阅读说明：本技术 一种减缓瘤胃微生物分解氨基酸和尿素的天然化合物及其用途 (Natural compound for slowing rumen microorganism from decomposing amino acid and urea and application thereof ) 是由 王加启 赵圣国 郑楠 刘思佳 张震宇 李松励 张养东 于 2018-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于动物饲料添加剂的技术领域,具体涉及一种通过减缓瘤胃微生物分解氨基酸和尿素,减少氨氮生成量,提高瘤胃氮利用率的天然化合物。本发明主要涉及如下式I化合物及其药学上可接受的盐在制备氨基酸脱氨酶和脲酶抑制剂中的应用,<Image he="458" wi="700" file="DDA0001777091990000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>其中,R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>、R<Sub>4</Sub>、R<Sub>5</Sub>相同或不同,彼此独立的选自H、或下列基团：C<Sub>1-12</Sub>烷基、C<Sub>3-20</Sub>环烷基、C<Sub>6-20</Sub>芳基、5-20元杂芳基。(The invention belongs to the technical field of animal feed additives, and particularly relates to a natural compound for reducing ammonia nitrogen generation amount and improving rumen nitrogen utilization rate by slowing down rumen microorganisms to decompose amino acid and urea. The invention mainly relates to an application of a compound shown in the following formula I and pharmaceutically acceptable salts thereof in preparing amino acid deaminase and urease inhibitors, wherein R is 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 Identical or different, independently of one another, from H or the following radicals: c 1‑12 Alkyl radical, C 3‑20 Cycloalkyl radical, C 6‑20 Aryl, 5-20 membered heteroaryl.)

一种减缓瘤胃微生物分解氨基酸和尿素的天然化合物及其 用途

技术领域

本发明属于动物饲料添加剂的技术领域，具体涉及一种减缓瘤胃微生物分解氨基酸和尿素的天然化合物及其用途。

背景技术

反刍动物瘤胃微生物可将部分饲料蛋白质或其他含氮物质降解成氨氮，另一部分饲料蛋白质则被降解成氨基酸和多肽。微生物利用分解产生的氨氮、氨基酸和多肽重新合成微生物蛋白质，被动物利用。瘤胃氨氮过量产生为反刍动物微生物提供无机氮源的同时，也因部分饲料优质蛋白质被降解，造成饲料蛋白质的浪费，而蛋白质原料是饲料中价格比重最大的部分，因此，瘤胃中蛋白质水解和氨基酸的降解在反刍动物生产中表现出相当大的经济损失。另外，尿素过快分解会降低其利用率，氨生成过多过快则与能量不同步，会降低氨的利用率。过量氨氮的产生易导致高尿氮排放引起的环境污染，同时过量的氨通过瘤胃壁进入血液，极易引起动物机体氨应激，甚至氨中毒，危害动物健康。

天然提取物饲料添加剂与传统的饲料添加剂相比，具有天然性、多功能性、可持续性等优势，具有多成分、多功能的特点，它的众多优势和特点是取代传统饲料添加剂的核心。天然提取物饲料添加剂更能符合动物机体功能相互协调和整体统一的规律，作用更具有全面性，同时它多成分协同作用，使得其中某种特定成分含量较低，经炮制和加工后使其毒性(代谢毒性、致畸性、致癌和突变能力)进一步减弱或消除，对动物不会产生明显的副作用，不易产生抗药性，适合长期使用。天然提取物的有效成分均为天然产物，绝大多数是饲料固有的成分，在发挥调节作用的过程中能被动物降解，在畜产品中残留量较少，也不会对生态环境带来危害，安全性好。天然、有机、无残留是未来饲料添加剂的发展方向。天然饲料添加剂作为一种绿色的饲料添加剂，有着广阔的市场前景。

