一种芒柄花素衍生物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种芒柄花素衍生物及其制备方法和应用 (Formononetin derivative and preparation method and application thereof ) 是由 罗晓东 王兆杰 赵云丽 闫晓君 代智 何英杰 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物合成技术领域,提供了一种芒柄花素衍生物及其制备方法和应用。本发明基于具有抗骨质疏松活性天然植物雌激素,提供了一类以芒柄花素为母核的衍生物；该衍生物对破骨细胞具有抑制活性,同时能促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,并激活成骨细胞骨形成能力；可以促进成骨细胞相关基因的表达,进而改善破骨和成骨的平衡；还能增加骨密度异常个体中的骨密度的水平,升高骨体积分数异常个体中的骨体积分数,调整骨表面积与骨体积比值异常个体中的骨表面积与骨体积比值,在制备预防或治疗成骨细胞异常引起的疾病或病症的药物中具有广阔的应用前景。(The invention relates to the technical field of drug synthesis, and provides an formononetin derivative and a preparation method and application thereof. The invention provides a derivative taking formononetin as a mother nucleus based on natural phytoestrogen with anti-osteoporosis activity; the derivative has inhibitory activity on osteoclast, and can promote bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblast and activate bone formation ability of the osteoblast; can promote the expression of osteoblast related genes, thereby improving the balance of osteoclast and osteogenesis; the compound preparation can also increase the level of bone density in individuals with abnormal bone density, increase the number of bone volume in individuals with abnormal bone volume number, and adjust the ratio of the bone surface area to the bone volume in individuals with abnormal ratio of the bone surface area to the bone volume, and has wide application prospect in preparing medicaments for preventing or treating diseases or symptoms caused by abnormal osteoblasts.)
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，尤其涉及一种芒柄花素衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis)是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。骨质疏松症分为原发性和继发性二大类。原发性骨质疏松症多见于老年人和绝经后女性，特发性骨质疏松症目前病因仍未明确，继发性骨质疏松症是由于其他疾病或药物等原因引起。正常骨代谢处于骨形成(成骨细胞osteoblast)和骨流失(破骨细胞osteoclast)平衡，二者补充和协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。年龄增长、雌激素减少和药物干扰，导致成骨细胞活性降低，破骨细胞活性增强，骨形成速度远远低于骨流失，因此导致骨密度降低、骨量减少和骨质改变(包括宏观和微观结构的改变以及骨质特性的改变)，引发骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢性疾病。
骨质疏松症是常见的慢性疾病之一，也是中老年人群最常见的骨骼疾病。调查显示，我国约2.1亿人具有骨量低的问题，有近7000万骨质疏松患者。全世界约有1/3的女性和1/5的男性会罹患骨质疏松性骨折，每3秒钟就会发生一次骨质疏松性骨折。因此，骨质疏松被称为看不见的杀手。
骨质疏松的治疗药物主要有3类：抑制骨吸收的药物(双膦酸盐类、降钙素类、雌激素类及选择性雌激素受体调节剂)，单一抑制破骨细胞活性，减少骨吸收，但有较强代谢器官(如肾)毒副作用；促进骨形成的药物(甲状旁腺激素类)，促进骨钙入血，提高血液钙含量，促进骨钙吸收和形成，但造成高钙血症的副作用；多重作用机制药物(锶盐、活性维生素D及其类似物、维生素K2)，能够促进骨形成和矿化，并抑制骨吸收，对增加骨密度有益。
