阅读说明：本技术 一种联萘吡啶盐抗菌材料和制备方法及应用 (Dinaphthalene pyridinium antibacterial material and preparation method and application thereof ) 是由 王皓萍 冯丽恒 王美营 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及小分子抗菌剂技术领域,具体涉及一种联萘吡啶盐抗菌材料和制备方法及应用。S-1,1’-联-2-萘酚与1,4-二(溴甲基)苯反应制备2,2’-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1’-联萘,2,2’-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1’-联萘在DMF中与吡啶反应制备1,1’-((((([[[1,1’-联萘]-2,2’-二基双(氧基))双(亚甲基))双(4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(吡啶-1)溴化物。本发明联萘吡啶盐抗菌材料能够有效杀伤革兰氏阴性菌。本发明通过涂布平板法对革兰氏阴性菌的杀伤效果进行确定,在抗菌浓度下对细胞损伤较低,且细胞毒性低。(The invention relates to the technical field of micromolecular antibacterial agents, and particularly relates to a naphthyridine salt antibacterial material, and a preparation method and application thereof. S-1,1 '-bi-2-naphthol reacts with 1, 4-di (bromomethyl) benzene to prepare 2,2' -bis ((4- (bromomethyl) benzyl) oxy) -1,1 '-binaphthyl, and 2,2' -bis ((4- (bromomethyl) benzyl) oxy) -1,1 '-binaphthyl reacts with pyridine in DMF to prepare 1,1' - (((([ [ [1,1 '-binaphthyl ] -2,2' -diylbis (oxy)) bis (4, 1-phenylene)) bis (methylene)) bis (pyridine-1) bromide, the binaphthylpyridinium antibacterial material of the present invention can effectively kill gram-negative bacteria, the present invention is determined by the killing effect of a plate coating method on gram-negative bacteria, has low damage to cells under the antibacterial concentration and low cytotoxicity.)

一种联萘吡啶盐抗菌材料和制备方法及应用

技术领域

本发明涉及小分子抗菌剂技术领域，具体涉及一种联萘吡啶盐抗菌材料和制备方法及应用。

背景技术

细菌在自然界广泛存在，与人类活动密切相关。有些细菌是有益菌，如乳酸菌、双歧杆菌等。但有些细菌往往会引起一些疾病，如鼠伤寒沙门氏菌可以引起肠胃不适甚至败血症、铜绿假单胞菌会引起伤口化脓、肺炎克雷伯菌是导致肺炎的元凶。自从青霉素被发现以来，许多抗生素接连被报道，在一段时间内起到了很好的杀菌效果。然而由于抗生素的广泛使用和滥用，一些抗生素对细菌已经不起作用，迫切需要新的有效的抗菌剂来解决这一现状。

从细菌的构造来看，其有细胞壁和细胞膜，细胞壁和细胞膜内有很多蛋白质，这些蛋白质的等电点一般在3～5之间，外界pH一般为偏中性，均高于等电点，因而蛋白质带负电，所以在一般外界条件下细菌带负电。具有正电荷的化合物如带有季铵盐、季鏻盐、胍盐以及吡啶盐等基团的化合物已经证明能够与细菌发生静电吸引，进而干扰细菌的正常生理活动从而杀死细菌。由于许多抗菌剂在使用过程中往往会对正常细胞造成损伤，因此开发高效低毒的抗菌剂具有重要意义。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种联萘吡啶盐抗菌材料和制备方法及应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种联萘吡啶盐抗菌材料，其结构式为：

一种联萘吡啶盐抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，S-1,1'-联-2-萘酚与丙酮，加热并剧烈搅拌，得到均一的混合溶液，然后在惰性气体保护下，在混合溶液中加入1,4-二(溴甲基)苯和碳酸钾，加热回流搅拌，反应结束后，趁热过滤固体，用二氯甲烷和水进行萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，真空旋除溶剂，得到的粗产物用二氯甲烷/石油醚＝1/3(v/v)作为洗脱剂进行柱层析，得到2,2'-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1'-联萘；

步骤2，在氮气保护下，将2,2'-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1'-联萘和吡啶加入DMF中，在搅拌条件下进行加热反应，然后冷却至室温，再加入到丙酮溶液中，待白色固体析出后过滤出白色固体，然后依次用DMF、丙酮和***洗涤，真空干燥后得到1,1'-((((([[[1,1'-联萘]-2,2'-二基双(氧基))双(亚甲基))双(4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(吡啶-1)溴化物，即为联萘吡啶盐抗菌材料。

