阅读说明：本技术 一种3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的合成方法及其在抗氧化方面的应用 (Synthesis method of 3 ', 4 ', 5 ', 6, 7, 8-hexahydroxy isoflavone and application thereof in antioxidation ) 是由 景临林 张冬梅 马慧萍 邵瑾 赵彤 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了3′,4′,5′,6,7,8-六羟基异黄酮的合成方法,该方法包括以下步骤：(1)大豆苷元与溴素在乙醇介质及80～90℃下反应得到3′,5′,6,8-四溴-4′,7-二羟基异黄酮；(2)步骤(1)的产物与甲基化试剂反应得到3′,5′,6,8-四溴-4′,7-二甲氧基异黄酮；(3)步骤(2)的产物在亚铜盐作用下与甲醇钠反应,得到3′,4′,5′,6,7,8-六甲氧基异黄酮；(4)3′,4′,5′,6,7,8-六甲氧基异黄酮脱甲基,得到所述的3′,4′,5′,6,7,8-六羟基异黄酮。该化合物具有优异的抗氧化活性。本发明起始原料来源丰富,反应条件温和,步骤短、产率高,易于工业化生产。(The invention discloses a method for synthesizing 3 ', 4 ', 5 ', 6, 7, 8-hexahydroxy isoflavone, which comprises the following steps: (1) reacting daidzein and bromine in an ethanol medium at 80-90 ℃ to obtain 3 ', 5 ', 6, 8-tetrabromo-4 ', 7-dihydroxyisoflavone; (2) reacting the product obtained in the step (1) with a methylating agent to obtain 3 ', 5 ', 6, 8-tetrabromo-4 ', 7-dimethoxy isoflavone; (3) reacting the product obtained in the step (2) with sodium methoxide under the action of cuprous salt to obtain 3 ', 4 ', 5 ', 6, 7, 8-hexamethoxyisoflavone; (4) demethylating the 3 ', 4', 5 ', 6, 7, 8-hexamethoxyisoflavone to produce said 3', 4 ', 5', 6, 7, 8-hexahydroxyisoflavone. The compound has excellent antioxidant activity. The method has the advantages of rich source of the initial raw materials, mild reaction conditions, short steps, high yield and easy industrial production.)

一种3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的合成方法及其在抗氧 化方面的应用

技术领域

本发明属于药物合成领域，具体涉及一种3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的合成方法及其在抗氧化方面的应用。

背景技术

异黄酮类化合物是植物的次生代谢产物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗糖尿病、抗辐射、抗缺血再灌注损伤以及神经保护等广泛的生理活性，而这些有益的药理作用大多归因于其优异抗氧化活性，其能够通过抑制和清除自由基和活性氧来避免氧化损伤(Nat.Prod.Rep，2019，36(8)：1156-1195)。研究指出：异黄酮结构中羟基取代基是清除自由基的活性基团，羟基的数量、取代位置和取代形式对活性具有重要影响(Int J Mol Sci，2015，16(6)：12891-12906)。

3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的结构式如下：

分子结构中含有6个酚羟基，理论上应该具有优异的抗氧化活性，但是该化合物为新结构化合物，在天然产物中并不存在，目前尚无对其制备方法和抗氧化活性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有优异抗氧化活性的多羟基异黄酮及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种多羟基异黄酮，其具有如下化学结构式：

化学名称为3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮。

一种3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的合成方法，包括以下步骤：

(1)大豆苷元与溴素在乙醇介质及80～90℃下反应得到3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮，其中，所述大豆苷元与溴素的摩尔比为1∶5～7；

(2)3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮与甲基化试剂反应得到3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮；

(3)3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮在亚铜盐作用下与甲醇钠反应，得到3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧基异黄酮；

(4)3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧基异黄酮脱甲基，得到所述的3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮。

优选地，所述甲基化试剂为硫酸二甲酯或碳酸二甲酯。

优选地，所述亚铜盐为溴化亚铜、碘化亚铜和/或氯化亚铜。

优选地，步骤(2)的具体过程包括：将3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮、碳酸钾和甲基化试剂在有机溶剂中混合反应得到3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮，3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮∶碳酸钾∶甲基化试剂的摩尔比为1∶2～3∶2～3，反应温度为60～70℃。