人们一直致力于寻求雌激素替代物，期望这种替代物既能缓解骨质疏松，发挥雌激素对各个系统的保护作用，同时又能避免上述副作用。大豆异黄酮类化合物是典型的植物雌激素，包括豆黄素、芒柄花素、依普黄酮、染料木素和黄豆黄苷等。目前基于植物雌激素类化合物在骨质疏松药物中的应用较少，基于现有药物，发现新的化合物对骨质疏松的诊断和治疗具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种芒柄花素衍生物及其制备方法和应用。本发明基于具有抗骨质疏松活性天然植物雌激素，提供了一类以芒柄花素(Formonoetin)为母核的衍生物，其在治疗成骨细胞异常引起的疾病或病症中具有广阔的前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种芒柄花素衍生物，具有式I所示结构：
式I中：
R1为氢、羟基、乙酰氧基、C1-12烷基或C1-12烷氧基；
R2为氢、羟基、乙酰氧基、C1-12烷基或C1-12烷氧基；
R3为1-吡咯烷基、(3-甲基)吡啶烷基、C1-3烷基-吡啶基、(4-乙酰基)-哌嗪基、C1-3烷基-哌嗪基、C1-3烷基-4-(乙酰基)哌嗪基、2-(吲哚-3-基)乙胺基、甲酰基、C1-3烷基-苯乙胺基、C1-3烷基-苄胺基、C1-3烷基-氨基酸残基、氨基酸残基、N,N′-双(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺基、3,4-二羟基苄胺基、苯胺基、苄胺基、4-氟-苄胺基、4-三氟甲基苯胺基、2-(3,4-二羟基苯基)乙胺基、异丙胺基、环己胺基、2-呋喃甲胺基、正丁基氨基、2-羟基乙胺基、3-羧基丙胺基、2-氨基-4-甲酸苯胺基、2-氯-4-硝基苯胺基、1，4-丁二胺基、脲基、N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺基或C1-3烷基-二(C1-12烷基)-氨基；其中所述C1-3烷基-氨基酸残基中的氨基酸残基通过N-C键与母核连接；
或，R2和R3连接形成恶嗪环状结构，此时所述芒柄花素衍生物具有式II所示结构：
式II中：R4为C1-3烷基-苄基、苄基、苯基、C1-3烷基-苯乙基、4-氟苄基、3,4-二羟基苄基、2-(吲哚-3-基)乙基、2-(3,4-二羟基苯基)乙基、环己基、2-呋喃甲基、异丙基、2-氨基-4-甲酸苯基、2-吡啶基、4-硝基-2-氯苯基、4-(三氟甲基)苯基、3-羧基丙基、正丙基、正丁基、2-羟基乙基、C1-3烷基-二(C1-12烷基)、1-氨基-4,9-二氮十二烷基或1-氨基-5-氮辛烷。
优选的，所述R1为氢、羟基、甲氧基或乙酰氧基。
优选的，所述R2为氢、羟基、甲氧基或乙酰氧基。
优选的，所述芒柄花素衍生物具有式I-1、I-2、II-1或II-2所示结构：
式I-1和式I-2中，R3的种类和权利要求1中相同，式II-1和式II-2：R4的种类和权利要求1中相同。
本发明还提供了上述方案所述芒柄花素衍生物的制备方法，当所述芒柄花素衍生物具有式I所示结构时，所述制备方法包括以下步骤：
将具有式a所示结构的化合物、甲醛和第一氨基化合物混合进行反应，得到具有式I所示结构的化合物；所述具有式a所示结构的化合物、甲醛和第一胺类化合物的摩尔比为1:1:1；所述第一胺类化合物的结构中包括伯胺基团或仲胺基团以及R3基团；
当所述芒柄花素衍生物具有式II所示结构时，所述制备方法包括以下步骤：
将具有式b所示结构的化合物、甲醛和第二氨基化合物混合进行反应，得到具有式II所示结构的芒柄花素衍生物；所述具有式b所示结构的化合物、甲醛和第二氨基化合物的摩尔比为1:2:1；所述第二氨基化合物中的结构中包括伯胺基团以及R4基团；
所述式a、式b中的R1、R2基团与式I中一致。
本发明还提供了上述方案所述芒柄花素衍生物或上述方案所述制备方法制备的芒柄花素衍生物在制备预防或治疗成骨细胞异常引起的疾病或病症的药物、制备研究骨质疏松病理机制的试剂、制备评价骨质疏松疗效的试剂中的应用。
优选的，所述药物包括上述方案所述芒柄花素衍生物以及至少一种药用载体或助剂。
优选的，所述药物为片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、膏滋剂、糖浆、酏剂、搽剂或注射剂。
优选的，所述芒柄花素衍生物的日剂量为0.01～100mg/kg体重。
本发明提供了一种芒柄花素衍生物，具有式I或式II所示结构。本发明的设计思路为：以天然植物雌激素为母核，根据活性位点、活性基团与抗骨质疏松症活性的构效关系，通过不同基团的反应，得到不同取代基的衍生物，并进行细胞水平(抑制破骨细胞形成和促骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞)的生物活性测试，对衍生物进行筛选，获得一系列具有活性的化合物。
本发明提供的芒柄花素衍生物对破骨细胞具有抑制活性，同时能促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，并激活成骨细胞骨形成能力；还能促进成骨细胞相关基因，如碱性磷酸酯酶(ALP)、早期因子(sp7)、骨钙桥蛋白(OP)和胰岛素样生长因子(IGF-1)的表达，进而改善破骨和成骨的平衡；本发明提供的芒柄花素衍生物还可以增加骨密度异常个体中的骨密度的水平，升高骨体积分数异常个体中的骨体积分数，调整骨表面积与骨体积比值异常个体中的骨表面积与骨体积比值。
本发明还提供了上述方案所述芒柄花素衍生物的制备方法，本发明通过母核活性位点的Mannich反应，在母核上引入支链，得到本发明的芒柄花素衍生物，合成步骤简单，容易操作。
