阅读说明：本技术 组织dna中马兜铃酸i-dna加合物的检测和相对定量方法 (Method for detecting and relatively quantifying aristolochic acid I-DNA adduct in tissue DNA ) 是由 韩泽广 路兆宁 于 2019-02-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物的检测和相对定量方法,包括以下步骤：A、马兜铃酸I-DNA加合物的制备和鉴定；B、将组织DNA进行酶解；C、采用步骤A制得的马兜铃酸I-DNA加合物作为标准品,对步骤B获得的DNA酶解产物进行检测和相对定量。本发明可以用于检测马兜铃酸I处理的实验动物或疑似马兜铃酸I暴露的人的组织中的dA-AL-I。(The invention provides a method for detecting and relatively quantifying aristolochic acid I-DNA adduct in tissue DNA, which comprises the following steps: A. preparing and identifying an aristolochic acid I-DNA adduct; B. carrying out enzymolysis on tissue DNA; C. and D, detecting and relatively quantifying the DNA enzymolysis product obtained in the step B by using the aristolochic acid I-DNA adduct prepared in the step A as a standard substance. The invention can be used for detecting dA-AL-I in the tissues of experimental animals treated with aristolochic acid I or humans suspected to be exposed to aristolochic acid I.)

组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物的检测和相对定量方法

技术领域

本发明涉及化学致癌物形成的DNA加合物的检测技术领域，是针对马兜铃酸I形成的DNA加合物(dA-AL-I)的检测和相对定量，具体涉及一种组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物的检测和相对定量方法。

背景技术

化学致癌物是引起癌症的主要原因之一，其中主要的作用方式是化学致癌物的代谢产物可以以共价键的形式结合在DNA上，形成DNA加合物，而DNA加合物会引起DNA断裂或突变，从而导致癌症的发生，例如黄曲霉素和马兜铃酸等就是通过这种方式引起癌症。另外，像这两种化学致癌物形成的DNA加合物可以长期存在与组织中。因此，对于DNA加合物的检测，不仅可以有助于揭示病因学，而且还可以判定是否有某种化学致癌物的暴露。

检测DNA加合物的方法主要包括免疫分析法、³²P后标记法和质谱法等。³²P后标记法具有非常高的灵敏度，可达1个加合物/10¹⁰个核苷酸，而且DNA用量最少，非常适用于有限的人类样本检测，但是该方法需要使用放射性同位素，而且操作费时和低产率。免疫分析法和质谱法的灵敏度为1个加合物/10⁸个核苷酸，需要的DNA也比³²P后标记法多。免疫分析法受限于特异识别DNA加合物的抗体。基于质谱(MS)的方法越来越多的用于检测和定量各种DNA加合物，而且MS也可以鉴定新加合物。MS通常与液相色谱(HPLC和UPLC)或气相色谱(GC)系统联用，将感兴趣的加合物从未被修饰的核苷酸或其他干扰损伤中分离出来。MS法具有最高的特异性而且可以获得结构信息，不足之处是需要加合物标准品。

据检索，现有技术中对于马兜铃酸I-DNA加合物的检测方法主要有：³²P后标记法和质谱法，另外还有报道通过荧光法来检测，如专利文献CN106198771A中公开了一种同时测定组织中两种马兜铃酸-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD分析方法，其直接将组织中提取的DNA消化后，采用HPLC-FLD测定AA-DNA加合物、采用HPLC-DAD测定脱氧腺苷。但是该方法不够准确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测和相对定量DNA中马兜铃酸I DNA加合物(dA-AL-I)的方法。本发明利用超高效液相色谱/三重四极杆质谱(UHPLC/QQQ MS)，以合成的dA-AL-I作为标准品，对组织中的dA-AL-I进行检测和相对定量。该方法有助于揭示病因学，还可以为判定是否有马兜铃酸I的暴露提供参考。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的检测和相对定量方法，包括以下步骤：

A、马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的制备和鉴定；

B、将组织DNA进行酶解；

C、采用步骤A制得的马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)作为标准品，对步骤B获得的DNA酶解产物进行检测和相对定量。

优选地，步骤A中，所述兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的制备步骤如下：将脱氧腺苷和马兜铃酸I溶于磷酸钾溶液中，加入锌粉，避光反应，即得兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)。

优选地，所述脱氧腺苷与磷酸钾溶液的固液比为2:1(g/ml)；所述马兜铃酸I与磷酸钾溶液的固液比为1:1(g/ml)；所述磷酸钾溶液的浓度为50mM，pH值为5.8。

优选地，所述避光反应的温度为37℃、反应时间为16h。

优选地，步骤A中，所述鉴定采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)进行。

优选地，步骤B中，所述酶解的方法具体包括以下步骤：

B1、提取组织DNA；

B2、采用脱氧核糖核酸酶I、核酸酶P1、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶I对组织DNA进行酶解。

优选地，步骤B2中，加入所述脱氧核糖核酸酶I进行酶解的条件为：37℃温育1.5h；加入所述核酸酶P1进行酶解的条件为：37℃温育3h；加入所述碱性磷酸酶和磷酸二酯酶I进行酶解的条件为：37℃温育18h。

