阅读说明：本技术 与轮状病毒产量增加有关的方法和组合物 (Methods and compositions relating to increased rotavirus production ) 是由 R·A·特里普 S·M·汤普金斯 卡尔·柯克伍德 于 2018-11-02 设计创作，主要内容包括：公开了用于增加轮状病毒产量的组合物和方法。(Compositions and methods for increasing rotavirus production are disclosed.)

与轮状病毒产量增加有关的方法和组合物

本申请要求2017年11月2日提交的美国临时申请号62/581,020的权益，该临时申请通过引用其全部内容并入本文。

背景技术

疫苗是抵抗传染病最重要的防御手段之一。这些疫苗在细胞培养中产生的数量更多。为了实现这一点，将特征明显的细胞系(例如，Vero细胞)(例如)在确定成分培养基配方中生长，然后用活的或减毒的活病毒感染。随后，收集并处理含有原始病毒颗粒后代的上清液，以产生高免疫原性剂量的疫苗，然后将其分配到种群中。

当前，一系列复杂的因素(种群动态、生物生产、成本等)限制了在全球范围内提供足够的免疫覆盖率的能力。特别地，疫苗的生物生产可能是昂贵的，并且提供所需数量的疫苗所需的时间会显著影响社会的医疗福利。该问题与轮状病毒疫苗特别相关。因此，需要以大大降低的成本增加疫苗产量的新技术。

发明内容

公开了与增加细胞中的轮状病毒产量有关的方法和组合物。所公开的方法和组合物包括减少至少一种基因的表达，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51基因，其减少会增加轮状病毒的产量。

在一方面，本文公开了包含表达减少的至少一种基因的细胞，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。

在一方面，本文公开了增加一种或多种轮状病毒的轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染细胞；其中所述细胞包含表达减少的至少一种基因，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51基因。

附图说明

并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施例，并且与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。

图1显示了全基因组RNAi筛选的Z评分，其设计用于检测i)增强或ii)抑制MA104细胞中的轮状病毒复制的宿主基因调控事件。如通过ELISA判断的，76个基因抑制事件显著增强了轮状病毒复制(Z评分大于或等于3.0)。121个基因抑制事件显著降低RV3产量。

图2显示了对前20个基因靶标的抑制如何影响Vero细胞中轮状病毒产生。Y轴代表ELISA读数中的O.D.读数。X轴标识由RNAi靶向的基因。“NTC”＝非靶向对照。

图3显示了siRNA转染对细胞中靶基因水平的影响。Y轴代表测量的mRNA水平。X轴标识对照和靶基因信号。

图4显示了两种不同的CRISPR基因编辑方法。Sigma CRISPR系统共表达gRNA和Cas9，以及用于细胞分选的GFP标记蛋白。B)gRNA(cRNA：tracRNA)和Cas9质粒的GEDharmacon系统共转染。

图5A和5B显示WT/KO Vero细胞被96孔格式中的Rotarix(MOI 0.2)感染了3天(5A)或5天(5B)，然后将上清液转移至新鲜细胞(WT/KO)中16小时。用4％***固定细胞，然后使用抗RV兔多克隆血清对RV抗原染色。细胞(n>20,000)在Arrayscan VTI上成像。数据代表来自六个独立重复样品的±SEM。使用单因素方差分析比较荧光病灶的差异*p<0.01；****p<0.0001。

图6A和6B显示WT/KO Vero细胞被96孔格式中的Rotarix(MOI 0.1)感染了3天(6A)或5天(6B)，然后将上清液转移至新鲜细胞中16小时。使用抗-RV兔多克隆血清收集上清液用于RV抗原的ELISA。数据代表来自六个独立重复样品的±SEM。使用单因素方差分析比较吸光度的差异****p<0.0001。

图7A和7B显示WT/KO Vero细胞被96孔格式中的CDC9(MOI 0.1)感染了3天(7A)或5天(7B)，然后将上清液转移至新鲜细胞中16小时。用4％***固定细胞，然后使用抗RV兔多克隆血清对RV抗原染色。细胞(n>20,000)在Arrayscan VTI上成像。数据代表来自六个独立重复样品的±SEM。使用单因素方差分析比较荧光病灶的差异***p<0.01，****p<0.0001。

图8A和8B显示WT/KO Vero细胞被96孔格式中的CDC9(MOI 0.1)感染了3天(8A)或5天(8B)，然后将上清液转移至新鲜细胞中16小时。使用抗-RV兔多克隆血清收集上清液用于RV抗原的ELISA。数据代表来自六个独立重复样品的±SEM。使用单因素方差分析比较吸光度的差异****p<0.0001。

图9A和9B显示WT/KO Vero细胞被96孔格式中的116E(MOI 0.1)感染了3天(9A)或5天(9B)，然后将上清液转移至新鲜细胞中16小时。用4％***固定细胞，然后使用抗RV兔多克隆血清对RV抗原染色。细胞(n>20,000)在Arrayscan VTI上成像。数据代表来自六个独立重复样品的±SEM。使用单因素方差分析比较荧光病灶的差异**p<0.01，****p<0.0001。

图10A和10B显示WT/KO Vero细胞被96孔格式中的116E(MOI 0.1)感染了3天(10A)或5天(10B)，然后将上清液转移至新鲜细胞中16小时。使用抗-RV兔多克隆血清收集上清液用于RV抗原的ELISA。数据代表来自六个独立重复样品的±SEM。使用单因素方差分析比较吸光度的差异****p<0.0001

具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有规定，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有规定，否则它们不限于特定的试剂，因为它们当然会有所不同。另外应当了解，本文使用的术语只是为了描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。

A.定义

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”“一种”“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定不是这样。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两个或更多这样的载体的混合物等。

范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开了“小于或等于”值、“大于或等于”值以及时，也公开了如本领域技术人员适当理解的值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

在本说明书及随后的权利要求书中，将引用多个术语，将其定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。

词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的叙述并不意味着其他实施例没有用，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。

在本文的上下文中，术语“靶标”或“靶标基因”或“命中”是指任何基因，包括正向或负向(经调节时)的蛋白质编码基因和非编码RNA(例如，miRNA)改变病毒或生物分子产生的某些方面。靶基因包括内源宿主基因、病原体(例如，病毒)基因和转基因。

术语“调变(modulates)”或“调变(modulation)”是指基因的调控、表达或活性的改变。通常，本领域技术人员应理解，术语“调变”包括增加基因的表达或活性，减少基因的表达或活性以及改变基因的特异性或功能。调变基因的表达或活性可以通过多种方法来实现，包括改变以下一种或多种：1)基因拷贝数，2)基因的转录或转译，3)转录本的稳定性或寿命，4)mRNA或miRNA的拷贝数，5)非编码RNA或非编码RNA靶位点的可用性；6)蛋白质上转译后修饰的位置或程度；7)蛋白质的活性以及其他机制。调变可导致靶基因活性显著降低(例如，降低至少5％，至少10％，至少20％或更高)或增加靶基因活性(例如，至少10％，至少20％或更大的增加)。此外，本领域技术人员应理解，一种或多种基因的调变可随后导致多种基因(例如，miRNA)的调变。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本申请所涉及的技术现状。所公开的参考文献也单独并且具体地以引用方式并入本文，参考文献中包含的材料在参考文献所依据的句子中予以讨论。

B.增加轮状病毒产量的方法

轮状病毒疫苗用于保护人类健康并确保食品安全。不幸的是，当前的制造能力有限且成本高昂，从而使很大一部分人类和农业动物种群处于危险之中。为了解决这个问题，需要增加轮状病毒滴度以增强病毒疫苗产生的方法。因此，一方面，本文公开了增加一种或多种轮状病毒和/或病菌株的轮状病毒产量的方法。

在本文的上下文中，术语“疫苗”是指试剂，包括但不限于肽或修饰的肽、蛋白质或修饰的蛋白质、活病毒、减毒活病毒、灭活或杀死的病毒、病毒样颗粒(VLP)或其任何组合，其用于刺激动物或人类的免疫系统，以提供针对例如传染源的保护。疫苗经常通过在接受这种治疗的受试者(多个)中刺激抗体的产生、抗体样分子或细胞免疫应答来起作用。

术语“病毒产生”可以指活病毒或减毒病毒和/或VLP的产生。产生可以通过多种方法进行，包括1)在生物体(例如，卵)、培养细胞(例如，Vero细胞)或体外(例如，通过细胞裂解液)产生。

疫苗可以通过多种方式产生。在一个实例中，首先在合适的环境(例如，细胞或组织培养板或烧瓶)中将来自多种来源的细胞(包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬和鸟类)培养至所需密度。随后，将病毒种子原种(例如，轮状病毒)添加到它们感染细胞的培养物中。然后将感染的细胞转移至生物反应器(例如，一次性生物反应器)，在该反应器中病毒复制并在数量上扩增。在合适的时间段后，将细胞和细胞颗粒与新释放的病毒颗粒分离，并进行额外的步骤(例如，纯化、灭活、浓缩)以进一步制备用作疫苗的材料。

关于病毒的生长，宿主细胞对病毒复制、与病毒进入、基因组复制、避免宿主免疫系统等有关的功能做出了关键性贡献。

因此，并且在一方面，本文公开了增加本文公开的轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染细胞；其中被感染的细胞包含来自表1的表达减少的至少一种或多种基因，其表达抑制轮状病毒产生。换句话说，本文公开了增加轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染细胞；其中感染的细胞包含当被调变时(单独地或组合地)增强细胞或细胞系中轮状病毒或轮状病毒抗原的产生的基因(表I)。例如，本文公开的ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51的表达对轮状病毒产生造成负面影响。因此，本文公开了增加本文公开的轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染细胞；其中被感染的细胞包含表达减少的至少一种基因，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51基因。