本发明还提供了上述方案所述芒柄花素衍生物在制备预防或治疗成骨细胞异常引起的疾病或病症的药物、制备研究骨质疏松病理机制的试剂、制备评价骨质疏松疗效的试剂中的应用。本发明提供的芒柄花素衍生物可以用于预防或治疗骨质疏松、骨质增生等成骨细胞异常引起的疾病或病症，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例23中芒柄花素衍生物促进大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向成骨细胞分化的测试结果图；
图2为实施例24中芒柄花素衍生物促进人骨髓间充质干细胞(HMSC)成骨作用的影响；
图3为实施例24中F11、F13以及阳性对照化合物对人骨髓间充质干细胞(HMSC)成骨作用的影响对比图；
图4为豆黄素、芒柄花素、依普黄酮、染料木素、黄豆黄苷和雌二醇的结构；
图5为实施例25中芒柄花素衍生物抑制破骨细胞分化的测试结果图；
图6为实施例26中F11、F13促进成骨细胞碱性磷酸酯酶(ALP)基因表达的测试结果图；
图7为实施例27中F11、F13促进成骨细胞早期因子(sp7)基因表达的测试结果图；
图8为实施例28中F11、F13促进成骨细胞骨钙桥蛋白(OP)基因表达的测试结果图；
图9为实施例29中F11、F13促进成骨细胞胰岛素样生长因子(IGF-1)基因表达的测试结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种芒柄花素衍生物，具有式I所示结构：
式II中：
R1为氢、羟基、乙酰氧基、C1-12烷基或C1-12烷氧基；所述C1-12烷氧基优选为甲氧基，所述C1-12烷基优选为异丙基；
R2为氢、羟基、乙酰氧基、C1-12烷基或C1-12烷氧基；所述C1-12烷氧基优选为甲氧基，所述C1-12烷基优选为异丙基；
R3为1-吡咯烷基、(3-甲基)吡啶烷基、C1-3烷基-吡啶基、(4-乙酰基)-哌嗪基、C1-3烷基-哌嗪基、C1-3烷基-4-(乙酰基)哌嗪基、2-(吲哚-3-基)乙胺基、甲酰基、C1-3烷基-苯乙胺基、C1-3烷基-苄胺基、C1-3烷基-氨基酸残基、氨基酸残基、N,N′-双(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺基、3,4-二羟基苄胺基、苯胺基、苄胺基、4-氟-苄胺基、4-三氟甲基苯胺基、2-(3,4-二羟基苯基)乙胺基、异丙胺基、环己胺基、2-呋喃甲胺基、正丁基氨基、2-羟基乙胺基、3-羧基丙胺基、2-氨基-4-甲酸苯胺基、2-氯-4-硝基苯胺基、1，4-丁二胺基、脲基、N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺基或C1-3烷基-二(C1-12烷基)-氨基；其中所述C1-3烷基-氨基酸残基中的氨基酸残基通过N-C键与母核连接或，R2和R3连接形成恶嗪环状结构，此时所述芒柄花素衍生物具有式II所示结构：
式II中：R4为C1-3烷基-苄基、苄基、苯基、C1-3烷基-苯乙基、4-氟苄基、3,4-二羟基苄基、2-(吲哚-3-基)乙基、2-(3,4-二羟基苯基)乙基、环己基、2-呋喃甲基、异丙基、2-氨基-4-甲酸苯基、2-吡啶基、4-硝基-2-氯苯基、4-(三氟甲基)苯基、3-羧基丙基、正丙基、正丁基、2-羟基乙基、C1-3烷基-二(C1-12烷基)、1-氨基-4,9-二氮十二烷基或1-氨基-5-氮辛烷。
在本发明中，所述芒柄花素衍生物优选具有式I-1、I-2、II-1或II-2所示结构：
式I-1、式I-2、式II-1和式II-2中：R3和R4的种类和上述方案相同。
在本发明中，按照不同的取代基对式I-1、式I-2、式II-1或式II-2中的衍生物进行编号，具体如表1所示：
表1芒柄花素衍生物结构和编号
植物雌激素有类雌激素作用，它是天然存在于一些植物中、具有雌激素效能的化合物，因与雌激素结构类似，可以与体内雌激素受体结合模拟、干扰雌激素的生理生化作用。本发明采用具有一定抗骨质疏松活性的安全天然植物雌激素为母核，根据相关活性及基团的构效关系，得到具有活性位点、活性基团与抗骨质疏松症活性的构效关系，通过不同基团的反应，得到不同取代基的衍生物，并进行细胞水平和动物水平的生物活性测试，得到上述种类的衍生物。本发明提供的上述衍生物衍生物可以调节成骨细胞和破骨细胞代谢异常，调节骨组织中破骨细胞异常个体的成骨和破骨的平衡，抑制破骨细胞分化或者促进成骨细胞分化，在骨质疏松等成骨细胞异常引起的疾病中具有广阔的应用前景。
本发明还提供了上述方案所述芒柄花素衍生物的制备方法，具体的：
当所述芒柄花素衍生物具有式I所示结构时，所述制备方法包括以下步骤：
将具有式a所示结构的化合物、甲醛和第一氨基化合物混合进行反应，得到具有式I所示结构的化合物；所述具有式a所示结构的化合物、甲醛和第一胺类化合物的摩尔比为1:1:1；所述第一胺类化合物的结构中包括伯胺基团或仲胺基团以及R3基团；
所述式a中的R1、R2基团与式I中一致。
在本发明中，所述具有式a所示结构的化合物具体优选为芒柄花素(结构式如式a-1所示)或豆黄素(结构式如式a-2所示)。
在本发明中，所述第一氨基化合物具体根据R3基团的种类进行选择，具体的，当所述R3为甲酰胺时，所述第一氨基化合物为六亚甲基四胺，当所述R3为1-吡咯烷基时，所述第一氨基化合物为吡咯烷；当所述R3为(3-甲基)-吡啶烷基时，所述第一氨基化合物为(3-甲基)-吡啶烷；当所述R3为(4-乙酰基)-哌嗪基时，所述第一氨基化合物为(4-乙酰基)-哌嗪；当所述R3为2-呋喃甲基时，所述第一氨基化合物为2-呋喃甲胺；当所述R3为正丁基氨基时，所述第一氨基化合物为正丁胺；其余不再一一列举，根据本领域技术人员的公知常识进行选择即可。
