳六烯酸-d5 20μM和二十碳五烯酸-d5 30μM。

进一步地，所述蛋白质沉淀剂为乙腈。

进一步地，所述质控品包括低、中、高三种浓度配比的混合溶液。

上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸中的应用。

采用本发明试剂盒检测血清中的18种脂肪酸，包括LRA、MOA、MA、POA、PA、αLA、γLA、LA、OA、SA、EPA、ARA、DGLA、11-EA、DHA、DPA、OBA和DTA，将血清样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，灵敏度高，特异性强，检测种类较多，6.5分钟之内可同时检测18种脂肪酸，可用于临床上血清脂肪酸的诊断及健康评估。

附图说明

图1为实施例1中18种脂肪酸标准品的选择离子流色谱图；

图2为实施例1的血清样本中18种脂肪酸的选择离子流色谱图。

具体实施方式

本发明提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸的试剂盒。

所述18种脂肪酸分别为：月桂酸(LRA)、十四碳一烯酸(MOA)、肉豆蔻酸(MA)、十六碳一烯酸(POA)、棕榈酸(PA)、α-十八碳三烯酸(αLA)、γ-十八碳三烯酸(γLA)、十八碳二烯酸(LA)、十八碳一烯酸(OA)、硬脂酸(SA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十碳四烯酸(ARA)、二十碳三烯酸(DGLA)、二十碳一烯酸(11-EA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸-ω3(DPA)、二十二碳五烯酸-ω6(OBA)和二十二碳四烯酸(DTA)；

上述18种脂肪酸对应的同位素内标物分别为：月桂酸-d3(LRA-d3)、棕榈酸-d3(PA-d3)、十八碳一烯酸-13C18(OA-IS)、硬脂酸-d3(SA-d3)、二十碳三烯酸-d6(DGLA-d6)、二十二碳六烯酸-d5(DHA-d5)和二十碳五烯酸-d5(EPA-d5)；

所述的试剂盒包含如下试剂：

(1)洗脱液：

洗脱液A：0.01～0.5％甲酸-水溶液；洗脱液B：乙腈/异丙醇，1:2～5:1(v/v)。

(2)校准品溶液：

将包含有800μM月桂酸、400μM十四碳一烯酸、4000μM肉豆蔻酸、2000μM十六碳一烯酸、40000μM棕榈酸、2000μMα-十八碳三烯酸、400μMγ-十八碳三烯酸、16000μM十八碳二烯酸、40000μM十八碳一烯酸、8000μM硬脂酸、400μM二十碳五烯酸、1600μM二十碳四烯酸2000μM二十碳三烯酸、400μM二十碳一烯酸、1600μM二十二碳六烯酸、400μM二十二碳五烯酸-ω3、200μM二十二碳五烯酸-ω6和800μM二十二碳四烯酸的混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

月桂酸和二十二碳四烯酸的浓度相同，依次为0.2μM、0.4μM、1μM、2μM、10μM、20μM和40μM；

十四碳一烯酸、γ-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、二十碳一烯酸和二十二碳五烯酸-ω3的浓度相同，依次为0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM和20μM；

肉豆蔻酸的浓度相同依次为1μM、2μM、5μM、10μM、50μM、100μM和200μM；

十六碳一烯酸、α-十八碳三烯酸和二十碳三烯酸的浓度相同，依次为0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、25μM、50μM和100μM；

棕榈酸和十八碳一烯酸的浓度相同，依次为10μM、20μM、50μM、100μM、500μM、1000μM和2000μM；

十八碳二烯酸的浓度依次为4μM、8μM、20μM、40μM、200μM、400μM和800μM；

硬脂酸的浓度依次为2μM、4μM、10μM、20μM、100μM、200μM和400μM；

二十碳四烯酸和二十二碳六烯酸的浓度相同，依次为0.4μM、0.8μM、2μM、4μM、20μM、40μM和80μM；

二十二碳五烯酸-ω6的浓度依次为0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、2.5μM、5μM和10μM。