如本文所公开的，所公开的方法可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75或全部76个所公开的基因(即，ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51)。例如，该细胞可包含表达减少的单独或与任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、或77个其他所选基因组合的NAT9。因此，例如，在一方面，本文公开了增加轮状病毒产量的方法，该方法包括用轮状病毒感染细胞；其中所述细胞包含减少表达的ZNF205；NEU2；NAT9；SVOPL；COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G；NDUFA9；RAD51AP1；COX20；MAPK6；WDR62；LRGUK；CDK6；KIAA1683；CRISP3；GRPR；DPH7；GEMIN8；KIAA1407；RFXAP；SMARRCA4；CCDC147；AACS；CDK9；C7ORF26；ZDHHC14；RNUT1；GAB1；EMC3；FAM96A；FAM36A；LOC55831；LOC136306；DEFB126；MGC955；EPHX2；SRGAP1；PPP5C；MET；SELM；TSPYL2；TSARG6；NDUFB2；PLAU；FLJ36888；ADORA2B；FLJ22875；HMMR；NRK、LRIT3；FLJ44691；GPR154；ZGPAT；DRD1；FLJ27505；EDG5；SNRNP40；HPRP8BP；GPA33；JDP2；FLJ20010；FOXJ1；SCT；CHD1L；SULT1C1；STN2；MRS2L；RAD51AP1；DPH7；CLPP；ZNF37；AP3B2；DEGS2；PIR；D2LIC；CNTF；PAM；MYH9；PRPF4；SLC4A11；LRRCC1；FZD9；GPR43；LTF；ARIH1；PIK3R3；PTGFRN；KIAA1764；C19ORF14；FLNA；FLJ32786；DKFZP434K046；C9ORF112；PIR51；NAT9和NEU2；NAT9和SVOPL；NAT9和COQ9；NAT9和NDUFA9；NAT9和RAD51AP1；NAT9和COX20；NAT9和MAPK6；NAT9和WDR62；NAT9和LRGUK；NAT9和CDK6；NAT9和KIAA1683；NAT9和CRISP3；NAT9和GRPR；NAT9和DPH7；NAT9和GEMIN8；NAT9和KIAA1407；NAT9和RFXAP；NAT9和SMARRCA4；NAT9和CCDC147；NAT9和AACS；NAT9和CDK9；NAT9和C7ORF26；NAT9和ZDHHC14；NAT9和RNUT1；NAT9和GAB1；NAT9和EMC3；NAT9和FAM96A；NAT9和FAM36A；NAT9和LOC55831；NAT9和LOC136306；NAT9和DEFB126；NAT9和MGC955；NAT9和EPHX2；NAT9和SRGAP1；NAT9和PPP5C；NAT9和MET；NAT9和SELM；NAT9和TSPYL2；NAT9和TSARG6；NAT9和NDUFB2；NAT9和PLAU；NAT9和FLJ36888；NAT9和ADORA2B；NAT9和FLJ22875；NAT9和HMMR；NAT9和NRK；NAT9和FLJ44691；NAT9和GPR154；NAT9和ZGPAT；NAT9和DRD1；NAT9和FLJ27505；NAT9和EDG5；NAT9和SNRNP40；NAT9和HPRP8BP；NAT9和GPA33；NAT9和JDP2；NAT9和FLJ20010；NAT9和FOXJ1；NAT9和SCT；NAT9和CHD1L；NAT9和SULT1C1；NAT9和STN2；NAT9和MRS2L；NAT9和RAD51AP1；NAT9和DPH7；NAT9和CLPP；NAT9和ZNF37；NAT9和AP3B2；NAT9和COQ9；NAT9和DEGS2；NAT9和PIR；NAT9和D2LIC；NAT9和CNTF；NAT9和PAM；NAT9和MYH9；NAT9和PRPF4；NAT9和SLC4A11；NAT9和LRRCC1；NAT9和FZD9；NAT9和GPR43；NAT9和LTF；NAT9和ARIH1；NAT9和PIK3R3；NAT9和PTGFRN；NAT9和KIAA1764；NAT9和C19ORF14；NAT9和FLNA；NAT9和FLJ32786；NAT9和DKFZP434K046；NAT9和C9ORF112；NAT9和PIR51；NEU2和SVOPL；NEU2和COQ9；NEU2和NDUFA9；NEU2和RAD51AP1；EU2和COX20；NEU2和MAPK6；NEU2和WDR62；NEU2和LRGUK；NEU2和CDK6；NEU2和KIAA1683；NEU2和CRISP3；NEU2和GRPR；NEU2和DPH7；NEU2和GEMIN8；NEU2和KIAA1407；NEU2和RFXAP；NEU2和SMARRCA4；NEU2和CCDC147SVOPL和COQ9；SVOPL和NDUFA9；SVOPL和RAD51AP1；SVOPL和COX20；SVOPL和MAPK6；SVOPL和WDR62；SVOPL和LRGUK；SVOPL和CDK6；SVOPL和KIAA1683；SVOPL和CRISP3；SVOPL和GRPR；SVOPL和DPH7；SVOPL和GEMIN8；SVOPL和KIAA1407；SVOPL和RFXAP；SVOPL和SMARRCA4；SVOPL和CCDC147；COQ9和NDUFA9；COQ9和RAD51AP1；COQ9和COX20；COQ9和MAPK6；COQ9和WDR62；COQ9和LRGUK；COQ9和CDK6；COQ9和KIAA1683；COQ9和CRISP3；COQ9和GRPR；COQ9和DPH7；COQ9和GEMIN8；COQ9和KIAA1407；COQ9和RFXAP；COQ9和SMARRCA4；COQ9和CCDC147；NDUFA9和RAD51AP1；NDUFA9和COX20；NDUFA9和MAPK6；NDUFA9和WDR62；NDUFA9和LRGUK；NDUFA9和CDK6；NDUFA9和KIAA1683；NDUFA9和CRISP3；NDUFA9和GRPR NDUFA9和DPH7；NDUFA9和GEMIN8；NDUFA9和KIAA1407；NDUFA9和RFXAP；NDUFA9和SMARRCA4；NDUFA9和CCDC147；RAD51AP1和COX20；RAD51AP1和MAPK6；RAD51AP1和WDR62；RAD51AP1和LRGUK；RAD51AP1和CDK6；RAD51AP1和KIAA1683；RAD51AP1和CRISP3；RAD51AP1和GRPR；RAD51AP1和DPH7；RAD51AP1和GEMIN8；RAD51AP1和KIAA1407；RAD51AP1和RFXAP；RAD51AP1和SMARRCA4；RAD51AP1和CCDC147；COX20和MAPK6；COX20和WDR62；COX20和LRGUK；COX20和CDK6；COX20和KIAA1683；COX20和CRISP3；COX20和GRPR；COX20和DPH7；COX20和GEMIN8；COX20和KIAA1407；COX20和RFXAP；COX20和SMARRCA4；COX20和CCDC147；MAPK6和WDR62；MAPK6和LRGUK；MAPK6和CDK6；MAPK6和KIAA1683 MAPK6和CRISP3；MAPK6和GRPR；MAPK6和DPH7；MAPK6和GEMIN8；MAPK6和KIAA1407；MAPK6和RFXAP；MAPK6和SMARRCA4；MAPK6和CCDC147；WDR62和LRGUK；WDR62和CDK6；WDR62和KIAA1683；WDR62和CRISP3；WDR62和GRPR；WDR62和DPH7；WDR62和GEMIN8；WDR62和KIAA1407；WDR62和RFXAP；WDR62和SMARRCA4；WDR62和CCDC147；LRGUK和CDK6；LRGUK和KIAA1683；LRGUK和CRISP3；LRGUK和GRPR；LRGUK和DPH7；LRGUK和GEMIN8；LRGUK和KIAA1407；LRGUK和RFXAP；LRGUK和SMARRCA4；LRGUK和CCDC147；CDK6和KIAA1683；CDK6和CRISP3；CDK6和GRPR；CDK6和DPH7；CDK6和GEMIN8；CDK6和KIAA1407；CDK6和RFXAP；CDK6和SMARRCA4；CDK6和CCDC147；KIAA1683和CRISP3；KIAA1683和GRPR；KIAA1683和DPH7；KIAA1683和GEMIN8；KIAA1683和KIAA1407；KIAA1683和RFXAP；KIAA1683和SMARRCA4；KIAA1683和CCDC147；CRISP3和GRPR；CRISP3和DPH7；CRISP3和GEMIN8；CRISP3和KIAA1407；CRISP3和RFXAP；CRISP3和SMARRCA4；CRISP3和CCDC147；GRPR和DPH7；GRPR和GEMIN8；GRPR和KIAA1407；GRPR和RFXAP；GRPR和SMARRCA4；GRPR和CCDC147；DPH7和GEMIN8；DPH7和KIAA1407；DPH7和RFXAP；DPH7和SMARRCA4；DPH7和CCDC147；GEMIN8和KIAA1407；GEMIN8和RFXAP；GEMIN8和SMARRCA4；GEMIN8和CCDC147；KIAA1407和RFXAP；KIAA1407和SMARRCA4；KIAA1407和CCDC147；RFXAP和SMARRCA4；RFXAP和CCDC147；SMARRCA4和CCDC147；ZNF205和NEU2；ZNF205和ZNF205、NAT9；ZNF205和SVOPL；ZNF205和COQ9；ZNF205和NDUFA9；ZNF205和RAD51AP1；ZNF205和COX20；ZNF205和MAPK6；ZNF205和WDR62；ZNF205和LRGUK；ZNF205和CDK6；ZNF205和KIAA1683；ZNF205和CRISP3；ZNF205和GRPR；ZNF205和DPH7；ZNF205和GEMIN8；ZNF205和KIAA1407；ZNF205和RFXAP；ZNF205和SMARRCA4；ZNF205和CCDC147；ZNF205和AACS；ZNF205和CDK9；ZNF205和C7ORF26；ZNF205和ZDHHC14；ZNF205和RNUT1；ZNF205和GAB1；ZNF205和EMC3；ZNF205和FAM96A；ZNF205和FAM36A；ZNF205和LOC55831；ZNF205和LOC136306；ZNF205和DEFB126；ZNF205和MGC955；ZNF205和EPHX2；ZNF205和SRGAP1；ZNF205和PPP5C；ZNF205和MET；ZNF205和SELM；ZNF205和TSPYL2；ZNF205和TSARG6；ZNF205和NDUFB2；ZNF205和PLAU；ZNF205和FLJ36888；ZNF205和ADORA2B；ZNF205和FLJ22875；ZNF205和HMMR；ZNF205和NRK；ZNF205和FLJ44691；ZNF205和GPR154；ZNF205和ZGPAT；ZNF205和DRD1；ZNF205和FLJ27505；ZNF205和EDG5；ZNF205和SNRNP40；ZNF205和HPRP8BP；ZNF205和GPA33；ZNF205和JDP2；ZNF205和FLJ20010；ZNF205和FOXJ1；ZNF205和SCT；ZNF205和CHD1L；ZNF205和SULT1C1；ZNF205和STN2；ZNF205和MRS2L；ZNF205和RAD51AP1；ZNF205和DPH7；ZNF205和CLPP；ZNF205和ZNF37；ZNF205和AP3B2；ZNF205和COQ9；ZNF205和DEGS2；ZNF205和PIR；ZNF205和D2LIC；ZNF205和CNTF；PAM；ZNF205和MYH9；ZNF205和PRPF4；ZNF205和SLC4A11；ZNF205和LRRCC1；ZNF205和FZD9；ZNF205和GPR43；ZNF205和LTF；ZNF205和ARIH1；ZNF205和PIK3R3；ZNF205和PTGFRN；ZNF205和KIAA1764；ZNF205和C19ORF14；ZNF205和FLNA；ZNF205和FLJ32786；ZNF205和DKFZP434K046；ZNF205和C9ORF112；ZNF205和PIR51；ZNF205、NAT9和NEU2；ZNF205、NAT9和SVOPL；ZNF205、NAT9和COQ9；ZNF205、NAT9和NDUFA9；ZNF205、NAT9和RAD51AP1；ZNF205、NAT9和COX20；ZNF205、NAT9和MAPK6；ZNF205、NAT9和WDR62；ZNF205、NAT9和LRGUK；ZNF205、NAT9和CDK6；ZNF205、NAT9和KIAA1683；ZNF205、NAT9和CRISP3；ZNF205、NAT9和GRPR；ZNF205、NAT9和DPH7；ZNF205、NAT9和GEMIN8；ZNF205、NAT9和KIAA1407；ZNF205、NAT9和RFXAP；ZNF205、NAT9和SMARRCA4；ZNF205、NAT9和CCDC147；ZNF205、NAT9和AACS；ZNF205、NAT9和CDK9；ZNF205、NAT9和C7ORF26；ZNF205、NAT9和ZDHHC14；ZNF205、NAT9和RNUT1；ZNF205、NAT9和GAB1；ZNF205、NAT9和EMC3；ZNF205、NAT9和FAM96A；ZNF205、NAT9和FAM36A；ZNF205、NAT9和LOC55831；ZNF205、NAT9和LOC136306；ZNF205、NAT9和DEFB126；ZNF205、NAT9和MGC955；ZNF205、NAT9和EPHX2；ZNF205、NAT9和SRGAP1；ZNF205、NAT9和PPP5C；ZNF205、NAT9和MET；ZNF205、NAT9和SELM；ZNF205、NAT9和TSPYL2；ZNF205、NAT9和TSARG6；ZNF205、NAT9和NDUFB2；ZNF205、NAT9和PLAU；ZNF205、NAT9和FLJ36888；ZNF205、NAT9和ADORA2B；ZNF205、NAT9和FLJ22875；ZNF205、NAT9和HMMR；ZNF205、NAT9和NRK；ZNF205、NAT9和FLJ44691；ZNF205、NAT9和GPR154；ZNF205、NAT9和ZGPAT；ZNF205、NAT9和DRD1；ZNF205、NAT9和FLJ27505；ZNF205、NAT9和EDG5；ZNF205、NAT9和SNRNP40；ZNF205、NAT9和HPRP8BP；ZNF205、NAT9和GPA33；ZNF205、NAT9和JDP2；ZNF205、NAT9和FLJ20010；ZNF205、NAT9和FOXJ1；ZNF205、NAT9和SCT；ZNF205、NAT9和CHD1L；ZNF205、NAT9和SULT1C1；ZNF205、NAT9和STN2；ZNF205、NAT9和MRS2L；ZNF205、NAT9和RAD51AP1；ZNF205、NAT9和DPH7；ZNF205、NAT9和CLPP；ZNF205、NAT9和ZNF37；ZNF205、NAT9和AP3B2；ZNF205、NAT9和COQ9；ZNF205、NAT9和DEGS2；ZNF205、NAT9和PIR；ZNF205、NAT9和D2LIC；ZNF205、NAT9和CNTF；ZNF205、NAT9和PAM；ZNF205、NAT9和MYH9；ZNF205、NAT9和PRPF4；ZNF205、NAT9和SLC4A11 ZNF205、NAT9和LRRCC1；ZNF205、NAT9和FZD9；ZNF205、NAT9和GPR43；ZNF205、NAT9和LTF；ZNF205、NAT9和ARIH1；ZNF205、NAT9和PIK3R3；ZNF205、NAT9和PTGFRN；ZNF205、NAT9和KIAA1764；ZNF205、NAT9和C19ORF14；ZNF205、NAT9和FLNA；ZNF205、NAT9和FLJ32786；ZNF205、NAT9和DKFZP434K046；ZNF205、NAT9和C9ORF112；以及ZNF205、NAT9和PIR51。本文具体公开了两种或多种公开的基因ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、KIAA1764、C19ORF14、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51的任何其他组合。

如本文所用，“增加病毒产量(increased viral production)”、“增加病毒产量(increasing viral production)”，“增加轮状病毒产量(increased Rotaviralproduction)”和“增加轮状病毒产量(increasing Rotaviral production)”是指病毒滴度的变化，导致产生更多的病毒。

可以用可以被轮状病毒感染的任何细胞进行公开的方法。在一方面，细胞可以是哺乳动物来源的(包括人、猿、猪、牛、马、犬、猫、啮齿动物(例如，兔、大鼠、小鼠和豚鼠)和非人灵长类动物)或禽类，包括鸡、鸭、鸵鸟和火鸡细胞。还预期该细胞可以是已建立的哺乳动物细胞系的细胞，包括但不限于MA104细胞、VERO细胞、马丁达比犬肾(MDCK)细胞、HEp-2细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、EB66和PER C6细胞。

