阅读说明：本技术 杨梅素在制备治疗血吸虫病药物中的应用 (Application of myricetin in preparation of medicine for treating schistosomiasis ) 是由 吕志跃 黄萍 成韶芸 胡玥 周旻昱 周洪利 马玉斌 于 2020-02-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了杨梅素在制备治疗血吸虫病药物中的应用。本发明通过体外观察杨梅素的抗日本血吸虫作用,以及建立日本血吸虫感染小鼠模型进行体内实验,发现杨梅素无论在体内外均具有良好的血吸虫杀虫作用,以及对日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化的改善作用。并且,杨梅素的杀虫作用与阳性药物吡喹酮效果相当,可代替其在日本血吸虫病上的应用,为避免临床耐药提供可能,具有较大的应用前景。(The invention discloses an application of myricetin in preparing a medicament for treating schistosomiasis. The invention discovers that the myricetin has good schistosome disinsection effect no matter in vivo or in vitro and improves the hepatic fibrosis of the mouse infected by the schistosoma japonicum through in vitro observation of the schistosoma japonicum anti-schistosoma japonicum effect of the myricetin and establishment of a mouse model infected by the schistosoma japonicum for in vivo experiments. In addition, the insecticidal effect of myricetin is equivalent to the positive drug praziquantel, and the myricetin can replace the application of myricetin in schistosomiasis japonica, provides possibility for avoiding clinical drug resistance, and has a wide application prospect.)

杨梅素在制备治疗血吸虫病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及日本血吸虫防治技术领域，更具体地， 涉及杨梅素在制备治疗血吸虫病中的新用途。

背景技术

血吸虫病作为一种被忽视的热带病在全球78个国家和地区流行，7.79亿人 受到威胁，保守估计约2.30亿人被感染，1.2亿人有症状，这导致仅在撒哈拉以 南的非洲每年就有将近30万人死于血吸虫病。血吸虫病是由血吸虫属的寄生虫 引起的寄生虫病，与人类相关的血吸虫致病虫种主要有六种，其中曼氏血吸虫， 埃及血吸虫和日本血吸虫最为流行。血吸虫在终宿主人体内的平均寿命在3～10 年，在某些情况下寄居时间甚至可以长达40年。尽管血吸虫不能在终宿主体内 增殖，但其能够产生大量的虫卵沉积在肝脏或者其它器官中，成熟的雌虫每天会 成百数千的产卵，长期的寄生以及大量的产卵引起感染和疾病的传播。

在缺乏有效疫苗的情况下，化学药物治疗是当前血吸虫病防治的重要手段。 目前用于临床的首选药物是吡喹酮，其对感染人类的所有血吸虫种类均有效，并 且毒副作用较低。但是，吡喹酮的应用也存在许多局限性，因其仅对刚钻入皮肤 的早期童虫(3～6h)和成虫有效，而对童虫的作用很弱，无预防作用，受治者 于治疗后的重复感染，也是血防工作中的一大难题。同时，由于吡喹酮在流行区 的长期大规模反复使用，容易造成血吸虫耐药性，已有英国学者在实验室采用亚 剂量吡喹酮治疗感染小鼠，诱导出曼氏血吸虫吡喹酮抗性株，因此寻找一种可替 代吡喹酮的有效药物迫在眉睫。

杨梅素，分子式C₁₅H₁₀O₈，是一种广泛存在于许多天然植物，水果和蔬菜中 的天然黄酮醇类化合物，其具有广泛的药理学活性，包括抗氧化，抗肿瘤，抗炎， 抗微生物，抗过敏，保护心血管和神经元等作用，且毒副作用小，小鼠腹腔注射 1000mg/kg的杨梅素没有发现任何毒性作用或死亡。另外，有研究表明，二氢杨 梅素能够减轻CCl₄诱导的小鼠肝脏纤维化病变(邝满元,罗明英,贾蕾,et al.二 氢杨梅素对肝纤维化大鼠脂质过氧化损伤的保护作用[J].中国医药导报,2009, 6(18):26-28.)；二氢杨梅素对血吸虫病肝纤维化有明显治疗作用(方会龙,王俊 杰,陈美姿,et al.二氢杨梅素治疗血吸虫病肝纤维化的实验研究[J].中国临床药 理学与治疗学,2010,15(4):381-384.)。目前仅发现二氢杨梅素可针对血吸虫感染 后的引起的血吸虫病肝纤维化的器官病理损伤具有治疗作用，而关于杨梅素在治 疗血吸虫病中的作用以及在血吸虫病引起的肝纤维化中的作用，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供杨梅素在制 备治疗血吸虫病药物中的新用途。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明首先通过体外观察杨梅素的抗日本血吸虫作用，发现杨梅素具有良好 的体外抗日本血吸虫作用，进一步建立日本血吸虫感染小鼠模型进行体内实验， 发现杨梅素无论在体内外均具有良好的血吸虫杀虫作用，而且杨梅素均能够有效 的抑制日本血吸虫的产卵量，并且这种抑制效果在与阳性药物吡喹酮之间并没有 显著的差异，说明杨梅素与吡喹酮一样，均能够有效减少肝脏虫卵沉积，表明杨 梅素可以从源头上减少血吸虫病原虫体的感染，从而起到治疗血吸虫病的作用。 同时发现，杨梅素对日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化的改善作用。杨梅素的杀虫 作用与阳性药物吡喹酮效果相当，可代替其在日本血吸虫病上的应用，为避免临 床耐药提供可能，具有较大的应用前景。