(3)混合内标工作液：

包含有5μM月桂酸-d3、50μM棕榈酸-d3、10μM十八碳一烯酸-13C18、20μM硬脂酸-d3、10μM二十碳三烯酸-d6、20μM二十二碳六烯酸-d5和30μM二十碳五烯酸-d5的同位素内标SI溶液。取100μL SI溶液，加入900μL甲醇-水溶液，混合均匀得混合内标工作液。

(4)蛋白质沉淀剂：乙腈。

(5)质控品：

含有18种脂肪酸的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)和QC(H)，其中：

QC(L)为所述混合标准溶液以空白血清基质溶液稀释至1000倍；

QC(M)为所述混合标准溶液以空白血清基质溶液稀释至200倍；

QC(H)为所述混合标准溶液以空白血清基质溶液稀释至20倍。

在一种优选方案中，洗脱液A为0.01～0.5％甲酸-水溶液，流动相B：乙腈/异丙醇，1:2～5:1(v/v)；优选为流动相A为0.1％甲酸-水溶液；所述流动相B为乙腈/异丙醇，5:1(v/v)。

在一种方案中，本发明提及的空白血清基质为1～10％BSA水溶液；优选为5％BSA水溶液。

脂肪酸是内源性物质，目前无法获得商品化的不含脂肪酸空白血清，人血清中主要成分为血清蛋白，牛血清白蛋白是最常用的人空白血清替代基质，因此本研究采用牛血清白蛋白(BSA)作为人空白血清，制备标准品溶液时，空白血清基质为1～10％BSA水溶液；优选为5％BSA水溶液。

本发明提及的混合标准溶液采用以下方法制备：

取月桂酸、十四碳一烯酸、肉豆蔻酸、十六碳一烯酸、棕榈酸、α-十八碳三烯酸、γ-十八碳三烯酸、十八碳二烯酸、十八碳一烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳一烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、二十二碳五烯酸-ω6和二十二碳四烯酸，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为100mM、100mM、500mM、500mM、200mM、500mM、100mM、500mM、100mM、50mM、100mM、100mM、100mM、50mM、100mM、40mM、10mM和20mM的标准品母液；

上述各标准品母液再以甲醇-水溶液配制成包含有800μM月桂酸、400μM十四碳一烯酸、4000μM肉豆蔻酸、2000μM十六碳一烯酸、40000μM棕榈酸、2000μMα-十八碳三烯酸、400μMγ-十八碳三烯酸、16000μM十八碳二烯酸、40000μM十八碳一烯酸、8000μM硬脂酸、400μM二十碳五烯酸、1600μM二十碳四烯酸2000μM二十碳三烯酸、400μM二十碳一烯酸、1600μM二十二碳六烯酸、400μM二十二碳五烯酸-ω3、200μM二十二碳五烯酸-ω6和800μM二十二碳四烯酸的混合标准溶液。

本发明提及的混合内标工作液按照如下方法制备：称取各同位素内标物，包括月桂酸-d3、棕榈酸-d3、十八碳一烯酸-13C18、硬脂酸-d3、二十碳三烯酸-d6、二十二碳六烯酸-d5和二十碳五烯酸-d5分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为20mM、10mM、10mM、50mM、3mM、3mM和2mM的同位素内标母液；

上述各同位素内标母液再以纯甲醇配制成包含有50μM月桂酸-d3、500μM棕榈酸-d3、100μM十八碳一烯酸-13C18、200μM硬脂酸-d3、100μM二十碳三烯酸-d6、200μM二十二碳六烯酸-d5和300μM二十碳五烯酸-d5的同位素内标SI溶液。