在本发明中，所述反应用溶剂优选为冰乙酸或二甲基亚砜-甲醇混合溶剂，所述二甲基亚砜-甲醇混合溶剂中二甲基亚砜和甲醇的体积比优选为1:4；所述甲醛优选以甲醛水溶液的形式使用，所述甲醛水溶液的质量分数优选为36％；本发明对所述甲醛水溶液的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的市售甲醛水溶液即可；在本发明的具体实施例中，优选在制备F1时使用冰乙酸为溶剂，制备其他化合物时使用二甲基亚砜-甲醇混合溶剂为溶剂。
在本发明中，所述反应优选在加热回流条件下进行，所述反应的时间优选为6～12h；在本发明的具体实施例中，当采用二甲基亚砜-甲醇混合溶剂为反应溶剂时，优选先将具有式a所示结构的化合物溶解于二甲基亚砜中，将甲醇、甲醛水溶液和第一氨基化合物的混合溶液滴加到式a化合物的溶液中，室温下搅拌混合均匀，然后升温至回流温度进行反应。
在本发明中，制备具有式I所示结构的芒柄花素衍生物的反应式如下：
反应完成后，本发明优选将所得产物料液进行后处理，得到具有式I所示结构的化合物。在本发明中，当使用冰乙酸为溶剂时，所述后处理优选包括以下步骤：向所得产物料液中加入盐酸后搅拌5min，然后冷却至室温，加入水，得到沉淀，收集沉淀，得到粗产物，将所述粗产物进行硅胶柱层析分离，得到具有式I所示结构的化合物。
当以二甲基亚砜-甲醇混合溶剂为溶剂时，所述后处理优选包括以下步骤：将所得产物料液减压蒸去溶剂，有固体析出，将剩余产物过滤后得到粗产物，将所述粗产物进行硅胶柱层析分离，得到具有式I所示结构的化合物；所述硅胶柱层析分离采用的试剂为石油醚-乙酸乙酯混合试剂或石油醚-甲醇-乙酸乙酯混合试剂，所述石油醚-乙酸乙酯混合试剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为2:1，所述石油醚-甲醇-乙酸乙酯混合试剂中石油醚、甲醇和乙酸乙酯的体积比优选为2:1:1。
在本发明中，当所述芒柄花素衍生物具有式II所示结构时，所述制备方法包括以下步骤
将具有式b所示结构的化合物、甲醛和第二氨基化合物混合进行反应，得到具有式II所示结构的芒柄花素衍生物；所述具有式b所示结构的化合物、甲醛和第二氨基化合物的摩尔比为1:2:1；所述第二氨基化合物中的结构中包括伯胺基团以及R4基团；
所述式b中的R1基团与式I中一致。
在本发明中，所述具有式b所示结构的化合物具体优选为芒柄花素或豆黄素，结构式如上文所示。
在本发明中，所述第二氨基化合物具体根据R4基团的种类进行选择，具体的，当所述R4为2-呋喃甲基时，所述第二氨基化合物为2-呋喃甲胺，当所述R4为正丁基时，所述第二氨基化合物为正丁胺；当所述R4为苄基时，所述第二氨基化合物为苄胺；当所述R4为2-(吲哚-3-基)乙基时，所述第二氨基化合物为色胺；其余不再一一列举，根据本领域技术人员的公知常识进行选择即可。
在本发明中，制备具有式II所示结构的芒柄花素衍生物的反应式如下：
在本发明中，当所述芒柄花素衍生物具有式II所示结构时，反应用溶剂、具体操作方法以及反应条件均和制备具有式I所示结构的芒柄花素衍生物时一致，仅是其中甲醛的摩尔量不同，具体条件不再赘述。
下面以F11和F13为例说明本发明的反应原理：
制备F11和F13时，具有式b所示结构的化合物为芒柄花素，结构式如式a-1所示，F11和F13的结构如下：
反应过程中，芒柄花素A环8-C位的活性H与脂肪族伯/仲胺或芳香族伯/仲胺在甲醛水溶液中进行Mannich反应，合成得到Mannich碱衍生物；在伯胺的Mannich反应中，例如苄胺或对甲基苯胺与甲醛的摩尔配比为1:2时，反应产物Mannich碱进一步与甲醛反应生成N-取代羟甲基化合物，再脱水环合，得含六元环的二氢苯并噁嗪衍生物。根据不同取代基团，生成具有直链烷基或取代的直链烷基、环烷基、五元或六元杂环、苯环或含取代基的苯环、氨基的芒柄花素衍生物。
本发明还提供了上述方案所述芒柄花素衍生物或上述方案所述制备方法制备的芒柄花素衍生物在制备预防或治疗成骨细胞异常引起的疾病或病症的药物、制备研究骨质疏松病理机制的试剂、制备评价骨质疏松疗效的试剂中的应用。在本发明中，所述成骨细胞异常引起的疾病或病症具体为骨质疏松或骨质增生，具体是骨缺失所导致的骨质增生、成骨细胞和破骨细胞代谢异常所导致的骨质增生，破骨细胞异常、成骨和破骨不平衡导致的骨质疏松。
在本发明中，所述药物包括上述方案所述芒柄花素衍生物或上述方案所述制备方法制备的芒柄花素衍生物以及至少一种药用载体或助剂。在本发明中，所述药用载体具体是指药学上可接受的载体、药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂；具体的，所述赋形剂优选为水；所述填充剂优选为淀粉和/或蔗糖；所述黏合剂优选为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种；所述润湿剂优选为甘油；所述崩解剂优选为琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的一种或几种；所述吸收促进剂优选为季铵化合物；所述表面活性剂优选为十六烷醇；所述吸附载体优选为高岭土和/或皂黏土；所述润滑剂优选为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的一种或几种。
本发明对所述助剂没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的药用助剂即可，具体如香味剂、甜味剂。