轮状病毒是包含本领域已知的许多种、血清型、亚型、菌株、变体和重配株的病毒。术语“轮状病毒”旨在包括可用于疫苗生产的任何当前或将来的轮状病毒。这些包括任何和所有野生型菌株、亲本菌株或减毒菌株，例如构成当前商业疫苗的菌株、CDC9菌株、116E菌株、RotaTeq(G1P7、G2P7、G3P7、G4P7、G6P1A)和Rotarix(89-12/G1P[8])菌株)、RV3-BB菌株，其目前正在BioFarma,Indonesia研发中(参见Danchin，M.等人(2013)“Phase I trial ofRV3-BB rotavirus vaccine:A human neonatal rotavirus vaccine.”Vaccine 31:2610-2616)，以及CDC-9菌株，一种活飞减毒人G1P RV菌株，其最近在印度进行了3期试验)。最后，相关菌株包括G9变体。另外，在本文的上下文中，术语“轮状病毒”包括源自任何前述菌株或密切相关的病毒以及当前或将来的重组或工程菌株的任何VLP。最后，该术语还包括除已知的轮状病毒之外的呼肠孤病毒科的任何成员。

如上所述，应理解并在本文中预期所公开的方法可适用于任何轮状病毒，包括所有已知的轮状病毒物种(例如，轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、轮状病毒D、轮状病毒E、轮状病毒F、轮状病毒G和轮状病毒H)，病毒菌株、血清型(P1、P2A、P2B、P2C、P3、P4、P5A、P5B、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13或P14)，以及包括但不限于轮状病毒重配株的变体。还应理解，所公开的方法包括用一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种轮状病毒的物种、菌株、变体、重配株或血清型(即，同时感染多种病毒菌株)。优选地，对所述列表中的基因(多种)的调变增强轮状病毒的RV3疫苗菌株的产生。更优选地，所述列表中的基因(多种)的调变增强轮状病毒疫苗生产中使用的细胞或细胞系中的轮状病毒或轮状病毒抗原的G1P7、G2P7、G3P7、G4P7、G6P1A、89-12/G1P[8]、RV3-BB、CDC-9和/或G9菌株的产生。

本文公开的方法利用基因或其编码的蛋白质表达的减少来增加轮状病毒产量。如本文所用，“减少的(reduced)”或“减少的(decreased)”表达是指基因转录的改变、mRNA的转译或由基因编码的蛋白质的活性，其导致较少的基因、转译的mRNA、编码的蛋白质或相对于对照的蛋白质活性。表达减少可为相对于对照的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的基因表达、mRNA转译、蛋白质表达或蛋白质活性的减少。例如，本文公开的是增加本文公开的轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染细胞；其中被感染的细胞包含相对于对照的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的表达减少的至少一种基因，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1 FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51基因。

还应理解，提及减少而不是减少百分比的一种方式是作为对照表达或活性的百分比。例如，特定基因的表达相对于对照减少至少15％的细胞也将是表达小于或等于对照表达的85％的基因。因此，一方面是其中基因表达、mRNA表达、蛋白质表达或蛋白质活性小于或等于95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的对照的方法。因此，本文公开的是增加本文公开的轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染细胞。其中被感染的细胞包含相对于对照的小于或等于95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的表达的减少的至少一种基因、mRNA、蛋白质或蛋白质活性，所述至少一种基因、mRNA、蛋白质或蛋白质活性选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。例如，本文公开的是增加本文公开的轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染细胞；其中被感染的细胞包含相对于对照的小于或等于85％的表达减少的至少一种基因，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。

应当理解并且在本文中预期的是，可以通过本领域已知的任何手段来实现减少的表达，包括操纵基因组DNA、信使和/或非编码RNA和/或蛋白质的技术，包括但不限于内源或外源控制元件(例如，小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小分子抑制剂和反义寡核苷酸)和/或突变存在于直接靶向基因、mRNA或蛋白质的编码区，或者存在于或靶向与基因、mRNA或蛋白质可操作地连接的调控区。因此，可用于调变感兴趣基因的技术或机制包括但不限于1)以基因组DNA为靶标以产生经编辑的基因组的技术和试剂(例如，同源重组以引入突变，例如删除进入基因、锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物(例如，TALEN)、三链体、表观遗传修饰的介体以及CRISPR和rAAV技术)，2)靶向RNA的技术和试剂(例如通过RNAi途径、反义技术、核糖酶技术起作用的试剂)，和3)靶向蛋白质(例如，小分子、适体、肽、生长素或FKBP介导的去稳定结构域、抗体)的技术。

在靶向DNA的一个实施例中，使用锌指核酸酶(ZFN)实现基因调变。合成ZFN由定制设计的锌指结合结构域组成，所述锌指结合结构域与例如，Fokl DNA切割结构域融合。由于这些试剂可以设计/工程化以编辑细胞基因组，包括但不限于敲除或敲入基因表达，因此在多种生物体中，它们被认为是具有开发所需特征的稳定的工程化细胞系的标准之一。大范围核酸酶、三链体、CRISPR和重组腺相关病毒已类似地用于多种细胞类型的基因组工程化，并且是ZFN的可行替代品。所述试剂可用于靶向启动子、蛋白编码区(外显子)、内含子、5’和3’UTR等。

调变基因功能的另一个实施例利用细胞的内源或外源RNA干扰(RNAi)途径靶向细胞信使RNA。在这种方法中，基因靶向试剂包括小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。这些试剂可以掺入广泛的化学修饰，与感兴趣的靶转录物的互补性水平和设计(参见美国专利号8,188,060)以增强稳定性、细胞递送、特异性和功能性。此外，可以将此类试剂设计为靶向基因的不同区域(包括5'UTR、开放阅读框、mRNA的3'UTR)或(在某些情况下)编码感兴趣基因的基因组DNA的启动子/增强子区域。通过将靶向同一mRNA转录本的不同区域的单个siRNA或miRNA或多个siRNA或miRNA(即，池)引入(到细胞中)来实现基因调变(例如，敲低)。合成siRNA/miRNA的递送可以通过多种方法实现，包括但不限于1)自递送(美国专利申请号2009/0280567A1)，2)脂质介导的递送，3)电穿孔，或4)基于载体/质粒的表达系统。引入的RNA分子可以被称为外源核苷酸序列或多核苷酸。

使用RNAi途径的另一种基因靶向试剂包括外源小发夹RNA，也称为shRNA。通过例如表达构建体(例如，质粒、慢病毒)递送至细胞的shRNA具有以组成型或调控方式提供长期基因敲低的能力，这取决于所用启动子的类型。在一个优选的实施例中，慢病毒颗粒的基因组被修饰成包括一个或多个靶向感兴趣的基因(或多个基因)的shRNA表达盒。此类慢病毒可感染旨在用于疫苗生产的细胞，将其病毒基因组稳定整合到宿主基因组中，并在1)组成型、2)调控型，或(在表达多个shRNA的情况下)组成型和调控方式中表达shRNA。以这种方式，可以产生具有增强的轮状病毒生产能力的细胞系。值得注意的是，使用siRNA或shRNA的方法具有额外的优势，因为它们可以设计为靶向单个基因或多个密切相关的基因家族成员的个体变体。以这种方式，各个试剂可用于调变具有相似或冗余功能或序列基序的更大靶标集合。技术人员将认识到慢病毒构建体也可以掺入克隆的DNA或ORF表达构建体。

在调变基因功能的另一个实施例中，可以通过用导入到细胞中的miRNA模拟物或miRNA抑制剂大规模转染细胞来实现基因抑制。

在另一个实施例中，调变发生在蛋白质水平。例如，可以通过多种方式实现在蛋白质水平上的基因功能的敲低，包括但不限于以小分子、肽、适体、去稳定结构域或其他方法(其可以例如，下调基因产物的活性或提高其降解速率)靶向蛋白质。在一个优选的实例中，一种小分子，其结合例如，活性位点并且抑制靶蛋白功能，靶蛋白可以加入到例如细胞培养基中，从而引入到细胞中。备选地，可以通过将例如，肽引入细胞中，其(例如)防止蛋白质-蛋白质相互作用来调变靶蛋白质功能(参见例如，Shangary等人，(2009)Annual Review ofPharmacology and Toxicology 49:223)。可以通过转染或电穿孔将这样的肽引入细胞，或通过表达构建体来引入。备选地，可以通过以下方式将肽引入细胞：1)添加(例如，通过缀合)促进细胞递送的一个或多个部分，或2)使分子增压以增强自我递送(Cronican,J.J.等人(2010)ACS Chem.Biol.5(8):747-52)。表达肽的技术包括但不限于1)将肽融合到支架上，或2)信号序列的附着，以分别将肽稳定或引导至感兴趣的位置或区室。

在本文中应理解和考虑的是，增加轮状病毒产量的一些方法可包括将siRNA、miRNA模拟物、shRNA或miRNA抑制剂施用到轮状病毒感染的细胞或细胞系的培养基中，以产生基因表达降低的细胞或细胞系，其抑制轮状病毒产生，而不是从如此修饰的细胞或细胞系开始该方法。在一方面，本文公开了增加轮状病毒产量的方法，该方法包括用轮状病毒感染细胞或细胞系，并在适合于通过细胞产生病毒的条件下孵育该细胞或细胞系，其中所述培养基包含RNA多核苷酸，其抑制编码区的表达，该编码区选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。还公开了增加轮状病毒产量的方法，其中RNA多核苷酸是siRNA、miRNA模拟物、shRNA或miRNA抑制剂。

应当理解并且在本文中预期靶基因调变的时机可以变化。在某些情况下，可以设想在轮状病毒感染之前进行基因调变。例如，如果选择的基因靶标将细胞锁定在对于轮状病毒复制或RV抗原产生的高产细胞周期的特定阶段，则在病毒感染之前启动基因调变可能是有益的。在其他情况下，在调变感兴趣的靶基因之前启动轮状病毒感染/复制或抗原产生可能是有益的。例如，如果特定的宿主基因调变事件在病毒复制或抗原产生的后期阶段是必不可少的，而在早期阶段是有害的，则发明人设想基因调变将在感染后开始。在其中需要两个或多个基因调变事件来优化轮状病毒或RV抗原的产生的情况下，则某些基因可在病毒感染前被修饰，而另一些则在病毒感染后被修饰。不管基因调变的时间如何，可以采用多种方法(包括例如，将shRNA与可调节的(例如，Tet敏感的启动子)联合应用来对基因调变的表达进行计时。

在一方面，本文考虑了本文公开的增加轮状病毒产量的任何公开方法可进一步包括在适合于由细胞产生病毒的条件下孵育细胞或细胞系；并收集细胞产生的病毒。

本文公开的一方面是增加轮状病毒产量的方法，包括用轮状病毒感染本文公开的任何细胞或细胞系。在另一方面，公开了进一步包括产生轮状病毒疫苗的方法，其中使用了具有一个或多个调变的基因或基因产物的细胞。

除非另外特别指出，否则可以使用本领域技术人员已知的用于该特定试剂或化合物的任何方法来制备本文公开的组合物和执行所公开的方法所必需的组合物。

C.组合物

本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当本发明公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每个在本文中均得到特别考虑和描述。例如，如果公开和讨论了特定的ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764 C19ORF14 FLNA FLJ32786DKFZP434K046 C9ORF112和/或PIR51，并且讨论了对包括ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51的许多分子可以进行许多修饰，则具体考虑到ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51的各个和每种组合和排列以及可能的修饰，除非特别指出相反的情况。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子的实例，则公开了A-D，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了个体和集体考虑的含义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。

在一方面，公开的组合物可以是用于增加轮状病毒产量的公开的方法中的细胞或细胞系。在一方面，本文公开了包含表达减少的至少一种基因的细胞，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。

如本文所用，术语“基因”是指转录单位和与转录单位相邻(例如，位于上游和下游)且可操作地连接的调控区。转录单位是转录为RNA分子的一系列核苷酸。转录单位可以包括编码区。“编码区”是编码未加工的preRNA(即，包括外显子和内含子的RNA分子)的核苷酸序列，其随后被加工成mRNA。转录单位可以编码非编码RNA。非编码RNA是未转译成蛋白质的RNA分子。非编码RNA的实例包括微小RNA。转录单位的边界通常由其5’末端的起始位点和其3’末端的转录终止子决定。“调控区”是调节与其可操作地连接的转录单位的表达的核苷酸序列。调控序列的非限制性实例包括启动子、增强子、转录起始位点、转译起始位点、转译终止位点、转录终止子和聚(A)信号。位于转录单元上游的调控区可以称为5'UTR，而位于转录单元下游的调控区可以称为3'UTR。调控区可以被转录并且可以是未加工的preRNA的一部分。术语“可操作地连接”是指组分的并置，使得它们处于允许它们以其预期方式起作用的关系。应当理解并在本文中预期其中在本文讨论了特定基因，诸如例如ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51；还公开了用于本文公开的任何组合物或方法中的公开基因的任何直系同源物和变体。

公认可以通过任何数量的名称和登录号来鉴定任何单个基因。在许多情况下，本文件中的基因通过常见的基因名称(例如，长醇二磷酸酶1(NAT9))或与DNA序列、mRNA序列或蛋白质序列(例如，NM_015654)相关的登录号来识别。此外，已经认识到，对于任何报道的DNA、RNA或蛋白质序列，数据库中可以包括多个序列变体、剪接变体或亚型。由于本研究中使用的siRNA被设计为抑制给定基因的所有变体/亚型的表达，因此本文件中鉴定的基因靶标旨在包含所有此类变体/亚型。