取100μL SI溶液，加入900μL甲醇-水溶液，混合均匀得混合内标工作液。

在配制混合标准溶液和混合内标工作液时，所述甲醇-水溶液为80～100％甲醇-水溶液；优选为95％～100％甲醇-水溶液；更优选为纯甲醇溶液。

在一种更优选方案中，超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸的试剂盒包含如下试剂：

(1)洗脱液：

洗脱液A：0.1％甲酸-水溶液；洗脱液B：乙腈/异丙醇，5:1(v/v)。

(2)校准品溶液：

称取各待测物标准品，包括月桂酸、十四碳一烯酸、肉豆蔻酸、十六碳一烯酸、棕榈酸、α-十八碳三烯酸、γ-十八碳三烯酸、十八碳二烯酸、十八碳一烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳一烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、二十二碳五烯酸-ω6和二十二碳四烯酸，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为100mM、100mM、500mM、500mM、200mM、500mM、100mM、500mM、100mM、50mM、100mM、100mM、100mM、50mM、100mM、40mM、10mM和20mM的标准品母液；

上述各标准品母液再以纯甲醇配制成包含有800μM月桂酸、400μM十四碳一烯酸、4000μM肉豆蔻酸、2000μM十六碳一烯酸、40000μM棕榈酸、2000μMα-十八碳三烯酸、400μMγ-十八碳三烯酸、16000μM十八碳二烯酸、40000μM十八碳一烯酸、8000μM硬脂酸、400μM二十碳五烯酸、1600μM二十碳四烯酸2000μM二十碳三烯酸、400μM二十碳一烯酸、1600μM二十二碳六烯酸、400μM二十二碳五烯酸-ω3、200μM二十二碳五烯酸-ω6和800μM二十二碳四烯酸的混合标准溶液；

将上述混合标准溶液以空白血清基质(5％BSA)配制成七个不同浓度点的校准品溶液。

(3)混合内标工作液：

称取各同位素内标物，包括月桂酸-d3、棕榈酸-d3、十八碳一烯酸-13C18、硬脂酸-d3、二十碳三烯酸-d6、二十二碳六烯酸-d5和二十碳五烯酸-d5分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为20mM、10mM、10mM、50mM、3mM、3mM和2mM的同位素内标母液；

上述各同位素内标母液再以纯甲醇配制成包含有50μM月桂酸-d3、500μM棕榈酸-d3、100μM十八碳一烯酸-13C18、200μM硬脂酸-d3、100μM二十碳三烯酸-d6、200μM二十二碳六烯酸-d5和300μM二十碳五烯酸-d5的同位素内标SI溶液；

取100μL SI溶液，加入900μL纯甲醇，混合均匀得混合内标工作液。

(4)蛋白质沉淀剂：乙腈。

(5)质控品：

取上述混合标准溶液以5％BSA配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)；

QC(L)中包含：0.8μM月桂酸(LRA)、0.4μM十四碳一烯酸(MOA)、4μM肉豆蔻酸(MA)、2μM十六碳一烯酸(POA)、40μM棕榈酸(PA)、2μMα-十八碳三烯酸(αLA)、0.4μMγ-十八碳三烯酸(γLA)、16μM十八碳二烯酸(LA)、40μM十八碳一烯酸(OA)、8μM硬脂酸(SA)、0.4μM二十碳五烯酸(EPA)、1.6μM二十碳四烯酸(ARA)、2μM二十碳三烯酸(DGLA)、0.4μM二十碳一烯酸(11-EA)、1.6μM二十二碳六烯酸(DHA)、0.4μM二十二碳五烯酸-ω3(DPA)、0.2μM二十二碳五烯酸-ω6(OBA)和0.8μM二十二碳四烯酸(DTA)。