然而，如何使用天然化合物解决上述技术问题，是当前研究的难点和重点。

发明内容

为改善现有技术中存在的问题，本发明提供一种下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅相同或不同，彼此独立的选自H、或下列基团：C_1-12烷基、C_3-20环烷基、C_6-20芳基、5-20元杂芳基。

根据本发明的实施方案，式I所示的化合物中R₂、R₃、R₄、R₅选自H，R₁选自C_1-3烷基。

作为实例，式I化合物选自下式所示的鹰嘴豆素A：

本发明还提供一种药物组合物，包含式I所示的化合物和药学上可接受的辅料。

根据本发明的实施方案，所述药物组合物为氨基酸脱氨酶和/或脲酶抑制剂，例如瘤胃微生物氨基酸脱氨酶和/或脲酶抑制剂。

根据本发明，所述药物组合物中式I所示化合物的质量分数为1-99％，优选为10-90％，还优选为20-80％。

任选地，所述药物组合物还可以进一步包含一种或多种其他活性成分。

根据本发明，所述其他活性成分选自其他瘤胃微生物氨基酸脱氨酶和/或脲酶抑制剂，或者可以增强式I所示的化合物抑制活性的化合物，例如乙酰氧肟酸。

本发明还提供式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。

优选地，所述药物具有抑制瘤胃微生物氨基酸脱氨酶和/或脲酶的活性。

优选地，所述药物用于抑制氨基酸的降解率，例如用于减缓瘤胃微生物分解氨基酸。

优选地，所述药物用于抑制瘤胃中氨氮的生成。

优选地，所述药物用于避免反刍动物瘤胃氨中毒。

优选地，所述药物用于提高瘤胃氮的利用效率。

优选地，所述药物用于促进瘤胃发酵。

根据本发明，所述药物对脲酶，例如瘤胃微生物脲酶的抑制活性以IC50值计为340.82μmol/L。

根据本发明，所述药物可以促进瘤胃发酵，产气量增加1.5％-2.5％。

根据本发明，所述药物可以抑制瘤胃中氨氮的生成，抑制率为21％-28％。

根据本发明，所述药物可以抑制氨基酸(如缬氨酸和/或赖氨酸)的降解率，抑制率为12％-18％。

本发明还提供一种为非治疗目的的抑制微生物氨基酸脱氨酶和/或脲酶的方法，例如抑制瘤胃微生物氨基酸脱氨酶和/或脲酶活性的方法，包括将式I所示的化合物或其药学上可接受的盐施用于反刍动物。

本发明还提供一种为非治疗目的的抑制微生物氨基酸脱氨酶和/或脲酶的方法，例如抑制瘤胃微生物氨基酸脱氨酶和/或脲酶活性的方法，包括将所述药物组合物施用于反刍动物。

有益效果

本申请发明人意外地发现，式I所示的化合物可以同时减缓瘤胃微生物分解氨基酸和尿素的速度，从而避免饲料浪费和反刍动物瘤胃氨中毒，提高了瘤胃氮的利用效率。

术语定义和说明

除非下文另有定义，否则本文所有的术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。如果本文对术语有多个定义，以下文的定义为准。

术语“C_1-12烷基”应理解为表示具有1～12个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，优选为C_1-10烷基。“C_1-10烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3、4、5、6个碳原子(“C_1-6烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子(“C_1-3烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。

术语“C_3-20环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3～20个碳原子，优选“C_3-10环烷基”。术语“C_3-10环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述C_3-10环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。

术语“C_6-20芳基”应理解为优选表示具有6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C_6-14芳基”。术语“C_6-14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环(“C_6-14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C₆芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C₉芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C₁₀芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C₁₃芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C₁₄芳基”)，例如蒽基。

术语“5-20元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5～20个环原子且包含1-5个独立选自N、O、S的杂原子，例如“5-14元杂芳基”。

术语“5-14元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子，特别是5或6或9或10个碳原子，且其包含1-5个，优选1-3个彼此独立选自N、O、S的杂原子并且，另外在每一种情况下可为苯并稠合的。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、***基、噻二唑基、噻-4H-吡唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并***基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基等。