如本文所公开的，所公开的细胞或从其衍生的细胞系可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75或所有76个公开的表达减少的基因的任何组合。例如，该细胞可包含单独或与任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个其他所选基因组合的表达减少的NAT9。因此，在一方面，本文公开了细胞，该细胞包含表达减少的ZNF205；NEU2；NAT9；SVOPL；COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G；NDUFA9；RAD51AP1；COX20；MAPK6；WDR62；LRGUK；CDK6；KIAA1683；CRISP3；GRPR；DPH7；GEMIN8；KIAA1407；RFXAP；SMARRCA4；CCDC147；AACS；CDK9；C7ORF26；ZDHHC14；RNUT1；GAB1；EMC3；FAM96A；FAM36A；LOC55831；LOC136306；DEFB126；MGC955；EPHX2；SRGAP1；PPP5C；MET；SELM；TSPYL2；TSARG6；NDUFB2；PLAU；FLJ36888；ADORA2B；FLJ22875；HMMR；NRK、LRIT3；FLJ44691；GPR154；ZGPAT；DRD1 FLJ27505 EDG5；SNRNP40；HPRP8BP；GPA33；JDP2；FLJ20010；FOXJ1；SCT；CHD1L；SULT1C1；STN2；MRS2L；RAD51AP1；DPH7；CLPP；ZNF37；AP3B2；DEGS2；PIR；D2LIC；CNTF；PAM；MYH9；PRPF4；SLC4A11；LRRCC1；FZD9；GPR43；LTF；ARIH1；PIK3R3；PTGFRN；KIAA1764；C19ORF14；FLNA；FLJ32786；DKFZP434K046；C9ORF112；PIR51；NAT9和NEU2；NAT9和SVOPL；NAT9和COQ9；NAT9和NDUFA9；NAT9和RAD51AP1；NAT9和COX20；NAT9和MAPK6；NAT9和WDR62；NAT9和LRGUK；NAT9和CDK6；NAT9和KIAA1683；NAT9和CRISP3；NAT9和GRPR；NAT9和DPH7；NAT9和GEMIN8；NAT9和KIAA1407；NAT9和RFXAP；NAT9和SMARRCA4；NAT9和CCDC147；NAT9和AACS；NAT9和CDK9；NAT9和C7ORF26；NAT9和ZDHHC14；NAT9和RNUT1；NAT9和GAB1；NAT9和EMC3；NAT9和FAM96A；NAT9和FAM36A；NAT9和LOC55831；NAT9和LOC136306；NAT9和DEFB126；NAT9和MGC955；NAT9和EPHX2；NAT9和SRGAP1；NAT9和PPP5C；NAT9和MET；NAT9和SELM；NAT9和TSPYL2；NAT9和TSARG6；NAT9和NDUFB2；NAT9和PLAU；NAT9和FLJ36888；NAT9和ADORA2B；NAT9和FLJ22875；NAT9和HMMR；NAT9和NRK；NAT9和FLJ44691；NAT9和GPR154；NAT9和ZGPAT；NAT9和DRD1；NAT9和FLJ27505；NAT9和EDG5；NAT9和SNRNP40；NAT9和HPRP8BP；NAT9和GPA33；NAT9和JDP2；NAT9和FLJ20010；NAT9和FOXJ1；NAT9和SCT；NAT9和CHD1L；NAT9和SULT1C1；NAT9和STN2；NAT9和MRS2L；NAT9和RAD51AP1；NAT9和DPH7；NAT9和CLPP；NAT9和ZNF37；NAT9和AP3B2；NAT9和COQ9；NAT9和DEGS2；NAT9和PIR；NAT9和D2LIC；NAT9和CNTF；NAT9和PAM；NAT9和MYH9；NAT9和PRPF4；NAT9和SLC4A11；NAT9和LRRCC1；NAT9和FZD9；NAT9和GPR43；NAT9和LTF；NAT9和ARIH1；NAT9和PIK3R3；NAT9和PTGFRN；NAT9和KIAA1764；NAT9和C19ORF14；NAT9和FLNA；NAT9和FLJ32786；NAT9和DKFZP434K046；NAT9和C9ORF112；NAT9和PIR51 NEU2和SVOPL；NEU2和COQ9；NEU2和NDUFA9；NEU2和RAD51AP1；NEU2和COX20；NEU2和MAPK6；NEU2和WDR62；NEU2和LRGUK；NEU2和CDK6；NEU2和KIAA1683；NEU2和CRISP3；NEU2和GRPR；NEU2和DPH7；NEU2和GEMIN8；NEU2和KIAA1407；NEU2和RFXAP；NEU2和SMARRCA4；NEU2和CCDC147 SVOPL和COQ9；SVOPL和NDUFA9；SVOPL和RAD51AP1；SVOPL和COX20；SVOPL和MAPK6；SVOPL和WDR62；SVOPL和LRGUK；SVOPL和CDK6；SVOPL和KIAA1683；SVOPL和CRISP3；SVOPL和GRPR；SVOPL和DPH7；SVOPL和GEMIN8；SVOPL和KIAA1407；SVOPL和RFXAP；SVOPL和SMARRCA4；SVOPL和CCDC147；COQ9和NDUFA9；COQ9和RAD51AP1；COQ9和COX20；COQ9和MAPK6；COQ9和WDR62；COQ9和LRGUK；COQ9和CDK6；COQ9和KIAA1683；COQ9和CRISP3；COQ9和GRPR；COQ9和DPH7；COQ9和GEMIN8；COQ9和KIAA1407；COQ9和RFXAP；COQ9和SMARRCA4；COQ9和CCDC147；NDUFA9和RAD51AP1；NDUFA9和COX20；NDUFA9和MAPK6；NDUFA9和WDR62；NDUFA9和LRGUK；NDUFA9和CDK6；NDUFA9和KIAA1683；NDUFA9和CRISP3；NDUFA9和GRPR；NDUFA9和DPH7；NDUFA9和GEMIN8；NDUFA9和KIAA1407；NDUFA9和RFXAP；NDUFA9和SMARRCA4；NDUFA9和CCDC147；RAD51AP1和COX20；RAD51AP1和MAPK6；RAD51AP1和WDR62；RAD51AP1和LRGUK；RAD51AP1和CDK6；RAD51AP1和KIAA1683；RAD51AP1和CRISP3；RAD51AP1和GRPR；RAD51AP1和DPH7；RAD51AP1和GEMIN8；RAD51AP1和KIAA1407；RAD51AP1和RFXAP；RAD51AP1和SMARRCA4；RAD51AP1和CCDC147；COX20和MAPK6；COX20和WDR62；COX20和LRGUK；COX20和CDK6；COX20和KIAA1683；COX20和CRISP3；COX20和GRPR；COX20和DPH7；COX20和GEMIN8；COX20和KIAA1407；COX20和RFXAP；COX20和SMARRCA4；COX20和CCDC147；MAPK6和WDR62；MAPK6和LRGUK；MAPK6和CDK6；MAPK6和KIAA1683；MAPK6和CRISP3；MAPK6和GRPR；MAPK6和DPH7；MAPK6和GEMIN8；MAPK6和KIAA1407；MAPK6和RFXAP；MAPK6和SMARRCA4；MAPK6和CCDC147；WDR62和LRGUK；WDR62和CDK6；WDR62和KIAA1683；WDR62和CRISP3；WDR62和GRPR；WDR62和DPH7；WDR62和GEMIN8；WDR62和KIAA1407；WDR62和RFXAP；WDR62和SMARRCA4；WDR62和CCDC147；LRGUK和CDK6；LRGUK和KIAA1683；LRGUK和CRISP3；LRGUK和GRPR；LRGUK和DPH7；LRGUK和GEMIN8；LRGUK和KIAA1407；LRGUK和RFXAP；LRGUK和SMARRCA4；LRGUK和CCDC147；CDK6和KIAA1683；CDK6和CRISP3；CDK6和GRPR；CDK6和DPH7；CDK6和GEMIN8；CDK6和KIAA1407；CDK6和RFXAP；CDK6和SMARRCA4；CDK6和CCDC147；KIAA1683和CRISP3；KIAA1683和GRPR；KIAA1683和DPH7；KIAA1683和GEMIN8；KIAA1683和KIAA1407；KIAA1683和RFXAP；KIAA1683和SMARRCA4；KIAA1683和CCDC147；CRISP3和GRPR；CRISP3和DPH7；CRISP3和GEMIN8；CRISP3和KIAA1407；CRISP3和RFXAP；CRISP3和SMARRCA4；CRISP3和CCDC147；GRPR和DPH7；GRPR和GEMIN8；GRPR和KIAA1407；GRPR和RFXAP；GRPR和SMARRCA4；GRPR和CCDC147；DPH7和GEMIN8；DPH7和KIAA1407；DPH7和RFXAP；DPH7和SMARRCA4；DPH7和CCDC147；GEMIN8和KIAA1407；GEMIN8和RFXAP；GEMIN8和SMARRCA4；GEMIN8和CCDC147；KIAA1407和RFXAP；KIAA1407和SMARRCA4；KIAA1407和CCDC147；RFXAP和SMARRCA4；RFXAP和CCDC147；SMARRCA4和CCDC147；ZNF205和NEU2；ZNF205和ZNF205、NAT9；ZNF205和SVOPL；ZNF205和COQ9；ZNF205和NDUFA9；ZNF205和RAD51AP1；ZNF205和COX20；ZNF205和MAPK6；ZNF205和WDR62；ZNF205和LRGUK；ZNF205和CDK6；ZNF205和KIAA1683；ZNF205和CRISP3；ZNF205和GRPR；ZNF205和DPH7；ZNF205和GEMIN8；ZNF205和KIAA1407；ZNF205和RFXAP；ZNF205和SMARRCA4；ZNF205和CCDC147；ZNF205和AACS；ZNF205和CDK9；ZNF205和C7ORF26；ZNF205和ZDHHC14；ZNF205和RNUT1；ZNF205和GAB1；ZNF205和EMC3；ZNF205和FAM96A；ZNF205和FAM36A；ZNF205和LOC55831；ZNF205和LOC136306；ZNF205和DEFB126；ZNF205和MGC955；ZNF205和EPHX2；ZNF205和SRGAP1；ZNF205和PPP5C；ZNF205和MET；ZNF205和SELM；ZNF205和TSPYL2；ZNF205和TSARG6；ZNF205和NDUFB2；ZNF205和PLAU；ZNF205和FLJ36888；ZNF205和ADORA2B；ZNF205和FLJ22875；ZNF205和HMMR；ZNF205和NRK；ZNF205和FLJ44691；ZNF205和GPR154；ZNF205和ZGPAT；ZNF205和DRD1；ZNF205和FLJ27505；ZNF205和EDG5；ZNF205和SNRNP40；ZNF205和HPRP8BP；ZNF205和GPA33；ZNF205和JDP2；ZNF205和FLJ20010；ZNF205和FOXJ1；ZNF205和SCT；ZNF205和CHD1L；ZNF205和SULT1C1；ZNF205和STN2；ZNF205和MRS2L；ZNF205和RAD51AP1；ZNF205和DPH7；ZNF205和CLPP；ZNF205和ZNF37；ZNF205和AP3B2；ZNF205和COQ9；ZNF205和DEGS2；ZNF205和PIR；ZNF205和D2LIC；ZNF205和CNTF；PAM；ZNF205和MYH9；ZNF205和PRPF4；ZNF205和SLC4A11；ZNF205和LRRCC1；ZNF205和FZD9；ZNF205和GPR43；ZNF205和LTF；ZNF205和ARIH1；ZNF205和PIK3R3；ZNF205和PTGFRN；ZNF205和KIAA1764；ZNF205和C19ORF14；ZNF205和FLNA；ZNF205和FLJ32786；ZNF205和DKFZP434K046；ZNF205和C9ORF112；ZNF205和PIR51；ZNF205、NAT9和NEU2；ZNF205、NAT9和SVOPL；ZNF205、NAT9和COQ9；ZNF205、NAT9和NDUFA9；ZNF205、NAT9和RAD51AP1；ZNF205、NAT9和COX20；ZNF205、NAT9和MAPK6；ZNF205、NAT9和WDR62；ZNF205、NAT9和LRGUK；ZNF205、NAT9和CDK6；ZNF205、NAT9和KIAA1683；ZNF205、NAT9和CRISP3；ZNF205、NAT9和GRPR；ZNF205、NAT9和DPH7；ZNF205、NAT9和GEMIN8；ZNF205、NAT9和KIAA1407；ZNF205、NAT9和RFXAP；ZNF205、NAT9和SMARRCA4；ZNF205、NAT9和CCDC147；ZNF205、NAT9和AACS；ZNF205、NAT9和CDK9；ZNF205、NAT9和C7ORF26；ZNF205、NAT9和ZDHHC14；ZNF205、NAT9和RNUT1；ZNF205、NAT9和GAB1；ZNF205、NAT9和EMC3；ZNF205、NAT9和FAM96A；ZNF205、NAT9和FAM36A；ZNF205、NAT9和LOC55831；ZNF205、NAT9和LOC136306；ZNF205、NAT9和DEFB126；ZNF205、NAT9和MGC955；ZNF205、NAT9和EPHX2；ZNF205、NAT9和SRGAP1；ZNF205、NAT9和PPP5C；ZNF205、NAT9和MET；ZNF205、NAT9和SELM；ZNF205、NAT9和TSPYL2；ZNF205、NAT9和TSARG6；ZNF205、NAT9和NDUFB2；ZNF205、NAT9和PLAU；ZNF205、NAT9和FLJ36888；ZNF205、NAT9和ADORA2B；ZNF205、NAT9和FLJ22875；ZNF205、NAT9和HMMR；ZNF205、NAT9和NRK；ZNF205、NAT9和FLJ44691；ZNF205、NAT9和GPR154；ZNF205、NAT9和ZGPAT；ZNF205、NAT9和DRD1；ZNF205、NAT9和FLJ27505；ZNF205、NAT9和EDG5；ZNF205、NAT9和SNRNP40；ZNF205、NAT9和HPRP8BP；ZNF205、NAT9和GPA33；ZNF205、NAT9和JDP2；ZNF205、NAT9和FLJ20010；ZNF205、NAT9和FOXJ1；ZNF205、NAT9和SCT；ZNF205、NAT9和CHD1L；ZNF205、NAT9和SULT1C1；ZNF205、NAT9和STN2；ZNF205、NAT9和MRS2L；ZNF205、NAT9和RAD51AP1；ZNF205、NAT9和DPH7；ZNF205、NAT9和CLPP；ZNF205、NAT9和ZNF37；ZNF205、NAT9和AP3B2；ZNF205、NAT9和COQ9；ZNF205、NAT9和DEGS2；ZNF205、NAT9和PIR；ZNF205、NAT9和D2LIC；ZNF205、NAT9和CNTF；ZNF205、NAT9和PAM；ZNF205、NAT9和MYH9；ZNF205、NAT9和PRPF4；ZNF205、NAT9和SLC4A11；ZNF205、NAT9和LRRCC1；ZNF205、NAT9和FZD9；ZNF205、NAT9和GPR43；ZNF205、NAT9和LTF；ZNF205、NAT9和ARIH1；ZNF205、NAT9和PIK3R3；ZNF205、NAT9和PTGFRN；ZNF205、NAT9和KIAA1764；ZNF205、NAT9和C19ORF14；ZNF205、NAT9和FLNA；ZNF205、NAT9和FLJ32786；ZNF205、NAT9和DKFZP434K046；ZNF205、NAT9和C9ORF112；以及ZNF205、NAT9和PIR51。