QC(M)中包含：4μM月桂酸(LRA)、2μM十四碳一烯酸(MOA)、20μM肉豆蔻酸(MA)、10μM十六碳一烯酸(POA)、200μM棕榈酸(PA)、10μMα-十八碳三烯酸(αLA)、2μMγ-十八碳三烯酸(γLA)、80μM十八碳二烯酸(LA)、200μM十八碳一烯酸(OA)、40μM硬脂酸(SA)、2μM二十碳五烯酸(EPA)、8μM二十碳四烯酸(ARA)、10μM二十碳三烯酸(DGLA)、2μM二十碳一烯酸(11-EA)、8μM二十二碳六烯酸(DHA)、2μM二十二碳五烯酸-ω3(DPA)、1μM二十二碳五烯酸-ω6(OBA)和4μM二十二碳四烯酸(DTA)。

QC(H)中包含：40μM月桂酸(LRA)、20μM十四碳一烯酸(MOA)、200μM肉豆蔻酸(MA)、100μM十六碳一烯酸(POA)、2000μM棕榈酸(PA)、100μMα-十八碳三烯酸(αLA)、20μMγ-十八碳三烯酸(γLA)、800μM十八碳二烯酸(LA)、2000μM十八碳一烯酸(OA)、400μM硬脂酸(SA)、20μM二十碳五烯酸(EPA)、80μM二十碳四烯酸(ARA)、100μM二十碳三烯酸(DGLA)、20μM二十碳一烯酸(11-EA)、80μM二十二碳六烯酸(DHA)、20μM二十二碳五烯酸-ω3(DPA)、10μM二十二碳五烯酸-ω6(OBA)和40μM二十二碳四烯酸(DTA)。

具体地，质控品中18种脂肪酸对应的QC(L)、QC(M)、QC(H)浓度见表1。

表1 质控品对应浓度(单位μM)

	QC(L)	QC(M)	QC(H)
				LRA	0.8	4	40
MOA	0.4	2	20
				MA	4	20	200
POA	2	10	100
				PA	40	200	2000
αLA	2	10	100
				γLA	0.4	2	20
LA	16	80	800
				OA	40	200	2000
SA	8	40	400
				EPA	0.4	2	20
ARA	1.6	8	80
				DGLA	2	10	100
11-EA	0.4	2	20
				DHA	1.6	8	80
DPA	0.4	2	20
				OBA	0.2	1	10
DTA	0.8	4	40

在一种优选方案中，校准品溶液按照如下方法制备：

准确称量3-5mg各待测标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中标准品母液浓度，再将各使用浓度用纯甲醇配制成混合标准溶液(详见表2)，混合均匀备用。

表2 混合标准液的配制

取10μL混合标准溶液加入至190μL 5％BSA中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积5％BSA稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用3倍体积5％BSA稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积5％BSA稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积5％BSA稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第七高值浓度点。所述校准品溶液的七个浓度点为：

月桂酸和二十二碳四烯酸的浓度相同，依次为0.2μM、0.4μM、1μM、2μM、10μM、20μM和40μM；

十四碳一烯酸、γ-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、二十碳一烯酸和二十二碳五烯酸-ω3的浓度相同，依次为0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM和20μM；

肉豆蔻酸的浓度相同依次为1μM、2μM、5μM、10μM、50μM、100μM和200μM；

十六碳一烯酸、α-十八碳三烯酸和二十碳三烯酸的浓度相同，依次为0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、25μM、50μM和100μM；

棕榈酸和十八碳一烯酸的浓度相同，依次为10μM、20μM、50μM、100μM、500μM、1000μM和2000μM；

十八碳二烯酸的浓度依次为4μM、8μM、20μM、40μM、200μM、400μM和800μM；

硬脂酸的浓度依次为2μM、4μM、10μM、20μM、100μM、200μM和400μM；

二十碳四烯酸和二十二碳六烯酸的浓度相同，依次为0.4μM、0.8μM、2μM、4μM、20μM、40μM和80μM；

二十二碳五烯酸-ω6的浓度依次为0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、2.5μM、5μM和10μM。

在一种优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：

准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中同位素内标母液浓度，再将各使用浓度用纯甲醇配制成同位素混合内标SI溶液(详见表3)，最后取100μL SI溶液，加入900μL纯甲醇，混合均匀得混合内标工作液。