除非另有说明，杂环基、杂芳基或亚杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，吡啶基或亚吡啶基包括吡啶-2-基、亚吡啶-2-基、吡啶-3-基、亚吡啶-3-基、吡啶-4-基和亚吡啶-4-基；噻吩基或亚噻吩基包括噻吩-2-基、亚噻吩-2-基、噻吩-3-基和亚噻吩-3-基。

术语“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。

根据本发明，所述氨基酸的实例可以是缬氨酸和/或赖氨酸。

附图说明

图1为传代中鹰嘴豆素A对瘤胃产气量的影响。

图2为传代中鹰嘴豆素A对氨氮产量的影响。

图3为不同时间点鹰嘴豆素A对总氨基酸降解率的影响。

图4为不同时间点鹰嘴豆素A对缬氨酸和赖氨酸降解率的影响。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的通式化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

1、实验仪器

氨基酸分析仪(日立L-8900)

酶标仪(Thermo Electron Varioskan Flash G-282)

气压计(ConST 211)

2、主要试剂

(1)50mmol/L尿素缓冲溶液：称取0.3g尿素，用去离子水溶解并定容至100mL。

(2)酚-硝普钠溶液：称取10g苯酚和50mg硝普钠(又名亚硝基铁***)，用去离子水溶解并定容至1L。放入棕色瓶中，4℃可保存一个月。

(3)碱性次氯酸钠溶液：将5gNaOH和8.4mL NaClO溶液，用去离子水溶解并定容至1L。放入棕色瓶内，4℃可保存一个月。

(4)10mmol/L NH₄Cl标准溶液：称0.5349NH₄Cl，用去离子水溶解并定容至1L。

(5)50mmol/L HEPES缓冲溶液(pH 7.5)：称取1.19g 4-羟乙基哌嗪磺酸钠(HEPES)，去离子水溶解并定容至100mL，用NaOH调节pH至7.5。

实施例1.鹰嘴豆素A对瘤胃微生物分解氨基酸和尿素的影响

本实施例采用如下步骤：

步骤一，瘤胃液的采集：厌氧条件下，采集早饲前瘘管荷斯坦奶牛(550kg)瘤胃液，奶牛饲喂营养成分(苜蓿干草17.3％，玉米青贮18.7％，豆粕11.3％，菜粕4.2％，棉粕2.1％，膨化大豆2.1％，甜菜渣4.2％，全棉籽10.4％，玉米25.6％，食盐0.5％，预混料3.6％)。瘤胃液经四层纱布过滤去除固体饲料颗粒后，装入含有厌氧保存液的瓶中，置入冰盒迅速带回实验室，-80℃保存。

步骤二，培养基的配制：根据下表1厌氧培养基成分表，制备培养基，CO₂厌氧通气至无色后，调节pH为6.8，在厌氧培养箱中，分装入Hantage厌氧管内，每管10mL。121℃高温灭菌15min。

表1厌氧培养基成分表

溶液1

微量元素

步骤三，鹰嘴豆素A溶液的配制：用DMSO溶解配制鹰嘴豆素A储备液30mg/mL。

在厌氧培养箱中，取2mL鹰嘴豆素A溶液(30mg/mL)，与9mL厌氧稀释液混合，完成配制鹰嘴豆素A工作溶液(6mg/mL)，放置1h，以便除氧。在接种菌时，用注射器吸取鹰嘴豆素A工作溶液(6mg/mL)，过0.22μm滤器，注入含培养基的厌氧管中。

步骤四，富集培养：在厌氧培养箱内，将200μl瘤胃液和50μl鹰嘴豆素A溶液(6mg/mL)混合后，接种到厌氧培养基(10mL)中，同时设置50μl DMSO(相应浓度)作为对照组，每组三个重复，每代共6管。将厌氧培养管放入培养箱内39℃培养24h，作为第一代。吸取200μl培养物和50μl鹰嘴豆素A或DMSO溶液混合后接种到新厌氧培养基，依次培养，传代，传至***24h。

