阅读说明：本技术 一种3＇，4＇，7-三羟基异黄酮的合成方法 (Synthesis method of 3 ', 4', 7-trihydroxyisoflavone ) 是由 赵勇 景临林 邵瑾 马慧萍 赵彤 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种3′,4′,7-三羟基异黄酮的合成方法。该方法包括：4′,7-二甲氧基异黄酮与溴素在二氯甲烷介质中混合反应,得到3′-溴-4′,7-二甲氧基异黄酮,其中,所述4′,7-二甲氧基异黄酮与溴素的摩尔比为1∶1.1～1.5,反应温度为20～30℃；3′-溴-4′,7-二甲氧基异黄酮在亚铜盐作用下与甲醇钠反应,得到3′,4′,7-三甲氧基异黄酮；3′,4′,7-三甲氧基异黄酮脱甲基,得到所述的3′,4′,7-三羟基异黄酮。与现有技术相比,本发明起始原料来源丰富,反应条件温和,选择性好,产率高,适合工业化生产。(The invention discloses a method for synthesizing 3 ', 4', 7-trihydroxyisoflavone. The method comprises the following steps: mixing 4 ', 7-dimethoxy isoflavone and bromine in a dichloromethane medium for reaction to obtain 3' -bromo-4 ', 7-dimethoxy isoflavone, wherein the molar ratio of the 4', 7-dimethoxy isoflavone to the bromine is 1: 1.1-1.5, and the reaction temperature is 20-30 ℃; reacting 3 '-bromo-4', 7-dimethoxy isoflavone with sodium methoxide under the action of cuprous salt to obtain 3 ', 4', 7-trimethoxy isoflavone; demethylating the 3 ', 4', 7-trimethoxy isoflavone to obtain the 3 ', 4', 7-trihydroxy isoflavone. Compared with the prior art, the method has the advantages of rich source of the initial raw materials, mild reaction conditions, good selectivity and high yield, and is suitable for industrial production.)

一种3′，4′，7-三羟基异黄酮的合成方法

技术领域

本发明属于药物合成领域，具体一种3′，4′，7-三羟基异黄酮的合成方法。

背景技术

异黄酮类化合物是植物的次生代谢产物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗糖尿病、抗辐射、抗缺血再灌注损伤以及神经保护等广泛的生理活性，而这些有益的药理作用大多归因于其优异抗氧化活性，其能够通过抑制和清除自由基和活性氧来避免氧化损伤(Nat.Prod.Rep，2019，36(8)：1156-1195)。研究指出：异黄酮结构中羟基取代基是清除自由基的活性基团，羟基的数量、取代位置和取代形式对活性具有重要影响(Int J Mol Sci，2015，16(6)：12891-12906)。

3′，4′，7-三羟基异黄酮，结构式如下：

该异黄酮具有优异的抗氧化活性，但是其在天然产物中分布较少，而且含量很低，无法从天然产物中大量获得这些化合物。

3′，4′，7-三羟基异黄酮是大豆苷元在体内主要的次级代谢产物之一(J.Agric.Food Chem，2001，49：3024-3033)，具有抗炎、抗凋亡(Evid.-BasedComplementary Altern.Med，2013，636597)、抗原虫(Nat.Prod，2006，69(1)：43-49)、抗菌(Lett Appl Microbiol，2015，60，(3)：242-247)、抗增殖(J.Biol.Chem.2010，M109：094797)、抗肿瘤(Toxicology，2012，302(2-3)：221-232)、抑制皮肤癌(J.Biol.Chem，2011，286(16)：14246-14256)、减肥(Eur.Food Res.Technol，2014，240(4)：865-869)等活性，还可用作抗特应性皮炎(Planta Med，2020，86(3)：190-197)，抗黑素瘤和皮肤美白(BioorgMed Chem Lett，2010，20(3)：1162-1164)以及去污(Int J Nanomedicine，2018，13：3279-3293)等皮肤护理剂。近期研究表明，其还具有神经保护(Biomol Ther(Seoul)，2019，27(4)：363-372)和提高记忆力的作用(Food Chem.Toxicol，2020，137：111160)。