所公开的细胞和由其衍生的细胞系可以是可以被轮状病毒稳定感染的任何细胞或细胞系。在一方面，细胞可以是哺乳动物来源的(包括人、猿、猪、牛、马、犬、猫、啮齿动物(例如，兔、大鼠、小鼠和豚鼠)和非人灵长类动物)或禽类，包括鸡、鸭、鸵鸟和火鸡细胞。还预期该细胞可以是已建立的哺乳动物细胞系的细胞，包括但不限于MA104细胞、VERO细胞、马丁达比犬肾(MDCK)细胞、HEp-2细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、EB66和PER C6细胞。

在一方面，本文公开的细胞或细胞系可具有抑制轮状病毒产生的基因、mRNA或蛋白质的减少的表达或拷贝数或降低的蛋白质活性。表达减少可为相对于对照的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的基因表达、mRNA转译、蛋白质表达或蛋白质活性的减少。例如，本文公开的是细胞和/或细胞系，其包含相对于对照的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的表达减少的至少一种基因，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51基因。

还应理解，提及减少而不是减少百分比的一种方式是作为对照表达或活性的百分比。例如，特定基因的表达相对于对照减少至少15％的细胞也将是表达小于或等于对照表达的85％的基因。因此，在一方面，本文公开了细胞或细胞系，其中基因表达、mRNA表达、蛋白质表达或蛋白质活性小于或等于对照的95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％。例如，本文公开的是细胞或细胞系，其包含相对于对照的小于或等于95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。例如，本文公开的是细胞，该细胞包含相对于对照的小于或等于85％的表达减少的至少一种基因，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。

应当理解并且在本文中预期的是，可以通过本领域已知的任何手段来实现减少的表达，包括操纵基因组DNA、信使和/或非编码RNA和/或蛋白质的技术，包括但不限于内源或外源控制元件(例如，siRNA、shRNA、小分子抑制剂和反义寡核苷酸)和存在于或直接靶向基因、mRNA或蛋白质的编码区的突变，或者存在于或靶向与基因、mRNA或蛋白质可操作地连接的调控区的控制元件或突变。因此，可用于调变感兴趣基因的技术或机制包括但不限于1)以基因组DNA为靶标以产生经编辑的基因组的技术和试剂(例如，同源重组以引入突变，例如删除进入基因、锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物(例如，TALEN)、三链体、表观遗传修饰的介体以及CRISPR和rAAV技术)，2)靶向RNA的技术和试剂(例如通过RNAi途径、反义技术、核糖酶技术起作用的试剂)，和3)靶向蛋白质(例如，小分子、适体、肽、生长素或FKBP介导的去稳定结构域、抗体)的技术。

在靶向DNA的一个实施例中，使用锌指核酸酶(ZFN)实现基因调变。合成ZFN由定制设计的锌指结合结构域组成，所述锌指结合结构域与例如，Fokl DNA切割结构域融合。由于这些试剂可以设计/工程化以编辑细胞基因组，包括但不限于敲除或敲入基因表达，因此在多种生物体中，它们被认为是具有开发所需特征的稳定的工程化细胞系的标准之一。大范围核酸酶、三链体、TALEN、CRISPR和重组腺相关病毒已类似地用于多种细胞类型的基因组工程化，并且是ZFN的可行替代品。所述试剂可用于靶向启动子、蛋白编码区(外显子)、内含子、5’和3’UTR等。

调变基因功能的另一个实施例利用细胞的内源或外源RNA干扰(RNAi)途径靶向细胞信使RNA。在这种方法中，基因靶向试剂包括小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。这些试剂可以掺入广泛的化学修饰，与感兴趣的靶转录物的互补性水平和设计(参见美国专利号8,188,060)以增强稳定性、细胞递送、特异性和功能性。此外，可以将此类试剂设计为靶向基因的不同区域(包括5'UTR、开放阅读框、mRNA的3'UTR)或(在某些情况下)编码感兴趣基因的基因组DNA的启动子/增强子区域。通过将靶向同一mRNA转录本的不同区域的单个siRNA或miRNA或多个siRNA或miRNA(即，池)引入(到细胞中)来实现基因调变(例如，敲低)。合成siRNA/miRNA的递送可以通过多种方法实现，包括但不限于1)自递送(美国专利申请号2009/0280567A1)，2)脂质介导的递送，3)电穿孔，或4)基于载体/质粒的表达系统。引入的RNA分子可以被称为外源核苷酸序列或多核苷酸。

使用RNAi途径的另一种基因靶向试剂包括外源小发夹RNA，也称为shRNA。通过例如表达构建体(例如，质粒、慢病毒)递送至细胞的shRNA具有以组成型或调控方式提供长期基因敲低的能力，这取决于所用启动子的类型。在一个优选的实施例中，慢病毒颗粒的基因组被修饰成包括一个或多个靶向感兴趣的基因(或多个基因)的shRNA表达盒。此类慢病毒可感染旨在用于疫苗生产的细胞，将其病毒基因组稳定整合到宿主基因组中，并在1)组成型、2)调控型，或(在表达多个shRNA的情况下)组成型和调控方式中表达shRNA。以这种方式，可以产生具有增强的轮状病毒生产能力的细胞系。值得注意的是，使用siRNA或shRNA的方法具有额外的优势，因为它们可以设计为靶向单个基因或多个密切相关的基因家族成员的个体变体。以这种方式，各个试剂可用于调变具有相似或冗余功能或序列基序的更大靶标集合。技术人员将认识到慢病毒构建体也可以掺入克隆的DNA或ORF表达构建体。

在调变基因功能的另一个实施例中，可以通过用导入到细胞中的miRNA模拟物或miRNA抑制剂大规模转染细胞来实现基因抑制。

在另一个实施例中，调变发生在蛋白质水平。例如，可以通过多种方式实现在蛋白质水平上的基因功能的敲低，包括但不限于以小分子、肽、适体、去稳定结构域或其他方法(其可以例如，下调基因产物的活性或提高其降解速率)靶向蛋白质。在一个优选的实例中，一种小分子，其结合例如，活性位点并且抑制靶蛋白功能，靶蛋白可以加入到例如细胞培养基中，从而引入到细胞中。备选地，可以通过将例如，肽引入细胞中，其(例如)防止蛋白质-蛋白质相互作用来调变靶蛋白质功能(参见例如，Shangary等人，(2009)Annual Review ofPharmacology and Toxicology 49:223)。可以通过转染或电穿孔将这样的肽引入细胞，或通过表达构建体来引入。备选地，可以通过以下方式将肽引入细胞：1)添加(例如，通过缀合)促进细胞递送的一个或多个部分，或2)使分子增压以增强自我递送(Cronican,J.J.等人(2010)ACS Chem.Biol.5(8):747-52)。表达肽的技术包括但不限于1)将肽融合到支架上，或2)信号序列的附着，以分别将肽稳定或引导至感兴趣的位置或区室。

如上所述，本文公开的组合物和方法完全涵盖了包含本文所述细胞的细胞系。如本文所用，术语“细胞系”是指能够继续***并且不经历衰老的细胞的克隆种群。细胞(多种)可以源自多种来源，包括哺乳动物(包括但不限于人类、非人类灵长类动物、仓鼠、狗)、禽类(例如，鸡、鸭)、昆虫等。本文考虑的细胞系也可以是现有细胞系的修饰版本，包括但不限于MA104细胞、VERO细胞、马丁达比犬肾(MDCK)细胞、HEp-2细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、EB66和PER C6细胞。优选地，修饰的基因增强RV抗原产生或用于产生RV疫苗的轮状病菌株的产生。优选地，细胞系和轮状病毒或RV抗原在轮状病毒疫苗生产中使用。因此，在一方面，本文公开的是包含细胞的细胞系(包括工程细胞系)；其中所述细胞包含相对于对照表达减少的至少一种基因，所述至少一种基因选自ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51基因。

增强轮状病毒产量的基因的最初的筛选发生在MA104细胞系中。MA104细胞源自猴肾(起源于猕猴)，因此，最初的筛选确定了猕猴基因，其在调变后增强轮状病毒产生。如下文实施例部分所述，使用衍生自非洲绿猴(绿猴属(Chlorocebus))的VERO细胞验证轮状病毒命中物。由于在初步筛选中鉴定出的命中物还增加了VERO细胞中的轮状病毒滴度，因此另一个实施例包括一系列与在初步筛选中鉴定出的基因直系同源的基因(表I)。可以在人类或非人类细胞或细胞系中调变此类直向同源以增加轮状病毒或轮状病毒抗原产生。

另一个实施例包括具有经修饰以增强轮状病毒复制的在下表1或3中鉴定的一种或多种基因的敲除动物(例如，敲除小鼠)。例如，本文公开了具有一种或多种基因的敲除动物，所述基因选自经修饰以增强轮状病毒复制的ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。

1.核酸

本文公开了多种基于核酸的分子，包括例如编码以下基因的核酸，例如ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51，或本文公开的用于制备以下基因的核酸，所述基因为ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51敲除、敲低、变体、突变、或其片段以及各种功能性核酸。公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物组成。这些和其他分子的非限制性实例在本文中讨论。应当理解，例如，当载体在细胞中表达时，表达的mRNA通常将由A、C、G和U或其变体组成。同样，应理解，例如，如果通过例如外源递送将反义分子引入细胞或细胞环境，则有利的是，反义分子由核苷酸类似物组成，所述核苷酸类似物可减少反义分子在细胞中的降解。

a)核苷酸及相关分子

核苷酸是包含碱基部分、糖部分和磷酸盐部分的分子。核苷酸可通过其磷酸部分和糖部分连接在一起，形成核苷间键。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤9基(A)、胞嘧啶1基(C)、鸟嘌呤9基(G)、尿嘧啶1基(U)和胸腺嘧啶1基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸根部分是五价磷酸根。核苷酸的非限制性实例是3'-AMP(3'-腺苷一磷酸)或5'-GMP(5'-鸟苷一磷酸)。

核苷酸类似物是核苷酸，其包含对碱基、糖或磷酸盐部分的某种类型的修饰。对碱基部分的修饰将包括A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶碱基的天然和合成修饰，例如尿嘧啶5基(.psi.)、次黄嘌呤9基(I)和2氨基腺嘌呤9基。修饰的碱基包括但不限于5甲基胞嘧啶(5me C)、5羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2丙基和其他烷基衍生物、2硫脲嘧啶、2硫代胸腺嘧啶和2硫代胞嘧啶、5卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5尿嘧啶(假尿嘧啶)、4硫代脲嘧啶、8卤素、8氨基、8硫醇、8硫代烷基、8羟基和其他8取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5卤素特别是5溴、5三氟甲基和其他5取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7甲基鸟嘌呤和7甲基腺嘌呤、8氮鸟嘌呤和8氮杂腺嘌呤、7脱氮鸟嘌呤和7脱氮鸟嘌呤和3脱氮鸟嘌呤和3脱氮腺嘌呤。另外的碱基修饰可在,例如，美国专利号3,687,808，Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613,和Sanghvi,Y.S.,Chapter15,Antisense Research and Applications,pages 289 302,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC Press,1993中找到。某些核苷酸类似物，例如5取代的嘧啶、6氮杂嘧啶和N 2,N 6和O 6取代的嘌呤，包括2氨丙基腺嘌呤、5丙炔基尿嘧啶和5丙炔基胞嘧啶。5甲基胞嘧啶可以增加双链体形成的稳定性。通常，时基修饰可以与例如糖修饰，例如2'-O-甲氧基乙基结合，以获得独特的性质，例如增加的双链体稳定性。