本发明所述的芒柄花素衍生物的药物可通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、膏滋剂、搽剂或注射剂等，制成液体制剂如水、油悬浮剂、糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等；在本发明的具体实施例中，所述药物的形式形式优选为片剂、胶囊和注射剂。
本发明对上述各种衍生物的剂型的制备方法没有特殊要求，按照药学领域的常规生产方法制备即可，如将活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
在本发明的具体实施例中，所述芒柄花素衍生物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等进行确定，具体的，所述芒柄花素衍生物的日剂量优选为0.01～100mg/kg体重，更优选0.01～10mg/kg体重，可以一次或多次施用。
本发明还提供了上述方案所述芒柄花素衍生物在制备研究骨质疏松病理机制的试剂、制备评价骨质疏松疗效的试剂中的应用，所述试剂具体用于：
a)研究植物雌激素Mannich反应的机理和药物改性设计；
b)研究骨代谢异常病理机制；
c)评价抗骨质疏松的效果。
具体的，所述的试剂包括抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化的试剂；促进骨髓间充质干细胞(MSC)向成骨细胞分化的试剂。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：F1的制备
将芒柄花素134.130mg(0.5mmol)和六亚甲基四胺70mg(0.5mmol)溶解于6ml冰乙酸中，室温搅拌至完全溶解，加热回流反应6h，保持100℃，迅速加入2ml 20％的盐酸，搅拌5min，冷却至室温，加入10ml水，得到褐黄色沉淀，收集褐黄色沉淀，得到粗产物，硅胶柱层析分离，，采用的试剂为石油醚-乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比为2:1，Rf为0.11，得到产物F163.5 mg，产率47.31％。
产物的核磁氢谱、碳谱和质谱数据为：
1H-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ10.48(s，1H)，8.48(s，1H)，8.23(d，1H)，7.52(dd，2H)，7.12(dd，2H)，7.01(d，1H)，3.88(s，3H).
13C-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ190.32，174.39，166.36，159.66，157.26，153.51，134.05，130.55，124.60，123.95，116.95，116.38，114.15，112.00，55.46.
质谱(M+H+)：297.1
分子式：C17H13O5
实施例2：F2的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和0.042ml吡咯烷(0.25mmol)]，室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡红色固体，收集淡红色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，采用的试剂为石油醚-甲醇-乙酸乙酯，石油醚、甲醇和乙酸乙酯的体积比为2:1:1，Rf为0.108，得到产物F2，产率7.25％。
产物的核磁氢谱、碳谱和质谱数据为：
1H-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ8.35(s，1H)，7.91(d，1H)，7.49(d，2H)，7.00(d，2H)，6.85(d，1H)，4.11(s，3H)，3.78(s，2H)，2.71(m，4H)，1.80(m，4H).
13C-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ23.65，49.86，53.51，55.61，109.16，114.06，115.84，116.13，123.40，124.73，126.14，130.56，153.18，155.32，159.41，164.51，175.16.
质谱(M+H+)：352.1579
分子式：C22H24NO4
实施例3：F3的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和24.75mg3-甲基吡啶烷(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F3，产率23.58％。
产物的核磁氢谱、碳谱和质谱数据为：
1H-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ8.37(s，1H)，7.90(d，1H)，7.52(d，2H)，7.01(d，1H)，6.88(d，2H)，3.79(s，3H)，3.62(s，2H)，2.19-2.51(dm，4H)，1.69(dm，4H)，1.53(m，1H)，0.87(d，3H).
13C-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ19.65，25.01，49.06，53.09，55.61，60.50，108.24，109.59，114.07，115.71，123.46，124.65，126.20，130.56，153.29，159.41，164.25，164.92，175.20.