表3 同位素混合内标SI溶液的配制

上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸的应用也在本发明的保护范围之内。

具体检测方法如下：

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的脂肪酸，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比(m/z)，使用同位素内标法定量，分别计算出18种脂肪酸的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈/异丙醇，5:1(v/v)；

色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为25:75；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由25:75匀速渐变至2:98；在4.5-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为25:75；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了18种脂肪酸及其对应同位素内标。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测脂肪酸的灵敏度更高，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，检测种类较多，6.5分钟之内可同时检测18种脂肪酸。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01～0.5％甲酸-水溶液，流动相B为乙腈/异丙醇，1:2～5:1(v/v)。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为乙腈/异丙醇，5:1(v/v)。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01～0.5％甲酸-水溶液和乙腈/异丙醇，1:2～5:1(v/v)作为流动相，色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，6.5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用月桂酸-d3(LRA-d3)、棕榈酸-d3(PA-d3)、十八碳一烯酸-13C18(OA-IS)、硬脂酸-d3(SA-d3)、二十碳三烯酸-d6(DGLA-d6)、二十二碳六烯酸-d5(DHA-d5)和二十碳五烯酸-d5(EPA-d5)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中脂肪酸时的重现性、准确度均较好。

在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。

进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。

更进一步地，进样体积为0.5～5μL，优选为1μL。

在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中18种脂肪酸时，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈/异丙醇，5:1(v/v)；

色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；

采用梯度洗脱的方式，见表4；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。

表4 流动相梯度洗脱参数

时间	流速(mL/min)	％A	％B	Curve
					0.0	0.3	25	75	-
2.5	0.3	25	75	6
					4.5	0.3	3	98	1
6.5	0.3	25	75	1

(2)质谱条件：

在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了18种脂肪酸及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表5。

表5 脂肪酸质谱参数

化合物	母离子(m/z)	子离子(m/z)	锥孔电压(V)	碰撞电压(V)
					LRA	199.2	199.2	40	15
LRA-d3	202.2	202.2	40	10
					MOA	225.2	225.2	40	10
MA	227.2	227.2	40	15
					POA	253.2	253.2	40	18
PA	255.2	255.2	40	15
					PA-d3	258.2	258.2	40	20
γLA	277.3	277.3	50	10
					αLA	277.3	277.3	50	22
LA	279.2	279.2	40	25
					OA	281.2	281.2	40	25
OA-13C18	299.3	299.3	40	10
					SA	283.3	283.3	40	22
SA-d3	286.3	286.3	40	15
					EPA	301.3	257.3	28	14
EPA-d5	306.2	306.2	40	10
					ARA	303.3	205.3	42	14
DGLA	305.3	305.3	56	12
					DGLA-d6	311.3	311.3	40	10
11-EA	309.3	309.3	40	10
					DHA	327.3	283.3	10	12
DHA-d5	332.3	288.3	2	12
					DPA	329.3	285.3	30	14
OBA	329.3	285.3	30	14
					DTA	331.4	287.3	60	16

在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为乙腈。

在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，涡旋后加入430μL乙腈，振荡4～10min后，12000～15000r/min，4～15℃离心4～10min，取60μL上清液。

在一种更优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入430μL乙腈，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，4℃离心5min；取60μL上清液装入含塑料内衬管的进样瓶中待检测，进样量1μL。

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一、实验材料与仪器

试剂盒学研究实验的样本来自于武汉亚洲心脏病医院2019年4月份门诊收集的血清样本。

1、仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。

2、试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；MS级异丙醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)色谱柱型号ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)(美国Waters公司)。