核苷酸类似物也可以包括糖部分的修饰。糖部分的修饰将包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及合成修饰。糖的修饰包括但不限于以下在2’位的修饰：OH；F；O、S或N烷基；O、S或N烯基；O、S或N炔基；或O烷基O烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10、烷基或C2至C10烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH₂)_n O]_m CH3、-O(CH₂)_nOCH₃、-O(CH₂)_n NH₂、-O(CH₂)_n CH₃、-O(CH₂)_n-ONH₂和-O(CH₂)_nON[(CH₂)_n CH₃)]₂，其中n和m为1至约10。

2’位置的其他修饰包括但不限于：C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O烷芳基或O芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂ CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。也可以在糖的其他位置，特别是在3’末端核苷酸上或2'5’连接的寡核苷酸和5'末端核苷酸的5’位置中的糖的3’位置进行类似的修饰。修饰的糖还包括在桥接环氧上含有修饰的那些糖，例如CH₂和S。核苷酸糖类似物也可以具有糖模拟物，例如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。

核苷酸类似物也可以在磷酸部分被修饰。修饰的磷酸部分包括但不限于可被修饰的那些，使得两个核苷酸之间的连接包含硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯、包括3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。可以理解，两个核苷酸之间的这些磷酸酯键或修饰的磷酸酯键可以通过3'5'键或2'5'键，并且该键可以包含相反的极性，例如3'5’至5'3’或2'5’至5'2'。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

应当理解，核苷酸类似物仅需要包含单个修饰，但是也可以在一个部分内或不同部分之间包含多个修饰。

核苷酸替代物是具有与核苷酸相似的功能特性的分子，但其不包含磷酸部分，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是以Watson-Crick或Hoogsteen方式识别核酸的分子，但其通过除磷酸酯部分以外的其他部分连接在一起。当与适当的靶核酸相互作用时，核苷酸替代物能够符合双螺旋型结构。

核苷酸替代物是已经取代了磷酸部分和/或糖部分的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸替代物不含标准磷原子。磷酸的取代基可以是，例如，短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包括具有吗啉代键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；formacetyl和硫代formacetyl主链；亚甲基formacetyl和硫代formacetyl主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH₂组分的其他。

还应理解，在核苷酸替代物中，核苷酸的糖和磷酸部分都可以被例如酰胺型键(氨基乙基甘氨酸)(PNA)替代。

也可以将其他类型的分子(缀合物)连接到核苷酸或核苷酸类似物上，以增强例如细胞的摄取。缀合物可以化学连接至核苷酸或核苷酸类似物。这样的缀合物包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,65536556)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053 1060)、硫醚，例如，己基S三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306 309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765 2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20,533 538)、脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(SaisonBehmoaras等人，EMBO J.,1991,10,1111 1118；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259,327330；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75,49 54)、磷脂，例如二十六烷基外消旋甘油或1,2-二-O-十六烷基外消旋甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651 3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18,3777 3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969 973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651 3654)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229 237)，或十八烷基胺或己基氨基羰基氧胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923 937。

Watson-Crick相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位置以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N3、C4位置。

Hoogsteen相互作用是发生在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上的相互作用，其暴露在双链体DNA的主要沟槽中。Hoogsteen面包含N7位置和嘌呤核苷酸C6位置的反应基团(NH₂或O)。

b)序列

有各种各样的序列ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51，或本文公开的用于制备以下基因的核酸，所述基因为ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51，它们全部由核酸编码或为核酸。这些基因的人类类似物以及其他类似物的序列，以及这些基因的等位基因，以及剪接变体和其他类型的变体，可在包括基因库在内的各种蛋白质和基因数据库中获得。本领域技术人员理解如何解决序列不符和差异以及如何将与特定序列有关的组成和方法调整为其他相关序列。根据本文公开的和本领域已知的信息，可以针对任何给定序列设计引物和/或探针。

c)功能性核酸

功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，例如结合靶分子或催化特定反应。可以将功能性核酸分子分为以下几类，这并不意味着是限制性的。例如，功能性核酸包括反义分子、适体、核酶、三链体形成分子和外部引导序列。功能性核酸分子可以充当靶分子具有的特定活性的效应子、抑制剂、调节剂和刺激物，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其他分子的从头活性。

功能性核酸分子可以与任何大分子相互作用，例如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链。因此，功能性核酸可以与任何公开的核酸的mRNA相互作用，例如ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51，或任何公开的核酸的基因组DNA，例如ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7 GEMIN8、KIAA1407、RFXAPSMARRCA4、CCDC147、AACS CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51，或者它们可以与任何公开的核酸编码的多肽相互作用，例如ZNF205、NEU2、NAT9、SVOPL、COQ9、BTN2A1、PYCR1、EP300、SEC61G、NDUFA9、RAD51AP1、COX20、MAPK6、WDR62、LRGUK、CDK6、KIAA1683、CRISP3、GRPR、DPH7、GEMIN8、KIAA1407、RFXAP、SMARRCA4、CCDC147、AACS、CDK9、C7ORF26、ZDHHC14、RNUT1、GAB1、EMC3、FAM96A、FAM36A、LOC55831、LOC136306、DEFB126、MGC955、EPHX2、SRGAP1、PPP5C、MET、SELM、TSPYL2、TSARG6、NDUFB2、PLAU、FLJ36888、ADORA2B、FLJ22875、HMMR、NRK、LRIT3、FLJ44691、GPR154、ZGPAT、DRD1、FLJ27505、EDG5、SNRNP40、HPRP8BP、GPA33、JDP2、FLJ20010、FOXJ1、SCT、CHD1L、SULT1C1、STN2、MRS2L、RAD51AP1、DPH7、CLPP、ZNF37、AP3B2、DEGS2、PIR、D2LIC、CNTF、PAM、MYH9、PRPF4、SLC4A11、LRRCC1、FZD9、GPR43、LTF、ARIH1、PIK3R3、PTGFRN、HSPA5BP1、ZDHHC16、KIAA1764、C19ORF14、FLNA、FLJ32786、DKFZP434K046、C9ORF112和/或PIR51。通常，功能核酸被设计为基于靶分子与功能核酸分子之间的序列互补性而与其他核酸相互作用。在其他情况下，功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列互补性，而是基于三级结构的形成，其允许进行特异性识别。

反义分子被设计为通过规范或非规范碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用被设计成通过例如RNA酶介导的RNA-DNA杂合降解来促进靶分子的破坏。或者，将反义分子设计成中断通常在靶分子上发生的加工功能，例如转录或复制。可以基于靶分子的序列设计反义分子。存在通过找到靶分子的最易接近区域来优化反义效率的多种方法。示例性方法是体外选择实验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选的是反义分子以小于或等于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的解离常数(kd)结合靶分子。

适体是优选地以特定方式与靶分子相互作用的分子。通常，适体是长度为15-50个碱基的小核酸，其折叠成限定的二级和三级结构，例如茎环或G-四联体。适体可以结合小分子，例如ATP(美国专利5,631,146)和茶碱，以及大分子，例如逆转录酶和凝血酶。适体可以与来自目标分子的小于10^-12M的kds非常紧密地结合。优选的是，适体以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的k_d结合靶分子。适体可以非常高度的特异性结合靶分子。例如，已经分离了适体，其在靶分子和仅在分子上的单个位置不同的另一分子之间的结合亲和力之间的差异大于10000倍(美国专利5,543,293)。优选的是，适体与靶分子的k_d比与背景结合分子的k_d低至少10、100、1000、10000或100000倍。例如，当对多肽进行比较时，优选的是背景分子是不同的多肽。

核酶是能够在分子内或分子间催化化学反应的核酸分子。因此，核酶是催化核酸。优选的是核酶催化分子间反应。基于自然体系中发现的核酶，有许多不同类型的核酶可催化核酸酶或核酸聚合酶类型的反应，例如锤头状核酶、发夹状核酶和四膜核酶。还有许多在自然体系中没有发现的核酶，但是其被设计成可以从头催化特定的反应。优选的核酶切割RNA或DNA底物，更优选切割RNA底物。核酶通常通过识别和结合靶底物并随后进行切割来切割核酸底物。这种识别通常主要基于规范或非规范的碱基对相互作用。该特性使得核酶特别地为用于核酸的靶标特异性切割的良好候选，因为靶底物的识别是基于靶底物序列。

形成三链体的功能性核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶区域相互作用时，会形成称为三链体的结构，其中存在三条DNA链形成依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对的复合物。三链体分子是优选的，因为它们可以高亲和力和特异性结合靶区域。优选的是形成三链体的分子以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的kd结合靶分子。

外部引导序列(EGS)是与形成复合物的靶核酸分子结合的分子，并且该复合物被RNase P识别，其裂解靶分子。可以将EGS设计为特异性靶向所选的RNA分子。RNAse P有助于处理细胞内的转移RNA(tRNA)。可以通过使用引起靶RNA:EGS复合物以模仿天然tRNA底物的EGS，招募细菌RNAse P来切割几乎任何RNA序列。

2.核酸递送

在上述方法中，包括向受试者的细胞或细胞中施用和摄取外源DNA或RNA(即，基因转导或转染)，所公开的核酸可以是裸露的DNA或RNA形式，或者核酸可以在用于将核酸递送至细胞的载体中，由此DNA或RNA片段处于启动子的转录调控下，如本领域普通技术人员将很好地理解的。载体可以是可商购的制剂，例如腺病毒载体(Quantum Biotechnologies,Inc.(Laval,加拿大魁北克)。可以通过多种机制将核酸或载体递送至细胞。作为一个实例，递送可以使用市售脂质体制剂，例如LIPOFECTIN,LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL,Inc.,马里兰州盖瑟斯堡)、SUPERFECT(Qiagen,Inc.德国希尔登)和TRANSFECTAM(Promega Biotec,Inc.,威斯康辛州麦迪逊)以及根据本领域标准程序开发的其他脂质体，通过脂质体进行。另外，所公开的核酸或载体可以通过电穿孔在体内递送，其技术可从Genetronics,Inc.(加利福利亚州圣地亚哥)以及通过SONOPORATION机器(ImaRx Pharmaceutical Corp.,亚利桑那州图森)获得。

作为一个实例，载体递送可以通过病毒系统，例如可以包装重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统(参见，例如，Pastan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4486,1988；Miller等人，Mol.Cell.Biol.6:2895,1986)。然后，可以将重组逆转录病毒用于感染并由此将编码广泛中和抗体(或其活性片段)的核酸递送至被感染的细胞。当然，将改变的核酸引入哺乳动物细胞的确切方法不限于使用逆转录病毒载体。对于该方法，其他技术是广泛可用的，包括使用腺病毒载体(Mitani等人，Hum.Gene Ther.5:941-948,1994)、腺相关病毒(AAV)载体(Goodman等人，Blood84:1492-1500,1994)、慢病毒载体(Naidini等人，Science 272:263-267,1996)、假型逆转录病毒载体(Agrawal等人，Exper.Hematol.24,738-747(1996))。也可以使用物理转导技术，例如脂质体递送和受体介导的以及其他内吞机制(参见，例如，Blood 87:472-478,1996)。该公开的组合物和方法可以与这些或其他常用的基因转移方法中的任何一种结合使用。

a)将组合物递送至细胞

有许多组合物和方法可用于在体外或体内将核酸递送至细胞。这些方法和组合物可大致分为两类：基于病毒的递送系统和基于非病毒的递送系统。例如，可以通过许多直接递送系统递送核酸，例如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒、或通过遗传物质在细胞或载体如阳离子脂质体中的转移。用于转染的合适方法包括化学转染子或物理机械方法，例如DNA的电穿孔和直接扩散。这样的方法在本领域中是众所周知的，并且容易地适用于本文所述的组合物和方法。在某些情况下，将修改这些方法以使其与大的DNA分子特异性结合。此外，通过使用载体的靶向特征，这些方法可用于靶向某些疾病和细胞种群。

b)基于核酸的递送系统

转移载体可以是用于将基因递送到细胞(例如，质粒)中的任何核苷酸构建体，或作为递送基因的一般策略的一部分(例如，作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分)。

病毒载体是，例如，腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、艾滋病病毒、神经营养性病毒、辛德毕斯和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的这些病毒。还优选的是共用这些病毒特性的任何病毒家族，这些病毒家族使其适合用作载体。逆转录病毒包括鼠马洛尼白血病病毒、MMLV和表达作为载体的MMLV的理想特性的逆转录病毒。逆转录病毒载体比其他病毒载体能够携带更大的遗传有效载荷，即转基因或标记基因，因此是常用的载体。然而，它们在非增殖细胞中没有用。腺病毒载体相对稳定、易于使用、滴度高，并且可以气溶胶制剂形式递送，并且可以转染非***细胞。痘病毒载体很大，有几个***基因的位点，它们是热稳定的，并且可以在室温下保存。