进一步，所述步骤1中S-1,1'-联-2-萘酚与丙酮的质量比为1:18～1:22；

所述步骤1中1,4-二(溴甲基)苯与碳酸钾的摩尔比为3.5:1～5:1；

所述步骤1中混合溶液与1,4-二(溴甲基)苯和碳酸钾的体积比为6:1～8:1。

进一步，所述步骤1中加热回流搅拌的加热时间为6h；

所述步骤1中加热并剧烈搅拌的加热温度为65℃，搅拌时间为4h～8h；

所述步骤2中加热反应的加热温度为70℃～80℃，反应时间为48h。

进一步，所述步骤2中吡啶和2,2'-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1'-联萘与DMF的摩尔比为2:1:86.5。

进一步，所述DMF、丙酮和***洗涤的用量为：150mL～200mL；

所述真空干燥的温度为25℃，时间为48h。

一种联萘吡啶盐抗菌材料的应用，用于杀伤革兰氏阴性菌。

进一步，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌以及铜绿假单胞菌。

一种联萘吡啶盐抗菌材料的应用方法，通过涂布平板法对革兰氏阴性菌的杀伤效果进行确定，在抗菌浓度下对细胞损伤较低，且细胞毒性低。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明公开了一种含有联萘骨架和吡啶盐功能团的抗菌材料的制备方法及应用。本发明得到的联萘吡啶盐抗菌材料是一种低毒高效的抗菌材料，该材料对多种革兰氏阴性菌均展现出良好的抗菌性能，并且具有较低的细胞毒性。该材料能够作为抗菌剂应用于治疗细菌感染。所采用的制备方法简单，条件温和。

附图说明

图1本发明抗菌材料在二甲基亚砜中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；

图2本发明抗菌材料对五种革兰氏阴性菌的杀菌测试结果；

图3本发明抗菌材料对人***细胞的毒性测试结果；

图4本发明抗菌材料对大肠杆菌杀伤的扫描电镜图。

具体实施方式

实施例1

步骤1，在装有磁力搅拌器的三口瓶中加入0.57g(2.00mmol)S-1,1'-联-2-萘酚、15mL丙酮，在65℃下加热进行剧烈搅拌，得到均一混合溶液，然后在氮气保护下，加入2.11g(8.00mmol)1,4-二(溴甲基)苯，和0.30g(2.20mmol)碳酸钾，加热回流搅拌6h，反应结束后，趁热过滤固体，用二氯甲烷和水进行萃取。收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，真空旋除溶剂，得到的粗产物用二氯甲烷/石油醚＝1/3(v/v)作为洗脱剂进行柱层析，得到0.45g 2,2'-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1'-联萘，产率：34.5％。

步骤2，在氮气保护下，将1.96g(3.00mmol)2,2'-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1'-联萘和0.48mL吡啶(6.00mmol)加入盛有20mL DMF的100mL三口圆底烧瓶中，70℃下搅拌反应48h，反应结束后，冷却至室温，搅拌下将反应液倒入200mL丙酮中，有白色固体析出，过滤白色固体，依次用DMF、丙酮以及***洗涤后，真空干燥后得到0.92g 1,1'-((((([[[1,1'-联萘]-2,2'-二基双(氧基))双(亚甲基))双(4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(吡啶-1)溴化物，产率37.8％。

¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ9.12(d,2H),8.60(t,1H),8.14(t,2H),8.04(d,1H),7.95(d,1H),7.61(d,1H),7.35(t,1H),7.30(d,2H),7.24～7.25(m,1H),7.02(d,2H),6.97(d,1H),5.75(s,2H),5.15(m,2H)；HRMS-ESI for C₄₆H₃₈N₂O₂ ²⁺(m/z)325.1461。

实施例2

1)2,2'-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1'-联萘的制备同实施例1；

2)在氮气保护下，将0.33g(0.50mmol)2,2'-双((4-(溴甲基)苄基)氧基)-1,1'-联萘和0.12mL吡啶(1.5mmol)加入盛有10mL DMF的25mL三口圆底烧瓶中，60℃下搅拌反应72h，反应结束后，冷却至室温，搅拌下降反应倒入200mL丙酮中，有白色固体析出，过滤白色固体，依次用DMF、***洗涤后，真空干燥后得到0.13g 1,1'-((((([[[1,1'-联萘]-2,2'-二基双(氧基))双(亚甲基))双(4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(吡啶-1)溴化物，产率32.1％。¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ9.12(d,2H),8.60(t,1H),8.14(t,2H),8.04(d,1H),7.95(d,1H),7.61(d,1H),7.35(t,1H),7.30(d,2H),7.24～7.25(m,1H),7.02(d,2H),6.97(d,1H),5.75(s,2H),5.15(m,2H)；HRMS-ESI for C₄₆H₃₈N₂O₂ ²⁺(m/z)325.1461。