质谱(M+H+)：380.1346
分子式：C23H26NO4
实施例4：F4的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和32mg(4-乙酰基)-哌嗪(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F4，产率28.37％。
产物的核磁氢谱、碳谱和质谱数据为：
1H-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ8.38(s，1H)，7.92(d，1H)，7.52(d，2H)，6.99(d，1H)，6.97(d，2H)，3.88(s，2H)，3.78(s，3H)，3.44(m，4H)，2.47-2.54(m，4H)，1.98(s，3H).
13C-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ21.61，50.91，52.52，52.91，55.60，109.71，114.07，115.33，116.88，123.40，124.64，126.34，130.53，153.45，156.06，159.42，162.70，168.61，175.28.
质谱(M+H+)：409.1720
分子式：C23H25N2O5
实施例5：F11的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和24.25mg 2-呋喃甲胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到褐色固体，收集褐色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F11，产率18.55％。
产物的核磁氢谱、碳谱和质谱数据为：
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.05(s，1H)，7.53(d，1H)，7.13(dd，2H)，6.64(d，2H)，6.60(d，1H)，6.06(m，1H)，6.01(d，1H)，4.66(s，2H)，3.78(s，2H)，3.54(s，2H)，3.42(s，3H).
13C-NMR(400MHz，DMSO-D6)δ43.87，48.22，55.61，82.86，108.17，109.47，110.96，114.10，115.55，117.77，123.91，124.47，124.88，130.56，143.35，151.88，153.58，154.62，158.56，159.50，175.30.
质谱(M+H+)：390.0816
分子式：C23H19NO5
实施例6：F13的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和18.25mg正丁胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡褐色固体，收集淡褐色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F13，产率36.82％。
产物的核磁氢谱、碳谱和质谱数据为：
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.08(s，1H)，7.91(d，1H)，7.50(d，2H)，6.97(d，2H)，6.87(d，1H)，4.96(s，2H)，4.17(s，2H)，3.83(s，3H)，2.75(t，2H)，1.58(m，2H)，1.38(m，2H)，0.94(t，3H).
13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ13.96，20.30，30.23，45.01，51.51，55.34，83.21，107.73，113.97，115.21，117.96，124.21，124.93，125.24，130.15，151.60，154.69，158.67，159.59.
质谱(M+H+)：366.1420
分子式：C22H23NO4
实施例7：Fa1的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和26.62mg苄胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡褐色固体，收集淡褐色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Fa1，产率13.43％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Fa1所示结构。
实施例8：Fa2的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和31.25mg 4-氟-苄胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡褐色固体，收集淡褐色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Fa2，产率23.73％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Fa2所示结构。
实施例9：Fa3的制备
将芒柄花素67.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和40mg色胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡褐色固体，收集淡褐色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Fa3，产率9.13％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Fa3所示结构。
实施例10：D1的制备
豆黄素(大豆苷元，daidzein)63.56mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和24.25mg 2-呋喃甲胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡褐色固体，收集淡褐色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物D1，产率33.76％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有D1所示结构。
实施例11：D2的制备
豆黄素63.56mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和18.25mg正丁胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物D2，产率49.11％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有D2所示结构。
实施例12：Da1的制备
豆黄素63.56mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和24.25mg 2-呋喃甲胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到黄色固体，收集黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Da1，产率16.38％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Da1所示结构。