优选地，步骤(3)的具体过程包括：将3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮与有机溶剂混合，加热到110～130℃，在搅拌下加入亚铜盐和过量的甲醇钠，反应得到3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧异黄酮其中，所述3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮与亚铜盐的摩尔比为1∶4～6。

优选地，步骤(4)的具体过程包括：将氯化铝悬浮于有机溶剂中，冷却至0～8℃，缓慢滴加二甲基硫醚，混匀，加入3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧异黄酮，升温，于20～30℃反应得到3′，4′，5′，6，7，8-六羟异黄酮，氯化铝、二甲基硫醚和3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧异黄酮摩尔比为15～20∶15～20∶1。

优选地，所述有机溶剂为丙酮、二氯甲烷或者N，N-二甲基甲酰胺。

本发明以来源丰富的大豆苷元为起始原料，经过溴代、甲基化、甲氧基化和去甲基化四步反应得到3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮，总产率达到60％以上(以大豆苷元计)。本发明合成方法具有反应条件温和，产率高，易于工业化生产的优势。产物纯度经UPLC监测大于99.0％，可用于药理活性研究。

为了阐明化合物的抗氧化活性，本发明利用DPPH·自由基清除实验、超氧阴离子(O₂ ^-·)清除实验和一氧化氮(NO)清除实验三种方法对其抗氧化活性进行了考察，结果发现：3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮对DPPH·，O₂ ^-·和NO的其IC₅₀值分别为0.831mmol/L，0.034mmol/L和0.122mmol/L，而阳性药V_C对DPPH·，O₂ ^-·和NO的IC₅₀值分别为1.675mmol/L，0.482mmol/L和1.641mmol/L。上述结果表明：3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮对三种自由基的清除活性远大于V_C，具有优异的抗氧化活性。

附图说明

图1是3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的核磁共振氢谱。

图2是3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的核磁共振碳谱。

图3是3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的高分辨质谱。

图4是3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的UPLC色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的制备

(1)3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮的合成

将大豆苷元(10mmol，2.5g)悬浮于150mL无水乙醇中，搅拌下滴加3.0mL液溴，滴加完毕后，升温至80～90℃反应1h。沸腾条件下缓慢滴加水，直至反应体系不变红为止。然后加入200mL水，加热至沸腾后，静置放冷，过滤，滤饼干燥后得白色固体5.5g，为3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮，产率为96％。m.p.＞320℃。IR(KBr，v)：3439，3085，1637，1615，1593，1432，1293，1283，1179，1075，855cm^-1。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：10.14(s，2H，C4′-OH)，8.66(s，1H，C2-H)，8.18(s，1H，C5-H)，7.80(s，2H，C2′-H，C6′-H)。¹³C-NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ：173.55(C4)，156.50(C7)，155.28(C4′)，153.41(C9)，151.07(C2)，132.86(C5)，128.47(C2′，6′)，125.96(C1′)，121.37(C3)，118.77(C10)，112.00(C3′，5′)，110.44(C8)，100.21(C6)。HR-MS(ESI)m/z：Calcd for C₁₅H₆Br₄O₄([M+H]⁺)570.7041，found 570.7031。

为考查溶剂对本反应的影响，参照文献(闫巧.3′，4′，5′，7，8-五羟基异黄酮的合成与体外抗氧化活性研究[D].兰州.兰州大学，2019)中制备3′，5′，8-三溴-4′，7-二羟基异黄酮的方法，采用二氯甲烷和乙醇混合溶剂作为本反应的溶剂，发现即使升高温度及增加溴素用量，经TLC分析，只有20％可以转化为本发明的3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮，而且两种溴代产物溶解度较差，无法通过常规柱层析分离。

在本发明的上述溴代反应条件下，采用4′，7-二甲氧基异黄酮(即大豆苷元的二甲基化产物)无法得到3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮。