与将基因引入细胞的化学或物理方法相比，病毒载体可具有更高的交易(引入基因的能力)能力。通常，病毒载体包含非结构早期基因、结构晚期基因、RNA聚合酶III转录物，复制和衣壳化所必需的反向末端重复序列，以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当被设计成载体时，病毒通常去除一个或多个早期基因，并且将一个基因或基因/启动子盒代替去除的病毒DNA***病毒基因组。这种类型的构建体可携带高达约8kb的外来遗传物质。去除的早期基因的必需功能通常由细胞系提供，所述细胞系经工程改造以反式表达早期基因的基因产物。

c)逆转录病毒载体

逆转录病毒是属于逆转录病毒科病毒家族的动物病毒，包括任何类型、亚科、属或趋性(例如，慢病毒)。通常，逆转录病毒载体由Verma,I.M.描述，用于基因转移的逆转录病毒载体。

逆转录病毒本质上是在其中包装了核酸货物的包装。核酸货物与它一起带有包装信号，其可确保将复制的子分子有效包装在包装外壳中。除了包装信号外，顺式还需要许多分子来复制和包装复制的病毒。典型地，逆转录病毒基因组包含gag、pol和env基因，其与蛋白外壳的制备有关。正是gag、pol和env基因通常被外源DNA取代，将其转移至靶细胞。逆转录病毒载体通常包含包装信号，用于掺入到包装外壳中，该序列指示gag转录单位的开始，逆转录必需的元件，包括结合逆转录tRNA引物的引物结合位点、指导DNA合成过程中RNA链的转换的末端重复序列、富含嘌呤的5’到3’LTR序列(用作合成DNA合成的第二条链的起始位点)，和LTR末端附近的特定序列，其能实现逆转录病毒DNA状态的***以***宿主基因组。去除gag，pol和env基因允许将约8kb的外源序列***病毒基因组，变为逆转录的，并在复制后包装成新的逆转录病毒颗粒。取决于每个转录物的大小，该核酸量足以递送一个至多个基因。优选在***物中包括正或负选择性标记以及其他基因。

由于大多数逆转录病毒载体中的复制机制和包装蛋白均已被去除(gag，pol和env)，因此通常通过将其放入包装细胞系中来产生载体。包装细胞系是已经用含有复制和包装机制但没有任何包装信号的逆转录病毒转染或转化的细胞系。当携带选择的DNA的载体被转染到这些细胞系中时，含有感兴趣的基因的载体通过辅助细胞顺式提供的机制被复制并包装成新的逆转录病毒颗粒。用于机制的基因组未被包装，因为它们缺少必要的信号。

d)腺病毒载体

已经描述了复制缺陷型腺病毒的构建。使用这些病毒作为载体的益处是，它们可以传播到其他细胞类型的程度受到限制，因为它们可以在初始感染的细胞内复制，但不能形成新的感染性病毒颗粒。已显示重组腺病毒在体内直接递送至气道上皮、肝细胞、血管内皮、中枢神经系统薄壁组织和许多其他组织部位后，可实现高效的基因转移。重组腺病毒通过与特定的细胞表面受体结合来实现基因转导，此后该病毒通过受体介导的内吞作用被内在化，其方式与野生型或复制缺陷型腺病毒相同。

病毒载体可以是基于已经去除了E1基因的腺病毒的载体，这些病毒体在诸如CHO和HEK293细胞系的细胞系中产生。在另一个优选的实施例中，E1和E3基因均从腺病毒基因组中去除。

e)腺相关病毒载体

另一种类型的病毒载体基于腺相关病毒(AAV)。这种有缺陷的细小病毒是优选的载体，因为它可以感染许多细胞类型，并且对人类无致病性。AAV型载体可以转运约4至5kb，而已知野生型AAV可以稳定地***到19号染色体中。包含此位点特异性整合性质的载体是优选的。该类型载体的一个特别优选的实施例是由Avigen,San Francisco,Ca生产的P4.1C载体，它可以包含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk和/或标记基因，例如编码绿色荧光蛋白GFP的基因。

在另一种类型的AAV病毒中，AAV包含一对反向末端重复序列(ITR)，其位于至少一个含有启动子的盒的侧面，所述启动子指导与异源基因可操作地连接的细胞特异性表达。在本上下文中，异源是指对于AAV或B19细小病毒不是天然的任何核苷酸序列或基因。

通常，AAV和B19编码区已被删除，形成了安全的无细胞毒性的载体。AAV ITR或其修饰赋予感染性和位点特异性整合，但不赋予细胞毒性，且启动子指导细胞特异性表达。对于与AAV载体有关的材料，通过引用将美国专利号6,261,834并入本文。

因此，所公开的载体提供了能够整合到哺乳动物染色体中而没有实质毒性的DNA分子。

病毒和逆转录病毒中***的基因通常包含启动子和/或增强子，以帮助控制期望的基因产物的表达。启动子通常是在相对于转录起始位点处于相对固定位置时起作用的一个或多个DNA序列。启动子包含RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以包含上游元件和响应元件。

f)大有效载荷病毒载体

用大型人疱疹病毒进行的分子遗传实验提供了一种手段，借此可以在允许疱疹病毒感染的细胞中克隆、繁殖和建立大的异源DNA片段。这些大型DNA病毒(单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦巴尔病毒(EBV))具有将>150kb的人类异源DNA片段递送至特定细胞的潜力。EBV重组体可以将感染的B细胞中的大块DNA保持作为附加体DNA。携带高达330kb的人类基因组***片段的单个克隆在遗传上似乎是稳定的。这些附加体的维持需要特定的EBV核蛋白EBNA1，该蛋白在用EBV感染期间组成性表达。另外，这些载体可以用于转染，其中可以在体外瞬时产生大量蛋白质。疱疹病毒扩增子系统还被用于包装>220kb的DNA片段，并感染可以稳定地将DNA保持为附加体的细胞。

其他有用的系统包括，例如，复制型和宿主限制性非复制型痘苗病毒载体。

g)基于非核酸的系统

所公开的组合物可以多种方式递送至靶细胞。例如，可以通过电穿孔，或通过脂转染或通过磷酸钙沉淀来递送组合物。选择的递送机制将部分取决于靶向细胞的类型以及递送是在例如体内还是体外进行。

因此，组合物可包含，例如，脂质，例如脂质体，例如阳离子脂质体(例如，DOTMA、DOPE、DC胆固醇)或阴离子脂质体。如果需要，脂质体可以进一步包含促进靶向特定细胞的蛋白质。可以将包含化合物和阳离子脂质体的组合物的施用施用至靶器官的血传入或吸入呼吸道以靶向呼吸道的细胞。此外，可以将化合物作为微囊的组分施用，该微囊可以靶向特定的细胞类型，例如巨噬细胞，或者其中化合物的扩散或化合物从微囊的递送被设计用于特定的速率或剂量。

在上述方法中，其包括将外源DNA施用和摄取到受试者的细胞中(即，基因转导或转染)，可以通过多种机制将组合物递送至细胞。作为一个实例，递送可以使用市售脂质体制剂，例如LIPOFECTIN,LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL,Inc.,马里兰州盖瑟斯堡)、SUPERFECT(Qiagen,Inc.德国希尔登)和TRANSFECTAM(Promega Biotec,Inc.,威斯康辛州麦迪逊)以及根据本领域标准程序开发的其他脂质体，通过脂质体进行。另外，所公开的核酸或载体可以通过电穿孔在体内递送，其技术可从Genetronics,Inc.(加利福利亚州圣地亚哥)以及通过SONOPORATION机器(ImaRx Pharmaceutical Corp.,亚利桑那州图森)获得。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)。它们可能通过抗体、受体或受体配体靶向于特定的细胞类型。这些技术可以用于多种其他特定的细胞类型。“隐形”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的针对结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内小鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向等载体。一般来说，受体参与内吞作用的途径，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白所包被的小窝中，通过网格蛋白所包被的囊泡进入细胞，通过对受体进行分类的酸化的核内体，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，例如营养吸收、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解以及受体水平的调节。许多受体遵循多于一种的细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度和配体类型、配体价和配体浓度。

递送至待整合到宿主细胞基因组中的细胞的核酸通常包含整合序列。这些序列通常是病毒相关序列，尤其是在使用基于病毒的系统时。这些病毒整合系统也可以掺入将要使用基于非核酸的递送系统如脂质体进行递送的核酸中，使得递送系统中包含的核酸可以整合到宿主基因组中。

整合到宿主基因组中的其他通用技术包括，例如，设计成促进与宿主基因组同源重组的系统。这些系统通常依赖于要表达的核酸侧翼的序列，该序列与宿主细胞基因组内的靶序列具有足够的同源性，从而在载体核酸和靶核酸之间发生重组，使递送的核酸整合入宿主基因组。促进同源重组所必需的这些系统和方法是本领域技术人员已知的。

3.表达系统

递送至细胞的核酸通常包含表达控制系统。例如，病毒和逆转录病毒系统中***的基因通常包含启动子和/或增强子，以帮助控制期望的基因产物的表达。启动子通常是在相对于转录起始位点处于相对固定位置时起作用的一个或多个DNA序列。启动子包含RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以包含上游元件和响应元件。

a)病毒启动子和增强子

控制哺乳动物宿主细胞中载体转录的优选启动子可从多种来源获得，例如，病毒基因组，例如：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒，乙型肝炎病毒，最优选巨细胞病毒，或来自异源哺乳动物的启动子，例如β肌动蛋白启动子。方便地获得SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段，其也包含SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以方便地以HindIII E限制性片段的形式获得。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用于本文。

增强子通常是指在距转录起始位点不固定距离处起作用的DNA序列，并且相对转录单位可以是5’或3'。此外，增强子可以在内含子内以及在编码序列本身内。它们的长度通常在10至300bp之间，并且它们以顺式起作用。增强子起作用以增加附近启动子的转录。增强子通常还包含介导转录调控的反应元件。启动子还可以包含介导转录调控的反应元件。增强子通常决定基因表达的调控。虽然现在从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中已知许多增强子序列，但通常会使用来自真核细胞病毒的增强子进行一般表达。优选的实例是在复制起点的后侧(bp 100-270)上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。

在某些实施例中，启动子和/或增强子区域可以用作组成型启动子和/或增强子，以最大化要转录的转录单位区域的表达。因此，在本文公开的一个实施例中是重组细胞，其包含一种或多种微小RNA和至少一种编码核酸的免疫球蛋白，其中微小Rna的表达是组成性的。在这种情况下，微小RNA可以与组成型启动子可操作地连接。在某些构建体中，启动子和/或增强子区域在所有真核细胞类型中均具有活性，即使它仅在特定时间在特定类型的细胞中表达。这种类型的优选启动子是CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子是SV40启动子，巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTR。

在其他实施例中，启动子和/或增强子区域可以充当诱导型启动子和/或增强子，以调节待转录的转录物区域的表达。启动子和/或增强子可以被光、温度或触发其功能的特定化学事件特异性激活。系统可以通过诸如四环素和***的试剂进行调节。还存在通过暴露于辐射(例如，γ辐射)或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达的方法。诱导型启动子系统的其他实例包括但不限于GAL4启动子、Lac启动子、Cre重组酶(例如，在cre-lox诱导系统中)、金属调节的系统，例如金属硫蛋白、Flp-FRT重组酶、醇脱氢酶I(alcA)启动子和类固醇调节系统，例如***受体(ER)和糖皮质激素受体(GR)。诱导型系统也可以包括诱导型茎环表达系统。因此，在本文公开的一个实施例中是重组细胞，其包含一种或多种微小RNA和至少一种编码核酸的免疫球蛋白，其中微小RNA的表达是诱导型的。

已经表明，可以克隆所有特异性调控元件，并用于构建在特定细胞类型例如黑素瘤细胞中选择性表达的表达载体。胶质原纤维乙酸蛋白(GFAP)启动子已用于在胶质来源的细胞中选择性表达基因。

真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体也可能包含终止转录所必需的序列，这可能会影响mRNA的表达。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的未转译部分中转录为聚腺苷酸化片段。3’非转译区还包括转录终止位点。优选地，转录单元还包含聚腺苷酸化区域。该区域的一个益处是，它增加了转录单位像mRNA一样被加工和运输的可能性。在表达构建体中多腺苷酸化信号的鉴定和使用已被很好地建立。优选地，在转基因构建体中使用同源的聚腺苷酸化信号。在某些转录单位中，聚腺苷酸化区衍生自SV40早期聚腺苷酸化信号，并且由约400个碱基组成。还优选的是转录的单元单独或与上述序列组合包含其他标准序列，以改善构建体的表达或稳定性。

b)标记物

病毒载体可以包括编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定基因是否已被递送至细胞并且一旦被递送就被表达。优选的标记基因是大肠杆菌(E.Coli)lacZ基因，它编码β半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白。

在一些实施例中，标记可以是选择性标记。哺乳动物细胞的合适选择性标记的实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当这样的选择性标记成功地转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择性压力下，则转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的不同类别的选择制度。第一类是基于细胞的新陈代谢和突变细胞系的使用，该突变细胞系缺乏独立于补充培养基生长的能力。两个实例是：CHO DHFR细胞和小鼠LTK细胞。这些细胞缺乏不添加诸如胸苷或次黄嘌呤的营养物的生长能力。由于这些细胞缺乏完整核苷酸合成途径必需的某些基因，因此除非在补充培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们将无法生存。补充培养基的替代方法是将完整的DHFR或TK基因导入缺乏相应基因的细胞中，从而改变其生长要求。未用DHFR或TK基因转化的单个细胞将无法在非补充培养基中存活。