实施例13：Da2的制备
豆黄素63.56mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和18.25mg正丁胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Da2，产率32.84％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Da2所示结构。
实施例14：Fa8的制备
芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和40.25mg 4-(三氟甲基)苯胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Fa8，产率3.6％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Fa8所示结构。
实施例15:Fa9的制备
芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和24.75mg环己胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Fa9，产率12.8％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Fa9所示结构。
实施例16:F7的制备
将芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和24.25mg2-呋喃甲胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F7，产率9.3％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有F7所示结构。
实施例17:F8的制备
将芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和18.25mg正丁胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F8，产率5.4％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有F8所示结构。
实施例18：Fa4的制备
芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和34.12mg 3,4-二羟基苄胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Fa4，产率3.1％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Fa4所示结构。
实施例19：Fa2的制备
芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、45μl 36％甲醛(0.5mmol)和31.25mg 4-氟苄胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物Fa2，产率2.0％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有Fa2所示结构。
实施例20：F6的制备
将芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和28.25mg4-氟-苯胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F8，产率1.1％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有F6所示结构。
实施例21:F5的制备
将芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和38.25mg3，4-二羟基苄胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F8，产率0.9％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有F5所示结构。
实施例22：F9的制备
将芒柄花素66.065mg(0.25mmol)完全溶解于1ml DMSO中，缓慢滴加配置好的混合液[4ml甲醇、22.5μl 36％甲醛(0.25mmol)和22.5mg苄胺(0.25mmol)]室温搅拌2h，回流反应10h，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体，收集淡黄色固体，得到粗产物，硅胶柱层析分离，得到产物F9，产率15.7％。
通过核磁氢谱、碳谱和质谱确认产物确实具有F9所示结构。
实施例23：测试芒柄花素衍生物Da1、Da2、F4、Fa4、F6、F9、F5、Fa8、Fa9、Fa1、F8、F7、D1、D2、F11、F13、F2、Fa2、F3对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨作用的影响
Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSC，二代)和MSC完全培养基来源于中科院上海干细胞库，选择生长良好的MSC细胞，并且在生长到70％时，换用成骨分化培养基(ODM，MSC培养基中补充50μM抗坏血酸2-磷酸，10mMβ-甘油磷酸和10nM地塞米松)中培养，使用1μM浓度的芒柄花素衍生物处理细胞，每2-3天换新鲜含衍生物(1μM)的成骨分化培养基ODM。14天后，将细胞在10％福尔马林中固定1h，并用40mM茜素红S(pH 4.1)染色，以观察细胞外基质中的钙沉积。使用ACT-1软件，使用Digital Camera DXM1200F在Eclipse TE200上以4倍放大率获取图像。为了量化茜素红染色，将细胞用10％氯化十六烷基吡啶鎓一水合物(Sigma)脱色30min，并通过测量590nm处溶液的OD来测定茜素红的量。将结果标准化为样品的蛋白质含量，并与仅暴露于DMSO对照的细胞进行比较。
采用豆黄素(daidzein)、芒柄花素(formononetin)进行相同的实验作为对比，DMSO作为溶剂对照(vehide)。
本发明的芒柄花素衍生物对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨作用的影响见图1。
实验结果表明，1μM浓度的Fa8、Fa9、Fa1、F8、F7、D1、D2、F11、F13、F2、Fa2、F3等可显著促进MSC分化为成骨细胞，并在成骨细胞膜产生钙节，能力与母核豆黄素和芒柄花素相当(p＜0.05)；而1μM浓度的F11、F13、F2、Fa2、F3可以极显著促进MSC分化为成骨细胞，并在成骨细胞膜产生钙节(p＜0.001)效果显著优于母核豆黄素和芒柄花素。
实施例24：对人骨髓间充质干细胞(HMSC)成骨作用的影响