因此，下列关于杨梅素的应用均在本发明保护范围内：

杨梅素在制备治疗血吸虫病药物中的应用。

杨梅素在制备抑制血吸虫药物中的应用。

杨梅素在制备抑制血吸虫产卵的药物中的应用

杨梅素在制备降低血吸虫感染宿主体内虫卵和肝脏虫卵负荷量的药物中的 应用。

杨梅素在制备改善由血吸虫引起的肝脏病理损伤中的应用。

优选地，所述肝脏病理损伤为肝脏纤维化。

优选地，所述血吸虫为日本血吸虫。

本发明还提供一种用于治疗血吸虫病的药物，所述药物中含有杨梅素。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了杨梅素在在制备治疗血吸虫病药物中的应用。本发明研究发现， 杨梅素能够有良好的抗日本血吸虫作用，同时体内实验结果证实杨梅素明显降低 日本血吸虫感染小鼠体内虫卵和肝脏虫卵负荷量，显著改善小鼠的肝脏纤维化病 变；表明杨梅素不仅可以在前期用于日本血吸虫病的治疗，同时在后期日本血吸 虫病发病引起的肝脏病理损伤中也具有治疗改善作用。而且，杨梅素效果与阳性 药物吡喹酮效果相当，可代替吡喹酮在该类疾病中的应用，为避免临床耐药提供 可能。

附图说明

图1为杨梅素的化学结构式和其对日本血吸虫的影响；图1A为杨梅素化合 物结构，1B为不同浓度杨梅素作用后，日本血吸虫的生存曲线图。

图2为杨梅素作用后，日本血吸虫的扫描电镜图(A，雄虫；B，雌虫；Oral sucker，口吸盘；ventral sucker，腹吸盘；tegument，体被；gynecophoral canal， 抱雌沟)。

图3为杨梅素作用后，日本血吸虫感染小鼠肝脏H&E染色图。

图4为杨梅素作用后，日本血吸虫感染小鼠肝脏Masson染色图。

图5为杨梅素作用后，日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化相关因子的表达。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1杨梅素的体外杀虫作用检测

药物制备：将杨梅素用DMSO配置成终浓度10μM。

日本血吸虫感染新西兰兔模型构建：

在室温25±1℃的环境下，将日本血吸虫阳性钉螺置于12孔板中，加入去氯 水至2/3处，置于白炽灯下照射2h逸出尾蚴备用，剃除动物腹部皮毛，用去氯 水润湿皮肤，将载有计数好的的尾蚴盖玻片贴于去毛皮肤上，20min后移去玻片。 新西兰兔感染1000～1200条尾蚴/只。

新西兰兔于感染后第8周，经心脏取血后，空气栓塞法处死，解剖后收集定 居在肠系膜下静脉及肝门静脉的日本血吸虫成虫，虫体用生理盐水洗涤后转移至 24孔板中，每孔3对成虫/1ml完全培养基(包含100U/ml青霉素，100μg/ml 链霉素和10％热灭活血清的RPMI1640培养基)，于37℃，5％CO₂恒温箱中稳 定4h后，加入不同浓度的杨梅素(300～1000μM)，同时以100μM吡喹酮和1％ DMSO分别作为阳性对照和阴性对照，在孵育24，48和72h时，于倒置显微镜 下观察虫体生存状态；结果见图1。

图1结果显示体外培养96h时，阴性对照组仍存活80％；经阳性对照药物 吡喹酮或杨梅素(1000μM)作用8h时，虫体全部死亡。杨梅素作用日本血吸 虫24h的IC₅₀为600μM，其对成虫的体外杀伤作用呈时间和剂量依赖性。收集 半数致死剂量浓度的杨梅素作用24h的日本血吸虫成虫，通过扫描电镜和透射 电镜观察虫体的损伤情况；结果见图2。

图2结果显示正常虫体口吸盘缘规则，雄虫的皮层排列着海绵状的褶嵴和凹 陷，虫体皮层分布着单纤毛球形感觉乳突；正常雌虫体壁呈较规则的条索状，其 上布满凹陷，排列着感觉乳突。经杨梅素作用后，雄虫口腹吸盘向内凹陷，边缘 肿胀，表面呈不规则收缩，盘状***变形，皮层表面的皱褶排列混乱，感觉乳突 上的纤毛丢失，感觉乳突塌陷或消失；雌虫口腹吸盘边缘出现坏死溃破，伴有块 状物粘附，虫体中段和尾部一些区域皮层褶嵴融合成小片状，乳突减少，表明杨 梅素能够破坏日本血吸虫体壁完整性，杨梅素具有良好的抗日本血吸虫成虫作用。