目前获得3′，4′，7-三羟基异黄酮的手段较少，主要有以下几种：Goto(Chem PharmBull(Tokyo).2009，57(4)：346-360)等以间苯二酚和3，4-二羟基苯乙酸为原料，在BF₃·Et₂O催化下，发生脱水反应，然后在MeSO₂Cl-DMF体系中，发生脱氧安息香反应，生成3′，4′，7-三羟基异黄酮，虽然总产率可以达到65％，但是反应中需要使用易燃，有毒，具有强烈的刺激性和强烈腐蚀性的BF₃·Et₂O。Roh等采用阿维链霉菌MA-4680对大豆苷元进行区域选择性羟化，生成7，3′，4′-三羟基异黄酮(Journal of BioscieJournal of Bioscience andBioengineering，2009，108(1)：41-46)。而Changhyun等使用纯化的CYP105D7酶，通过恶臭假单胞菌的氧化还原物NADH催化大豆苷元，生成7，3′，4′-三羟基异黄酮(Molecules，2013，18(3)：3028-3040)。但这些方法的反应条件苛刻，转化率较低，分离纯化困难。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适于工业生产的3′，4′，7-三羟基异黄酮的合成方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种3′，4′，7-三羟基异黄酮的合成方法，包括以下步骤：

(1)4′，7-二甲氧基异黄酮与溴素在二氯甲烷介质中混合反应，得到3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮，其中，所述4′，7-二甲氧基异黄酮与溴素的摩尔比为1∶1.1～1.5，反应温度为20～30℃；

(2)3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮在亚铜盐作用下与甲醇钠反应，得到3′，4′，7-三甲氧基异黄酮；

(3)3′，4′，7-三甲氧基异黄酮脱甲基，得到所述的3′，4′，7-三羟基异黄酮。

优选地，所述亚铜盐为溴化亚铜、碘化亚铜和/或氯化亚铜。

优选地，4′，7-二甲氧基异黄酮可通过以方法得到：将大豆苷元或者刺芒柄花素、碳酸钾和甲基化试剂在有机溶剂中混合反应，得到所述的4′，7-二甲氧基异黄酮，其中，大豆苷元∶碳酸钾∶甲基化试剂的摩尔比为1∶2～3∶2～3，刺芒柄花素∶碳酸钾∶甲基化试剂的摩尔比为1∶1～2∶1～2，反应温度为60～70℃。

具体地，将20mmol大豆苷元和40mmol碳酸钾悬浮于160～240mL丙酮中，并加入40mmol硫酸二甲酯，60℃反应9～11h。冷却到用300～500μL 25％(w/w)氨水淬灭反应，加80～120mL水，并用浓HCl调pH为酸性后减压除去丙酮，过滤后用纯化水洗涤至中性，干燥得4′，7-二甲氧基异黄酮。

或者，将20mmol刺芒柄花素和20mmol碳酸钾悬浮于160～240mL丙酮中，并加入20mmol硫酸二甲酯，60℃反应9～11h。冷却到用300～500μL 25％(w/w)氨水淬灭反应，加80～120mL水，并用浓HCl调pH为酸性后减压除去丙酮，过滤后用纯化水洗涤至中性，干燥得4′，7-二甲氧基异黄酮。

优选地，所述甲基化试剂为硫酸二甲酯或碳酸二甲酯。

优选地，步骤(2)的反应过程包括：将3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮与有机溶剂混合，加热到110～130℃，然后加入亚铜盐和过量的甲醇钠，反应得到3′，4′，7-三甲氧基异黄酮，其中，所述3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮与亚铜盐的摩尔比为1∶1～1.5。

优选地，步骤(3)的反应过程包括：将氯化铝悬浮于有机溶剂中，冷却至0～8℃，缓慢滴加二甲基硫醚，混匀，加入3′，4′，7-三甲氧基异黄酮，升温，于20～30℃反应得到3′，4′，7-三羟基异黄酮，氯化铝、二甲基硫醚和3′，4′，7-三甲氧基异黄酮的摩尔比为7～9∶7～9∶1。

优选地，所述有机溶剂为丙酮、乙腈、二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。

更具体地，3′，4′，7-三羟基异黄酮的合成方法包括如下步骤，

(1)将10mmol 4′，7-二甲氧基异黄酮悬浮于40～60mL无水二氯甲烷中，室温搅拌下滴加11～15mmol液溴后反应25～35min，停止反应，加水130～170mL，用亚硫酸氢钠还原未反应的溴，减压除去二氯甲烷后，过滤，滤饼用纯化水洗涤，避光干燥后用乙酸乙酯/石油醚混合溶液重结晶，得3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮。

(2)将4～6mmol亚铜盐悬浮于3～5mL无水DMF中，20～30℃避光搅拌25～35min，加入20～40mL 25％的甲醇钠/甲醇溶液，继续避光搅拌0.8～1.2h，备用。将4mmol步骤1所得3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮和3～5mL DMF加热到110～130℃，搅拌加入上述备用液，继续反应2～5h，冷却至室温后，将反应液倒入到30～50mL的2M盐酸溶液中，减压除去溶剂，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压除去乙酸乙酯后通过硅胶柱层析分离纯化得3′，4′，7-三甲氧基异黄酮。