第二类是显性选择，其是指在任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞将表达传递耐药性的蛋白质，并使选择存活下来。这种显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸或潮霉素。这三个实例采用了在真核生物对照下的细菌基因来分别传递对适当药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的耐药性。其他包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。

4.序列相似性

应当理解，如本文所讨论的，术语“同源性”和“同一性”的使用与“相似性”是相同的意思。因此，例如，如果在两个非天然序列之间使用单词同源性，应当理解，这不一定表示这两个序列之间的进化关系，而是在查看其核酸之间的相似性或相关性。用于确定两个进化相关分子之间的同源性的许多方法常规地应用于任何两个或多个核酸或蛋白质，以测量序列相似性，而不管它们是否是进化相关的。

一般而言，应当理解，定义本文公开的基因和蛋白质的任何已知变体和衍生物或可能出现的那些的一种方法是通过依据与特定已知序列的同源性定义变体和衍生物。本文公开的特定序列的这种同一性也在本文其他地方讨论。通常，本文公开的基因和蛋白质的变体通常具有至少约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的与所述序列或天然序列的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质或核酸，例如基因的同源性。例如，可以在比对两个序列之后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。

计算同源性的另一种方法可以通过公开的算法进行。用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.MoL Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)的相似性搜索法，通过这些算法的计算机化实现(威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group,575Science Dr.,威斯康辛州麦迪逊)，或通过检验来进行。

应当理解，通常可以使用任何方法，并且在某些情况下，这些不同方法的结果可能不同，但是本领域技术人员理解，如果使用这些方法中的至少一种找到同一性，则该序列将被认为具有所述同一性，并在本文公开。

例如，如本文所用，被列举为与另一序列具有特定百分比同源性的序列是指具有通过上述任何一种或多种计算方法计算出的所列举的同源性的序列。例如，如果使用Zuker计算方法计算出第一序列与第二序列具有80％的同源性，则即使通过任何其他计算方法计算的，第一序列与第二序列不具有80％的同源性，第一序列与第二序列仍具有80％的同源性，如本文所定义。作为另一个实例，如果使用Zuker计算方法以及Pearson和Lipman计算方法计算出第一序列与第二序列具有80％的同源性，则即使通过Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法，或任何其他计算方法计算的，第一序列与第二序列不具有80％的同源性，第一序列与第二序列仍具有80％的同源性，如本文所定义。作为又一个实例，如果使用每种计算方法计算出第一序列与第二序列具有80％的同源性，则第一序列与第二序列具有80％的同源性，如本文所定义(尽管，在实践中，不同的计算方法通常会导致不同的计算的同源性百分比)。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示组分的数量、分子量等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非另外规定相反的情况，否则本说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据寻求通过本发明获得的所需性质而变化。至少，并非试图将等同原则限制在权利要求的范围之内，每个数字参数应至少根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。

所有专利、专利申请和出版物的完整公开以及本文引用的可电子获取的材料(包括例如，GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，和GenBank和RefSeq中来自带注释的编码区的转译)以全部内容通过引用合并在此。出版物中引用的补充材料(例如，补充表、补充图、补充材料和方法，和/或补充实验数据)同样以全部内容通过引用合并。在本申请的公开与通过引用并入本文的任何文件的公开之间存在任何不一致的情况下，以本申请的公开为准。仅出于清楚理解的目的给出了前面的详细描述和实例。由此不应该理解不必要的限制。本发明不限于所示出和描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求书限定的本发明之内。

提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示范并且非旨在限制公开。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度为C或或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

5.实例1

a)方法

在繁殖期间，将MA 104和Vero细胞均保持在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Thermo Fisher Scientific,Cat.#Sh30243.01)，该培养基补充有10％小牛血清(HyClone,Cat.#Sh30396.03)并含有1％青霉素-链霉素(Cellgro,Cat.#30-004-CI)。MA-104细胞系用于初步筛选。Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)从亚特兰大的疾病控制和预防中心(CDC)接收。

对于siRNA转染，在96孔板中以14,000MA 104细胞/孔将On-TARGETplus(OTP)-siRNAs(Dharmacon Products)以50nM的0.4％DharmaFECT4(DF4,Dharmacon)的溶液的最终siRNA浓度转染到MA 104细胞中。为此，首先将DF4在无血清培养基(OPTI-MEM)中稀释5分钟。然后，将该物质添加到含有5μl的1μM的siRNA溶液的96孔培养板中。然后，在将细胞添加到补充有10％小牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培养基中之前，将DF4-siRNA混合物孵育20分钟(室温)。然后，将转染的细胞在37℃，5％CO2下培养48小时。随后，除去培养基，将孔在1xPVBS中洗涤3次，并使用在含2％小牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM中稀释的轮状病毒RV3菌株以0.1MOI感染细胞。为了进行初步筛选，在病毒感染后24小时将含有被病毒感染的MA 104细胞的平板从培养箱中取出，并固定用于FFN测定。每个板还包含多个对照，包括：1)siTox(Dharmacon)，2)siNon-靶向对照(Dharmacon)，3)轮状病毒特异性siRNA作为靶向RV3NSP2的阳性对照，和4)模拟对照。

为了进行验证实验，遵循了利用Vero P细胞的类似方案。简言之，将OTP-siRNAs以在0.4％DF4中的50nM的最终siRNA浓度反向转染到Vero P细胞中，每孔有7500个细胞。如上所述，在将转染试剂添加到含有5ul的1μM siRNA溶液的96孔培养板中之前，将DF4在无血清OPTI-MEM中稀释5分钟。然后，将DF4-siRNA混合物在室温下孵育20分钟，然后在补充有10％小牛血清的DMEM中添加Vero P细胞。然后，将转染的细胞在37℃，5％CO₂下培养48小时。然后除去培养基，并使用在含有2％小牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM中稀释的RV3轮状病毒株以0.2MOI染细胞。48小时后，从培养物中取出含有病毒感染的Vero P细胞的板，并如前所述进行测定。

(1)沉默试剂siRNA

ON-TARGETplus siRNA(OTP-siRNA)文库(Dharmacon)用于初步RNAi筛选。OTP沉默试剂以靶向每个基因的siRNA池的形式提供。每个池包含4个靶向开放阅读框(ORF)不同区域的siRNA。siRNA池设计为靶向该基因的所有剪接变体，因此，在其中鉴定特定登录号的情况下，应当理解该基因的所有变体均被siRNA靶向。

对于反卷积验证实验，分别测试包含OTP池的每个siRNA，以确定是否有两个或多个siRNA产生观察到的表型。

(2)细胞活力测定和细胞增殖测定

为了检查siRNA的转染是否通过诱导细胞毒性而对筛选结果产生负面影响，将TOXILIGHT^TM生物测定法(LONZA Inc.)纳入初步筛选和命中验证研究。TOXILIGHT^TM是一种非破坏性生物发光细胞毒性测定法，旨在测量培养的哺乳动物细胞和细胞系中的毒性。通过在siRNA转染48小时后评估培养上清液，采用定量测量受损细胞中的腺苷酸激酶(AK)释放的方法。为了检查敲低已鉴定的靶基因是否影响细胞生长，使用CELLTITER

测定法(PROMEGA Inc.,Kit cat.#G3580)来确定活细胞数量。与其他MTT测定法相比，CELLTITER测定法已显示出更高的信号灵敏度和稳定性。在本文提供的研究中，siRNA转染后48或72小时，将CELLTITER

测定法检测的底物直接添加到培养板中。在37℃下孵育4小时后，在OD495 nm处测量培养物吸光度。

(3)轮状病毒FFN测定法

siRNA转染后两天，将MA104细胞用活化的轮状病毒感染24小时。随后，除去上清液并固定细胞，然后进行免疫荧光ELISA。为了进行免疫荧光染色，将固定的板用PBS洗涤2次，然后在室温下封闭1小时(0.05％的含BSA的PBST)。在室温下以每孔50ul加入在封闭液中的一级多克隆兔抗轮状病毒第一抗体(Rab A-SA11,澳大利亚)，持续1小时。之后，除去一级溶液，并在室温下洗涤板(用0.05％PBST洗涤4次)，然后添加荧光标记的第二抗体(山羊/抗兔Alexa 488，每孔50ul)，持续1小时。然后，洗涤板(用PBST洗涤两次，用PBS洗涤两次)，并用Beckman Coulter Paradigm分光光度计在488波长下读数。对于初始屏幕，将荧光读数归一化，并选择显示Z评分为3.0或更高的命中进行验证。

(4)HTS筛选中使用的数据分析方法：

在当前的MA104 siRNA筛选中，在用siRNAs转染的所有96孔板中，靶向RV3{RV3特异性(NSP2-842)}的阳性对照siRNA和阴性对照(非靶向siRNA)可以明显地彼此区分。siTOX是一种细胞毒性序列，可作为转染效率的指标，并将模拟对照用作背景归一化。使用Z’因子评估质量控制，其中Z’因子得分在0.5至1.0之间表示高度可靠的测定，而0至0.5之间被认为是可以接受的(参见Zhang等人，1999)。Z评分≥3.0SD的命中被移至程序的第二阶段，即验证。

6.实例2：一级筛选结果

使用上述技术，筛选来自人类基因组的>18200个基因，包括来自蛋白酶、离子通道、泛素、激酶、磷酸酶、GPCR和药物靶标集合的基因，以鉴定可增强轮状病毒复制的基因敲低事件。图1显示了从一级筛选获得的Z评分的图。如图所示，总基因敲低事件中只有一小部分的得分与平均值相等或大于2.9标准差(SD)(表1.76个基因，占所筛选基因总数的0.41％)。该集合中包含的基因分布在多个功能家族(激酶、蛋白酶、磷酸酶等)中，并包含了以前未鉴定为“抗病毒”的大量靶标。

表I.沉默时增加轮状病毒抗原/病毒产量的基因列表。从PubMed检索的登录号。

该表提供了从NCBI资源数据库获得的基因符号、一级筛选SD值和NCIB核苷酸登录号。

7.实例3：Vero细胞中基因敲低的作用的验证

为了确定在一级筛选中鉴定的基因敲低事件是否增强了疫苗生产细胞系中RV3的产生，在Vero细胞中重复了研究。简而言之，将用靶向76个基因中的每个基因的siRNA池转染的Vero细胞感染RV3，然后回收上清液并通过ELISA进行评估。图2显示了Vero中前20位的命中，并证明了在一级MA 104筛选中鉴定的命中在第二细胞系(Vero)中诱导了相似的表型。

8.实例4：池反卷积验证研究

作为验证的另一个步骤，评估了增加Vero细胞中RV产生的一级筛选命中，以确定它们是真阳性还是假阳性。在RNAi研究领域中众所周知，siRNA可以诱导假阳性表型。证明命中是真正阳性的一种方法是证明靶向靶基因中不同位置的多个单个siRNA诱导相同的“病毒滴度增加”表型。为了评估这一点，将一级筛选中使用的siRNA池分为四种单独的试剂，并在Vero细胞中重新测试。为此，用RV3病毒感染转染了单个siRNA的Vero细胞，并使用ELISA评估培养上清液中是否存在病毒。

表3列出了Vero研究中前20位的命中的结果(实例3)。在所有情况下，对于正在研究的每个基因，两个或多个siRNA都会诱导“抗原/病毒的增加”表型。这些发现，结合这些基因的KD增加了两种不同细胞类型(MA 104和Vero)中抗原/病毒产量的观察结果，强烈表明这些靶标是真正的阳性。

表3.前20个基因靶标上siRNA池反卷积研究。

报告了基因符号和增加产量的单个siRNA的数量。

9.实例5：Vero细胞中基因敲低水平的评估

对在实例4中鉴定的前十个命中进行定量PCR，以确定抗原/病毒表型的增加与基因表达的抑制之间是否存在相关性。为了达到这个目的，用靶向每个感兴趣的基因的siRNA池转染Vero细胞。随后，从每种培养物中分离出RNA，并通过标准定量PCR方法对转录本进行定量。

如图3所示，siRNA的引入将每个基因的表达抑制了多达90％。这些结果提供了基因抑制与RV3抗原/病毒产量增加之间的强相关性。

10.实例6：基因敲除对各种轮状病毒菌株的病毒复制的评估

为了评估基因敲除的效果，将Vero细胞或包含WDR62基因或LRGUK基因的敲除的细胞系以0.2MOI感染Rotarix 3天或5天。在用Rotarix感染后3天(图5A)，相对于Vero对照细胞，包含WDR62或LRGUK基因敲除的细胞显示感染细胞的数量的显著增加。WDR62敲除细胞的产量比包含LRGUK基因敲除的细胞高约10倍。感染后第5天，LRGUK基因敲除细胞中的轮状病毒感染的细胞的数量增加的速度比WDR62细胞中更快，使得WDR62敲除中的感染细胞的数量现在比LRGUK基因敲除细胞中高出不到2倍。使用兔抗RV抗原并在感染后3天(图6A)和5天(图6B)测量血清中的病毒水平，证实了该数据。用两个其他具有几乎可比结果的轮状病毒菌株CD9(图7和图8)和116E(图9和图10)重复实验。