实施例2杨梅素有效减少日本血吸虫感染小鼠成虫数量以及改善肝脏纤维化病变

1、日本血吸虫感染小鼠模型建立

(1)将Balb/c小鼠随机分成四组，分别为正常对照组(ctrl)，感染组(infected)，吡喹酮治疗组(pzq-treated)和杨梅素治疗组(me-treated)，每组8只。

(2)除了正常对照组外，其余小鼠按照前面所述方法感染30±2条日本血吸 虫尾蚴。

(3)在感染后36～42天，吡喹酮治疗组和杨梅素治疗组组每天分别给小鼠 灌胃吡喹酮500mg/kg，杨梅素250mg/kg(由0.9％生理盐水配制而成)，其余两 组灌胃相同体积的生理盐水。

2、日本血吸虫感染第7周，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠后进行眼眶取血， 心脏灌注收集肝门静脉和肠系膜静脉的成虫，迅速收集肝组织，称重之后根据不 同实验需求保存组织。将收集的全部虫体置于生理盐水的60mm培养皿中，体 视镜下计数虫体总数及雌，雄虫数目。剪取各组小鼠的部分肝脏中央叶，称重后 置于EP管中剪碎，加入4％氢氧化钾溶液，于37℃恒温摇床中振摇过夜至肝 脏组织完全消化，1500g离心5min后去除上层液体，将下层沉淀用生理盐水定 容至1ml。取10μl重悬液压片并于显微镜下计数，重复5～7次。计算每克肝 组织中所含虫卵数量；结果见表1：

表1施用杨梅素作用后，日本血吸虫感染小鼠的成虫以及肝脏虫卵负荷量

表1结果显示杨梅素能显著降低小鼠成虫负荷量，而吡喹酮处理组几乎观察 不到成虫，这说明吡喹酮的体内杀虫效果比杨梅素更有效。有趣的是，各组小鼠 肝脏虫卵负荷量的结果显示吡喹酮和杨梅素均能够有效的抑制日本血吸虫的产 卵量，并且这种抑制效果在两种药物之间并没有显著的差异，说明杨梅素与吡喹 酮一样，均能够有效减少肝脏虫卵沉积。

3、将肝脏组织进行常规石蜡切片，通过H&E和Masson染色观察小鼠肝脏 组织病理损伤情况；结果见图3，图4。

图3为杨梅素作用后，各组小鼠肝脏的H&E结果图，从图中可以看出正常 组小鼠肝脏镜下小叶结构完整，可见中央静脉及放射性肝细胞索，汇管区及其周 围未见小胆管及纤维组织增生。感染后肝脏可见虫卵沉积，虫卵周围有大量的炎 性细胞浸润，并伴有胶原沉积，形成典型的虫卵肉芽肿，呈弥漫性分布，杨梅素 或吡喹酮治疗组的肉芽肿面积较感染组显著降低。

图4为杨梅素作用后，各组小鼠肝脏的Masson结果图，感染组小鼠肝脏有 大量新鲜胶原纤维沉积于肉芽肿周围，弥漫分布于肝组织中，杨梅素或吡喹酮治 疗组肝脏纤维化明显好转，说明杨梅素能够有效改善由日本血吸虫引起的肝脏病 理损伤。

4、各组小鼠的肝脏组织分别用Lysis buffer(Thermo Fisher)和TRIzol(ThermoFisher)试剂提取组织总蛋白和总RNA，Western blot和RT-qPCR检测α-SMA、 Collagen I和Collagen IV等纤维化相关分子的表达。

所用引物如下：

α-SMA：

F：5’-CACAGCCCTGGTGTGCGACAAT-3’；

R：5’-TTGCTCTGGGCTTCATCCCCCA-3’；

Collagen I：

F：GGAGACAATGGAGACCGAAA-3’；

R：5’-CGACCAATTAGGGCTTGTGT-3’；

Collagen IV：

F：5’-ATGCCCTTTCTCTTCTGCAA-3’；

R：5’-GAAGGAATAGCCGATCCACA-3’；

检测结果见图5，图5为杨梅素对日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化相关因子 表达的影响图，从图可以看出，杨梅素能有效逆转由日本血吸虫感染引其的 α-SMA、Collagen I和Collagen IV的表达(5A，RT-qPCR结果；5B，5C，Western blot结果)。

检测结果中，定量结果以均数±标准差(SD)表示。所有数据均采用SPSS 19.0(SPSS Inc,New York,USA)进行统计学分析。组间差异采用单因素分析方差分析 (ANOVA)。所有柱状图均由GraphPad Prism 7.0绘制(GraphPad Software,San Diego,USA)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定 本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰 变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。