(3)将1.5～1.8mmol氯化铝悬浮于8～12mL无水二氯甲烷中，冷却至0～8℃，缓慢滴加1.5～1.8mmol二甲基硫醚，搅拌20～30min，加入0.2mmol步骤2所得3′，4′，7-三甲氧基异黄酮，升温至20～30℃继续反应5～8h。停止反应，冷却到0～4℃，加入10％(w/w)盐酸溶液搅拌2h，减压除去二氯甲烷，过滤，滤饼用甲醇/水体系重结晶得3′，4′，7-三羟基异黄酮。

本发明以来源丰富的大豆苷元或者刺芒柄花素为起始原料，经过甲基化、溴代、甲氧基化和去甲基化四步反应得到多羟基异黄酮3′，4′，7-三羟基异黄酮和3′，4′，7，8-四羟基异黄酮，总收率达到60％(以大豆苷元或刺芒柄花素计)。4′，7-二甲氧基异黄酮与溴素在二氯甲烷中反应生成3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮，选择性好，产率高，如果将该反应的反应溶剂换成乙醇或乙醇与二氯甲烷的混合溶液，即使严格控制溴素的用量和反应温度，要么反应不完全，要么得到的是3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮和3′，8-二溴-4′，7-二甲氧基异黄酮的混合物，且该混合物几乎无法分离得到单一产物。

本发明合成方法具有反应条件温和，产率高，易于工业化生产的优势。产物纯度经UPLC监测大于99.0％，可用于药理活性研究。

附图说明

图1是3′，4′，7-三羟基异黄酮的UPLC色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

3′，4′，7-三羟基异黄酮的制备

4′，7-二甲氧基异黄酮的合成

将大豆苷元(20mmol，5.08g)和碳酸钾(40mmol，5.52g)悬浮于200mL丙酮中，并加入7.6mL硫酸二甲酯(40mmol)，60℃反应12h。TLC监测，反应完全后，用400μL 25％氨水淬灭反应，加100mL水，并用HCl调PH为酸性后减压除去丙酮，过滤后用纯化水洗涤至中性，干燥得白色粉末5.53g，为4′，7-二甲氧基异黄酮，产率为98％。

将刺芒柄花素(20mmol，5.36g)和碳酸钾(20mmol，2.76g)悬浮于200mL丙酮中，并加入3.8mL硫酸二甲酯(20mmol)，60℃反应12h。TLC监测，反应完全后，用400μL 25％氨水淬灭反应，加100mL水，并用HCl调PH为酸性后减压除去丙酮，过滤后用纯化水洗涤至中性，干燥得白色粉末5.47g，为4′，7-二甲氧基异黄酮，产率为97％。

m.p.162.5～163.0℃。IR(KBr，v)：2956，2833，1632，1607，1513，1438，1293，1250，1204，1176，1030，881，839cm^-1。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.21(d，J＝8.8Hz，1H，C5-H)，7.91(s，1H，C2-H)，7.52(d，J＝8.8Hz，2H，C2′-H，C6′-H)，6.99～6.95(m，3H，C6-H，C3′-H，C5′-H)，6.84(d，J＝2.4Hz，1H，C8-H)，3.90(s，3H，CH₃O)，3.83(s，3H，CH₃O)。¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：175.83(C4)，163.95(C7)，159.56(C4′)，157.94(C9)，152.04(C2)，130.12(C2′，6′)，127.77(C5)，124.85(C3)，124.24(C1′)，118.42(C10)，114.52(C6)，113.95(C3′，5′)，100.08(C8)，55.82(CH₃O)，55.34(CH₃O)。MS(ESI)m/z：283.1([M+H]⁺)。

(1)3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮的合成

将4′，7-二甲氧基异黄酮(10mmol，2.82g)悬浮于50mL无水二氯甲烷中，室温搅拌下滴加0.61mL液溴后反应30min，TLC监测，原料无剩余，停止反应，加水150mL，用亚硫酸氢钠还原未反应的溴，减压除去二氯甲烷后，过滤，滤饼用纯化水洗涤，避光干燥后用乙酸乙酯/石油醚混合溶液重结晶，得白色絮状物3.25g，为3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮，产率为90％。m.p.184.3～187.0℃。IR(KBr，v)：2941，2836，1628，1591，1498，1439，1286，1257，1244，1050，802cm^-1。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.20(d，J＝8.8Hz，1H，C5-H)，7.92(s，1H，C2-H)，7.75(d，J＝2.0Hz，1H，C2′-H)，7.54(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H，C6′-H)，7.01～6.95(m，2H，C6-H，C8-H)，6.86(d，1H，J＝2.4Hz，1H，C5′-H)，3.93(s，3H，CH₃O)，3.92(s，3H，CH₃O)。¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：175.49(C4)，164.09(C7)，157.93(C9)，155.78(C4′)，152.30(C2)，133.49(C2′)，129.27(C6′)，127.75(C5)，125.64(C1′)，123.72(C3)，118.29(C10)，114.71(C6)，111.76(C5′)，111.57(C3′)，100.14(C8)，56.34(CH₃O)，55.86(CH₃O)。HR-MS(ESI)m/z：Calcd for C₁₇H₁₃BrO₄([M+H]⁺)361.0070，found 361.0076。