选择人原代骨髓间充质干细胞(HMSC)，来源于昆明医科大学实验中心。将原代HMSC细胞复苏、传代、冻存。选择生长良好的的HMSC细胞进行种板，实验分为5组，第一组为HMSC细胞对照组；第二、三、四、五组分别为阳性对照大豆苷元豆黄素(浓度0.4μM和2μM)、芒柄花素(浓度0.4μM和2μM)、依普黄酮(浓度0.4μM和2μM)、雌二醇(浓度0.1μM)；第六、七组分别为待测芒柄花素衍生物F11(浓度0.4μM和2μM)和F13(浓度0.4μM和2μM)组。按实施例23所述方法培养HMSC细胞，进行染色，定量分析，观察成骨细胞形成情况。
F11和F13对人骨髓间充质干细胞(HMSC)成骨作用的影响见图2；其中CON表示HMSC细胞对照组(未加药)，图2左侧为不同实验组的OD值测试结果，右侧为不同实验组的实物照片。
F11、F13以及阳性对照化合物对人骨髓间充质干细胞(HMSC)成骨作用的影响对比图见图3；其中CK表示不加诱导成骨分化培养基的HMSC细胞(未加药)，CON表示加诱导成骨分化培养基的HMSC细胞对照组(未加药)，daidz表示豆黄素，formo表示芒柄花素，iprif表示依普黄酮；图3左侧为骨钙节定量图，纵坐标为茜素红-钙节OD590吸光度值，其中CK吸光度为0，故未在图中显示，图3右侧为不同实验组的茜素红-钙节照片图。
豆黄素(daidz)、芒柄花素(formo)、依普黄酮(iprif)和雌二醇的结构式见图4。
图2～3中的实验结果表明，F11、F13可显著促进HMSC分化为成骨细胞，并在成骨细胞膜产生钙节(p＜0.001)，其作用均优于原型化合物大豆苷元(豆黄素，daidzein)和芒柄花素以及阳性药物雌二醇(estradiol)和依普黄酮(ipriflavone)，且促进MSC细胞成骨分化产生钙结的能力优于一线抗骨质疏松药物—依普黄酮。
实施例25：对RANKL诱导RAW.264.7细胞生成破骨细胞的影响
选择来源于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库的RAW.264.7细胞，取显微镜下观察细胞状态生长良好的细胞，以密度为2×103/孔接种于96孔板中，并同时设置细胞对照孔、RANKL对照孔和不同浓度(1μM，5μM和10μM)的F11和F13化合物处理孔，每个处理组三个平行，化合物与细胞接触后30min，用50ng/mL的RANKL来诱导RAW264.7细胞5天，使破骨细胞前体细胞RAW264.7彻底分化成多核的破骨细胞。到期后，用TRAP染色试剂盒检测破骨细胞分化情况，显微镜下观察并计数每组破骨细胞形成数目。
实验结果如图5所示，图5的纵坐标为破骨细胞数量。
根据图5可以看出，F11、F13可显著抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化，说明所述化合物能有效阻止破骨细胞的生成，改善骨质疏松。
实施例26：对人骨髓间充质干细胞(HMSC)分泌碱性磷酸酯酶(ALP)的影响
选择人原代骨髓间充质干细胞(HMSC)，来源于昆明医科大学实验中心。将原代HMSC细胞复苏、传代、冻存。实验分为5组，第一组为HMSC细胞对照组；第二、三组分别为阳性对照大豆苷元(1μM)、芒柄花素(1μM)；第四、五组分别为待测芒柄花素衍生物F11(1μM)和F13(1μM)组。选择生长良好的的HMSC细胞进行种板，并且在生长到70％时，换用成骨分化培养基(ODM，HMSC培养基中补充50μM抗坏血酸2-磷酸，10mMβ-甘油磷酸和10nM地塞米松)中培养，1μM大豆异黄酮衍生物处理细胞，每2-3天换新鲜含大豆异黄酮衍生物(1μM)的成骨分化培养基ODM。14天后收集细胞，采用实时定量PCR(qRT-PCR)法，检测碱性磷酸酯酶(ALP)基因的表达情况。
本发明的化合物对HMSC细胞ALP基因表达的影响见图6，图6中daidz表示大豆苷元实验组，formo表示芒柄花素实验组，vehicle表示HMSC细胞对照组。
图6中的实验结果表明，F11和F13能明显增加HMSC细胞ALP基因的表达，且优于原型化合物大豆苷元和芒柄花素，表明两化合物通过促成骨分化基因ALP的表达来促进成骨细胞的形成，从而干预骨质疏松的形成。
实施例27：对人骨髓间充质干细胞(HMSC)分泌骨细胞早期因子(sp7)的影响
选择人原代骨髓间充质干细胞(HMSC)，来源于昆明医科大学实验中心。将原代HMSC细胞复苏、传代、冻存。选择生长良好的的HMSC细胞进行种板，实验分为5组，第一组为HMSC细胞对照组；第二、三组分别为阳性对照大豆苷元豆黄素(1μM)、芒柄花素(1μM)；第四、五组分别为待测芒柄花素衍生物F11(1μM)和F13(1μM)组。按实施例1所述方法培养HMSC细胞，到期后收集细胞，采用实时定量PCR(qRT-PCR)法，检测早期因子(sp7)基因的表达情况。
本发明的化合物对HMSC细胞sp7基因表达的影响见图7，图7中daidz表示大豆苷元实验组，formo表示芒柄花素实验组，vehicle表示HMSC细胞对照组。
图7中的实验结果表明，F11和F13能明显增加HMSC细胞sp7基因的表达，且优于原型化合物大豆苷元(豆黄素)和芒柄花素(formononetin)。表明两化合物通过促进骨细胞早期因子sp7基因的表达来促进成骨细胞的形成，从而干预骨质疏松的形成。
实施例28：对人骨髓间充质干细胞(HMSC)分泌骨钙桥蛋白(OP)的影响
选择人原代骨髓间充质干细胞(HMSC)，来源于昆明医科大学实验中心。将原代HMSC细胞复苏、传代、冻存。选择生长良好的的HMSC细胞进行种板，实验分为5组，第一组为HMSC细胞对照组；第二、三组分别为阳性对照大豆苷元豆黄素(1μM)、芒柄花素formononetin(1μM)；第四、五组分别为待测芒柄花素衍生物F11(1μM)和F13(1μM)组。按实施例1所述方法培养HMSC细胞，到期后收集细胞，采用实时定量PCR(qRT-PCR)法，检测骨钙桥蛋白(OP)基因的表达情况。
本发明的化合物对HMSC细胞OP基因表达的影响见图8，图8中daidz表示大豆苷元实验组，formo表示芒柄花素实验组，vehicle表示HMSC细胞对照组。
图8中的实验结果表明，F11和F13能明显增加HMSC细胞OP基因的表达，且优于原型化合物大豆苷元(豆黄素)和芒柄花素(formononetin)。表明两化合物通过促进骨细胞分泌骨桥蛋白OP的表达来促进成骨细胞的形成，从而干预骨质疏松的形成。
实施例29：对人骨髓间充质干细胞(HMSC)分泌胰岛素样生长因子(IGF-1)的影响
选择人原代骨髓间充质干细胞(HMSC)，来源于昆明医科大学实验中心。将原代HMSC细胞复苏、传代、冻存。选择生长良好的的HMSC细胞进行种板，实验分为5组，第一组为HMSC细胞对照组；第二、三组分别为阳性对照大豆苷元豆黄素(1μM)、芒柄花素formononetin(1μM)；第四、五组分别为待测芒柄花素衍生物F11(1μM)和F13(1μM)组。按实施例1所述方法培养HMSC细胞，到期后收集细胞，采用实时定量PCR(qRT-PCR)法，检测胰岛素样生长因子(IGF-1)基因的表达情况。
本发明的化合物对HMSC细胞胰岛素样生长因子(IGF-1)基因表达的影响见图9，图9中daidz表示大豆苷元实验组，formo表示芒柄花素实验组，vehicle表示HMSC细胞对照组。
图9中的实验结果表明，F11和F13能明显增加HMSC细胞OP基因的表达，且优于原型化合物大豆苷元(豆黄素)和芒柄花素(formononetin)。表明两化合物通过促进胰岛素样生长因子(IGF-1)的表达来促进成骨细胞的形成，从而干预骨质疏松的形成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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