在一至四代，培养24h后，记录产气量，同时采集5mL样品，以12000g，4℃离心10min，移取上清至新的离心管，其中(1.2mL上清+0.12mL 25％偏磷酸(氨氮)；1.5mL上清2份(氨基酸))。将上清液放入-20℃保存，上清用作氨氮分析。

在传至第4代培养24h后，将两个处理组的培养物接种到新的培养瓶中，作为第五代培养。培养瓶中含80mL培养基，分别接种1.5mL***两个处理组的培养物和400μl的0、6mg/mL鹰嘴豆素A溶液。每个处理三个重复。培养后分别在第0、12、16、24h后，采集5mL样品，以12000g 4℃离心10min，移取上清至新的离心管，用作氨基酸组成分析。

步骤五，分别测试传代中鹰嘴豆素A对瘤胃产气量的影响、传代中鹰嘴豆素A对氨氮产量的影响、不同时间点鹰嘴豆素A对总氨基酸降解率的影响和不同时间点鹰嘴豆素A对缬氨酸和赖氨酸降解率的影响。

由图1可以看出瘤胃微生物培养至第3和第4代时，鹰嘴豆素A能显著提高产气量，产气量相对于对照组增加了1.5％-2.5％。

由图2可以看出瘤胃微生物培养至第2、3、4代时，鹰嘴豆素A能显著降低氨氮的生成量，抑制率为21％-28％。

由图3可以看出瘤胃微生物培养过程中氨基酸降解率增加速率逐渐缓慢，因此，鹰嘴豆素A能显著降低氨基酸的降解率，抑制率为12％-18％。而由图4可以看出主要是降低了缬氨酸和赖氨酸的降解率。

实施例2.鹰嘴豆素A抑制瘤胃微生物脲酶活性测试

步骤一：将瘤胃液离心(12000×g，20min，4℃)，沉淀用50mmol/L HEPES缓冲液清洗两次，用1mL 50mmol/L冷的HEPES缓冲液将菌体重悬，瘤胃菌体冰上超声破碎(40％强度，三次，每次30S)，离心(12000×g，10min，4℃)，收集上清液作为酶液，取酶液测蛋白浓度。

步骤二：配制鹰嘴豆素A溶液，溶剂为甲醇，最终浓度为20mg/mL，将离心后的上清液与鹰嘴豆素A溶液按下表2进行混合，

表2

步骤三：加入50mmol/L的尿素缓冲液500μl使终体积为1mL，37℃温育20min。

步骤四：加入1.5mL酚-硝普钠溶液和1.5mL碱性次氯酸钠溶液，混合均匀，37℃温育30min，用分光光度计在625nm处测定吸光度。

步骤五：标准工作曲线的制备

(1)1mmol/L NH₄Cl标准工作曲线溶液：将10mmol/L NH₄Cl标准溶液用水稀释10倍。

(2)按下表3梯度稀释NH₄Cl标准工作溶液。

表3

将每管加入1.5mL酚-硝普钠溶液和1.5mL碱性次氯酸钠溶液，混合均匀，37℃温育30min，用分光光度计在625nm处测定吸光度，制作标准工作曲线。

步骤六：结果分析

脲酶活性定义：每毫克酶蛋白每分钟产生的氨的纳摩尔数[n mol/(min·mg)]

步骤七：IC50值计算

根据不同鹰嘴豆素A浓度条件下，对脲酶活性进行拟合直线，以不添加鹰嘴豆素A为100％，计算酶活50％时的鹰嘴豆素A浓度作为IC50值。实验结果经计算得出鹰嘴豆素A能抑制脲酶活性，其IC50值为340.82μmol/L。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。