实施例3

抗菌材料的荧光发射光谱和紫外吸收光谱测量：

将抗菌材料溶于DMSO中，配制成浓度为1.0×10^-5mol/L的溶液。准确移取2.0mL加入石英比色皿杯中，以纯DMSO溶液为参比，在HITACHI UH5300紫外吸收仪上测定，吸收峰位于265nm和335nm处。同样准确移取2mL浓度为1.0×10^-5mol/L的DMSO溶液加入石英比色皿中，然后在HITACHI F-4600荧光仪上测定，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。激发波长为346nm，最大发射波长为422nm，所有测试在室温和外界大气压下进行。测试归一化结果见图1。

实施例4

抗菌材料的细胞毒性测试：

以人***细胞HeLa细胞为研究对象，用MTT实验对抗菌材料的细胞毒性进行测试。将培养至对数生长期的HeLa细胞以10⁷个/mL均匀铺在96孔板中，培养24h后，弃去培养基，加入含有0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM抗菌材料的新培养基，继续培养12h，弃掉培养基，加入含有5mg/mL MTT的培养基培养4～6h后，移去培养基，用无菌1×PBS洗涤后，加入DMSO，在酶标仪上震荡2min后读取数据。测试结果见图3。从图3可以看出，在20μM时，细胞的存活率仍在80％左右，表明该抗菌材料对细胞损伤较低，具有较低的细胞毒性。

实施例5

抗菌材料对细菌的杀菌性能测试：

(一)抗菌材料对大肠杆菌(Top 10)的杀菌性能测试：

超净台及器具消毒后，移取10mL培养基于50mL离心管中，加入10μL 50mg/mL的氨苄西林钠水溶液和20μL大肠杆菌菌种，37℃下180rpm震荡培养6～8h后，吸取2mL菌液进行离心(7100rpm,2min)，对大肠杆菌进行沉淀，将沉淀的大肠杆菌用1×PBS洗涤后再次离心沉淀，重复两次后，弃去上清液，将菌液重新悬浮于1×PBS中，调OD₆₀₀为1.0。

在1.5mL离心管中，加入100μL的菌液(OD₆₀₀＝1.0)和一定量抗菌材料(最终浓度分别为5μM,10μM,15μM,20μM)，用无菌1×PBS将体积补充到500μL，并在暗处37℃下孵育20min，稀释4000倍后吸取100μL菌液均匀涂布于90mm LB固体培养基(含50mg/mL的氨苄西林钠)，37℃培养18h～20h计数菌落形成单位。

(二)抗菌材料对阴沟肠杆菌(CICC 10017)的抗菌性能测试：

超净台及器具消毒后，移取10mL培养基于50mL离心管中20μL阴沟肠杆菌菌种，37℃下180rpm震荡培养10h左右，吸取2mL菌液进行离心(7100rpm,2min)，对阴沟肠杆菌进行沉淀，将沉淀的阴沟肠杆菌用1×PBS洗涤后再次离心沉淀，重复两次后，弃去上清液，将菌液重新悬浮于1×PBS中，调OD₆₀₀为1.0。

在1.5mL离心管中，加入100μL的菌液(OD₆₀₀＝1.0)和一定量抗菌材料(最终浓度分别为5μM,10μM,15μM,20μM)，用无菌1×PBS将体积补充到500μL，并在暗处37℃下孵育20min，稀释4000倍后吸取100μL菌液均匀涂布于90mm固体培养基，37℃培养18～20h后计数菌落形成单位。

(三)抗菌材料对鼠伤寒沙门氏菌(CICC 21484)、铜绿假单胞菌(CICC21100)和肺炎克雷伯菌(CICC 10781)的抗菌性能测试步骤同(二)。

细菌存活率＝(加药组的细菌菌落数/对照组的细菌菌落数)×100％

抗菌材料对细菌的杀菌性能测试结果(见图2)：在抗菌材料浓度为10μM时，对肺炎克雷伯菌的杀伤率能达到99.5％以上；在20μM时，对大肠杆菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及铜绿假单胞菌的杀菌率能达到96％以上，这些数据表明该抗菌材料具有优异的抗菌性能，对多种革兰氏阴性菌均展现出良好的杀伤能力。

实施例6

抗菌材料对大肠杆菌杀伤的扫描电子显微镜(SEM)实验：

将大肠杆菌按照实施例5中的抗菌实验的步骤与药物作用后，离心(7100rmp，5min)去除未作用的药物，沉淀的大肠杆菌用100μL无菌1×PBS重悬，取10μL滴在干净的硅片上，在超净台中风干，然后加入含有1％戊二醛的1×PBS溶液。4℃过夜固定后，用超纯水洗去多余的戊二醛，依次用40％、70％、90％和100％的乙醇对样品进行梯度脱水，6min/次。样品完全干燥后，真空冷冻干燥1～2h后进行实验。

从图4扫描电镜图上可以观察到，对照组的大肠杆菌保持良好的细胞形态，而加药组的大部分大肠杆菌表面已经出现坍塌变形，表明抗菌材料对其具有良好的杀伤效果。

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。