(2)3′，4′，7-三甲氧基异黄酮的合成

将溴化亚铜(715mg，5mmol)和2mL DMF室温避光搅拌30min，加入50mL新配制的25％(w/v)甲醇钠/甲醇溶液，继续搅拌1h，备用。将3′-溴-4′，7-二甲氧基异黄酮(1.8g，5mmol)和5mL DMF，将其加热到120℃后加入上述备用液，反应2h。停止反应，冷却至室温，将反应液倒入到2M的盐酸(50mL)液中，减压除去溶剂，水相用乙酸乙酯萃取(3×50mL)，合并有机相，用50mL饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压除去乙酸乙酯后通过硅胶柱层析[洗脱剂：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)＝3/1]分离纯化得白色针状晶体1.09g，为3′，4′，7-三甲氧基异黄酮，产率为70％。m.p.162.3～163.1℃。IR(KBr，v)：3067，3003，2938，2840，1630，1600，1520，1442，1262，1211，1169，1151，1023，840，821cm^-1。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.22(d，J＝8.8Hz，1H，C5-H)，7.94(s，1H，C2-H)，7.22(d，J＝2.0Hz，1H，C2′-H)，7.06(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H，C6′-H)，7.01(dd，J＝8.8Hz，2.4Hz，1H，C6-H)，6.93(d，J＝2.4Hz，1H，C5′-H)，6.86(d，J＝2.4Hz，1H，C8-H)，3.93(s，3H，CH₃O)，3.91(s，3H，CH₃O)，3.91(s，3H，CH₃O)。¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：175.87(C4)，164.00(C7)，157.91(C9)，152.22(C2)，149.09(C4′)，148.76(C3′)，127.74(C5)，124.91(C1′)，124.66(C3)，121.02(C6′)，118.40(C10)，114.59(C6)，112.51(C2′)，111.15(C5′)，100.11(C8)，55.97(CH₃O)，55.95(CH₃O)，55.84(CH₃O)。MS(ESI)m/z：313.1([M+H]⁺)。

(3)3′，4′，7-三羟基异黄酮的合成

将氯化铝(300mg，2.5mmol)悬浮于无水二氯甲烷中(12mL)，冷却至5℃，缓慢滴加182μL二甲基硫醚后，搅拌0.5h，再加入3′，4′，7-三甲氧基异黄酮(93.9mg，0.3mmol)，将反应体系置于室温，反应6h。TLC监测，基本反应完全。停止反应，冷却到0℃，加入10％(w/w)盐酸(10mL)溶液，继续搅拌2h，减压除去二氯甲烷，过滤，滤饼用甲醇/水体系重结晶，得白色针状晶体77mg，为3′，4′，7-三羟基异黄酮，产率为95％。m.p.280～281℃。IR(KBr，v)：3334，3119，1626，1573，1442，1394，1290，1255，1219，860em^-1。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：10.78(s，1H，C7-OH)，9.02(s，1H，C4′-OH)，8.97(s，1H，C3′-OH)，8.25(s，1H，C2-H)，7.99(d，1H，J＝8.8Hz，C5-H)，7.04(s，1H，C2′-H)，6.95(dd，J＝8.8，2.0Hz，1H，C6-H)，6.86(s，1H，C8-H)，6.83(d，J＝8.4Hz，1H，C6′-H)，6.79(d，J＝8.0Hz，1H，C5′-H)。¹³C-NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ：175.13(C4)，162.91(C7)，157.81(C9)，153.23(C2)，145.71(C4′)，145.23(C3′)，127.76(C5)，124.07(C3)，123.45(C1′)，120.30(C6′)，117.11(C2′)，117.05(C10)，115.74(C5′)，115.55(C6)，102.53(C8)。MS(ESI)m/z：271.1([M+H]⁺)。UPLC∶流动相为甲醇∶水(乙酸)＝40∶60(0.01％)，保留时间为6.05min，流速为0.2mL/min。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。