(2)3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮的合成

将3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二羟基异黄酮(5mmol，2.85g)和碳酸钾(15mmol，2.07g)悬浮于100mL丙酮中，室温加入1.5mL硫酸二甲酯(15mmol)，60℃回流反应6h。TLC监测，反应完全后，用25％氨水淬灭反应，加20mL水，减压除去丙酮，再加水200mL，并用盐酸调PH为酸性后，过滤，滤饼干燥后，悬浮于50mL乙酸乙酯中，加热沸腾5min，热过滤，滤饼用少量热乙酸乙酯洗涤，干燥得白色絮状固体2.84g，为3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮，产率为95％。m.p.209.5～210.3℃。IR(KBr，v)：2944，2830，1653，1615，1543，1471，1428，1408，1268，1232，870，846，741，659cm^-1。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.46(s，1H，C2-H)，8.10(s，1H，C5-H)，7.71(s，2H，C2′-H，C6′-H)，4.02(s，3H，CH₃O)，3.92(s，3H，CH₃O)。¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：173.71(C4)，159.03(C7)，154.44(C4′)，153.54(C9)，153.18(C2)，132.90(C5)，129.61(C2′，6′)，129.36(C1′)，122.90(C3)，122.42(C10)，118.33(C6)，115.89(C3′，5′)，108.05(C8)，61.20(CH₃O)，60.74(CH₃O)。HR-MS(ESI)m/z：Calcd for C₁₇H₁₀Br₄O₄([M+H]⁺)598.7354，found 598.7344。

(3)3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧基异黄酮的合成

将溴化亚铜(1.43g，10mmol)悬浮4mL DMF中，室温避光搅拌30min，加入50mL新配制的25％(w/v)的甲醇钠/甲醇溶液，继续避光搅拌1h，备用。将3′，5′，6，8-四溴-4′，7-二甲氧基异黄酮(119mg，2mmol)悬浮于DMF 2mL中，加热到120℃后加入上述储备液，继续反应4h。停止反应，冷却至室温时将反应液倒入到2M盐酸(40mL)液中，减压除去甲醇，水相用乙酸乙酯萃取(3×50mL)，合并有机相，用100mL饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压除去乙酸乙酯后通过硅胶柱层析[洗脱剂：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝1/1]分离纯化得白色针状晶体563mg，为3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧基异黄酮，产率为70％。m.p.164.2-165.4℃。IR(KBr，v)：3092，2945，2843，1634，1585，1467，1423，1320，1247，1127，845cm^-1。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.08(s，1H，C2-H)，7.47(s，1H，C5-H)，6.81(s，2H，C2′-H，C6′-H)，4.06(s，3H，CH₃O)，4.05(s，3H，CH₃O)，3.97(s，3H，CH₃O)，3.91(s，6H，CH₃O)，3.89(s，3H，CH₃O)。¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：175.48(C4)，153.22(C2)，152.56(C3′，5′)，151.39(C7)，147.29(C6)，145.80(C9)，141.75(C8)，138.13(C4′)，127.37(C1′)，124.48(C3)，120.33(C10)，106.25(C2′，6′)，100.31(C5)，62.05(CH₃O)，61.48(CH₃O)，60.89(CH₃O)，56.27(CH₃O)，56.21(2个CH₃O)。HR-MS(ESI)m/z：Calcd for C₂₁H₂₂O₈([M+H]⁺)403.1387，found403.1393。