3、标准品：月桂酸、十四碳一烯酸、十六碳一烯酸、十八碳三烯酸、十八碳三烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳四烯酸、月桂酸-d3、棕榈酸-d3、二十碳五烯酸-d5和二十二碳六烯酸-d5购自TRC公司；肉豆蔻酸、棕榈酸、十八碳二烯酸、十八碳一烯酸、二十二碳五烯酸-ω3、十八碳一烯酸-13C18和硬脂酸-d3购自Sigma公司；二十碳一烯酸和二十碳三烯酸-d6购自上海甄准；二十二碳五烯酸-ω6购自美国佳途。

4、质控品：含有18种脂肪酸的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。

试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为标准液和质控品；右边分别放置50mL蛋白沉淀剂。

二、液质条件

1、色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈/异丙醇，5:1(v/v)。色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表5。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。

2、质谱条件：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了18种脂肪酸及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表6。

三、实验过程

1、标准品配制：

准确称量3-5mg各待测标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中标准品母液浓度，再将各使用浓度用纯甲醇配制成混合标准溶液(详见表2)，混合均匀备用。

将上述混合标准溶液以空白血清基质(5％BSA)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：

取10μL混合标准溶液加入至190μL 5％BSA中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积5％BSA稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用3倍体积5％BSA稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积5％BSA稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积5％BSA稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积5％BSA稀释得第七高值浓度点。

(2)混合内标工作液配制

准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中同位素内标母液浓度，再将各使用浓度用纯甲醇配制成同位素混合内标SI溶液(详见表3)，最后取100μL SI溶液，加入900μL纯甲醇，混合均匀得混合内标工作液。

(3)质控品配制：

取上述混合标准溶液以空白血清基质(5％BSA)配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。

(4)样品处理

1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入430μL乙腈，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，4℃离心5min；取60μL上清液装入含塑料内插管的进样瓶中待检测，进样量1μL。

2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入430μL乙腈，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，14℃离心5min；取60μL上清液装入含塑料内插管的进样瓶中待检测，进样量1μL。

3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。

分析试剂盒中各组分见表6。

表6 脂肪酸分析试剂盒组分(100人份)

四、方法验证

本发明的检测方法中，脂肪酸的标准品与血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为脂肪酸标准品的选择离子流色谱图；图2为血清样本中脂肪酸的选择离子流色谱图。

1.标准曲线：

采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中脂肪酸待测物的浓度。9种脂肪酸在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.997以上，详见表7。

表7 18种脂肪酸的保留时间及线性范围

2.最低定量限

最低定量限(LLOQ)作为标曲线性范围的最低点，也反映方法的灵敏度。脂肪酸在人体含量低，对方法的灵敏度和特异性要求较高，对方法进行优化和考察，目前最低定量限(LLOQ)基本满足18种脂肪酸同时检测的灵敏度要求，LLOQ的浓度具体见表8。

表8 方法定量下限数据表

3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。随机选取一例人血清样品，其中1个不加标准品，其它2个分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，计算回收率结果，见表9。结果显示，血清中18种脂肪酸的加标回收率结果在86.49％-112.78％之间，5次重复试验的RSD在0.58％-9.41％范围均满足要求。

表9 血清中脂肪酸的加标回收率结果(单位μM)

4.精密度试验：取正常人血清样品一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定脂肪酸的浓度，连续三日统计每天的批内精密度，计算批内精密度为0.98-14.88％；三日内分3批处理，计算批间精密度为2.53-16.13％，计算批间精密度结果见表10。

表10 批内、批间精密度试验结果(单位μM)

由以上实验结果可知，采用本发明的试剂盒可以通过UPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的18种脂肪酸，同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，特异性强。与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。

考察了18种脂肪酸在血清中加标回收率，均在85％-115％，符合要求。

方法的重现性结果表明，血清中的18种脂肪酸的日内精密度，日间精密度，方法的重现性良好。

本方法较其他LC-MS/MS方法灵敏度更高，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，检测种类较多，6.5分钟之内可同时检测18种脂肪酸，可用于临床上血清脂肪酸的诊断及健康评估。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。