(4)3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮的合成

将氯化铝(1.33g，10mmol)悬浮无水二氯甲烷(15mL)，冷却至5℃，缓慢滴加700μL二甲基硫醚，继续搅拌0.5h，加入3′，4′，5′，6，7，8-六甲氧基异黄酮(242mg，0.6mmol)，将反应体系置于室温，反应12h。停止反应，冷却到0℃，加入10％(w/w)盐酸(30mL)溶液，搅拌2h，减压除去二氯甲烷，过滤，滤饼用甲醇/水体系重结晶，得白色固体188mg，为3′，4′，5′，6，7，8-六羟基异黄酮，产率为90％。m.p.＞320℃。IR(KBr，v)：3437，3230，1607，1540，1485，1372，1335，1297，1033，843cm^-1。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ：8.22(s，1H，C2-H)，7.00(s，1H，C5-H)，6.53(s，2H，C2′-H，C6′-H)。¹³C-NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ：175.11(C4)，152.57(C2)，146.10(C3′，5′)，144.92(C9)，141.81(C7)，140.08(C6)，134.14(C8)，133.38(C4′)，123.23(C1′)，123.00(C3)，116.72(C10)，108.50(C2′，6′)，99.02(C5)。HR-MS(ESI)m/z：Calcd forC₁₅H₁₀O₈([M+H]⁺)319.0453，found 319.0448。UPLC∶流动相为CH₃OH∶H₂O(CH₃COOH)＝20∶80(0.01％)(v/v)，保留时间为4.25min，流速为0.2mL/min。

实施例2

DPPH自由基清除实验

将50μL不同浓度(0.0625-2.0mmol/L)的样品中分别加入150μL的0.2mMDPPH自由基-乙醇溶液，并将该体系置于黑暗处室温放置30min，使用酶标仪测定所得溶液在517nm处的吸光度(A₂)；测定50μL不同样品溶液与150μL乙醇溶液的吸光度(A₁)；测定50μL DMSO溶液与150μL DPPH自由基-乙醇溶液的吸光度(A₀)。以抗坏血酸(V_C)作为阳性对照。所有样品进行三次重复。使用公式(1)计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(％)＝(A₀-(A₂-A₁)/A₀)×100， (1)

抗氧化活性以IC₅₀(mmol/mL)值表示。EC₅₀值被称为DPPH自由基清除率为50％的样品浓度。通过基于浓度和抑制率获得的线性方程式计算EC₅₀。较低的EC₅₀值对应较高的抗氧化剂活性。

表1 DPPH清除实验结果

实施例3

超氧阴离子自由基清除实验

将50μL的0.2mM NBT溶液，50μL的0.5mM NADH溶液溶剂为PH＝8.0的0.1M Tris-HCl)加入到100μL不同浓度(0.01625-1.0mmol/L)的样品中，振荡混合后加入50μL的25μMPMS溶液。将混合体系在室温下反应10min，使用酶标仪测量所得溶液在570nm处的吸光度(A₂)；测定50μL NBT溶液，50μL NADH溶液，100μL不同样品与50μL水溶液的吸光度(A₁)；测定50μL NBT溶液，50μL NADH溶液，100μLDMSO与50μL PMS溶液的吸光度(A₀)。以V_C作为阳性对照。所有样品进行三次重复。

使用公式(1)计算超氧阴离子自由基清除率。

表2超氧阴离子自由基清除实验结果

实施例4

将50μL不同浓度(0.0625-2.0mmol/L)的样品加入到50μL的20mM硝普钠磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中。将该体系在室温光照下反应150min后，加入50μL的0.33％(w/v)对氨基苯磺酸溶液(在20％冰醋酸中)，将其静置10min。然后加入50μL的0.1％(w/v)的萘乙二胺盐酸盐溶液，并将所得溶液进一步反应30min。使用酶标仪测量所得溶液在540nm处的吸光度(A₂)；测定50μL不同样品，50μL磷酸盐缓冲液，50μL对氨基苯磺酸溶液与50μL萘乙二胺盐酸盐溶液的吸光度(A₁)；测定50μL DMSO，50μL硝普钠磷酸盐缓冲液，50μL对氨基苯磺酸溶液与50μL萘乙二胺盐酸盐溶液的吸光度(A₀)。以V_C作为阳性对照。所有样品进行三次重复。

根据公式(1)计算一氧化氮自由基清除率。

表3 NO自由基清除实验结果

3′，4′，5′，7，8-五羟基异黄酮的合成方法可参考以下文献：闫巧.3′，4′，5′，7，8-五羟基异黄酮的合成与体外抗氧化活性研究[D].兰州.兰州大学，2019.

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。