优选地，步骤C中，采用超高效液相色谱/三重四极杆质谱(UHPLC/QQQ MS)对所述DNA酶解产物进行检测和相对定量。

优选地，步骤C中，所述DNA酶解产物进行检测和相对定量前，先进行冷冻干燥，然后溶于1:1的H₂O/DMSO的混合溶液中。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明是针对马兜铃酸I DNA加合物(dA-AL-I)进行检测和相对定量，采用超高效液相色谱/三重四极杆质谱可以高效简易准确地实现马兜铃酸I DNA加合物检测和相对定量。

2、本发明不仅可以作为基础研究的手段，有助于揭示病因学，还可以为判定是否有马兜铃酸I的暴露提供参考。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例1通过MS(上方)和MS/MS(下方)扫描获得的合成的dA-AL-I的离子谱；其中，图1a为dA-AL-I的离子谱；图1b为dA-AL-I的裂解途径；

图2为本发明实施例2的DNA酶解效果鉴定；

图3为本发明实施例3的DNA中dA-AL-I的鉴定；

图4为本发明实施例3检测的组织DNA中dA-AL-I的相对定量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、马兜铃酸I DNA加合物(dA-AL-I)标准品的制备与鉴定

1.马兜铃酸I DNA加合物(dA-AL-I)标准品的制备

1.1将2mg dA溶于1ml 50mM的磷酸钾溶液(pH 5.8)中,加入1mg马兜铃酸I混匀，加入锌粉，37℃避光反应16h。

1.2 12000×g离心10min，取上清。

2.利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)对合成的马兜铃酸I DNA加合物(dA-AL-I)标准品进行鉴定

2.1利用ACQUITY UPLC系统(Waters)偶联XEVO-G2XS四极杆飞行时间质谱仪(UPLC-QTOF-MS，Waters)来鉴定合成的dA-AL-I标准品。7μl的标准品注入ACQUITY HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm，Waters)中，流动相A和B为别为0.1％甲酸在水和乙腈中。ESI正离子模式梯度洗脱程序(流速0.4ml/min)：0-1min,1％B；1-3min,1-30％B；3-7min,30％B；7-9min,30-100％B；9-11.2min,100％B；11.2-11.3min,100-1％B and 11.3-13min,1％B.飞行时间质谱仪条件：毛细管电压，2kV；锥孔电压，40V；离子源温度，115℃；脱溶剂气温度，450℃；锥孔气流速，50l/h；脱溶剂气流速，900l/h；以全扫描模式获得m/z 50-1200的质谱。在正离子模式下，碰撞能量10-30eV，获得m/z 50-600的二级质谱。

2.2数据通过Masslynx v 4.1获得，利用UNIFI 1.8.1.进行分析。鉴定结果如图1所示，其中，图1a为dA-AL-I的离子谱；图1b为dA-AL-I的裂解途径。图1的结果表明：合成的马兜铃酸I DNA加合物准确无误，可以作为标准品使用。

实施例2、DNA消化成单个脱氧核苷

1.组织DNA的提取

将马兜铃酸I或PBS处理的小鼠的肝组织(或其他组织)剪碎加入含有100mM EDTA、10mM NaCl、0.1％SDS、蛋白酶K(0.2mg/ml)和RNase A(0.2mg/ml)的10mM Tris-HCl(pH8.0)。DNA通过苯酚/氯仿进行提取，用含有10mM MgCl₂的5mM的bis-Tris-HCl(pH 7.1)溶解。

2.DNA酶解

2.1将DNA按1mg DNA/1ml含有10mM MgCl₂的5mM的bis-Tris-HCl(pH 7.1)进行配制。先加入脱氧核糖核酸酶I(溶于0.15M NaCl，300U/mg DNA)，混匀，37℃温育1.5h，然后加入核酸酶P₁(溶于1mM ZnCl₂，4U/mg DNA),混匀，37℃温育3h，最后加入碱性磷酸酶(溶于1mMMgCl₂，2U/mg DNA)和磷酸二酯酶I(溶于含有110mM NaCl、15mM MgCl₂和50％甘油的110 1mMTris-HCl(pH 8.0)，0.0714U/mg DNA)，37℃温育18h。酶解结束后，向酶解溶液中加入2倍体积的预冷无水乙醇，冰育1h，15000×g室温离心5min，取上清。

2.2用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶解效果，结果如图2所示。结果表明：DNA酶解完全，可以继续进行操作。

2.3将酶解的DNA冷冻干燥，溶于50μl 1:1的H₂O/DMSO的混合溶液中。

实施例3、DNA中的dA-AL-I的检测和相对定量

1利用超高效液相色谱/三重四极杆质谱(UHPLC/QQQ MS，Waters)对DNA酶解产物中的dA-AL-I来进行检测和相对定量

1.1该系统使用的色谱柱、流动相和梯度洗脱程序与UPLC-QTOF-MS系统中使用的相同。2μl的标准品和DNA酶解产物依次注入色谱柱中。该系统同样采用正离子模式，三重四极杆质谱仪条件：毛细管电压，0.5kV；锥孔电压，40V；离子源温度，150℃；脱溶剂气温度，500℃；锥孔气流速，150l/h；脱溶剂气流速，1000l/h；检测方式：多反应检测模式(MRM)。MRM离子对为543.16/427.12、543.16/395和543.16/292，对应的碰撞能量分别是25、30和35eV。

1.2利用Masslynx来分析数据，根据合成的标准品的滞留时间判定是否为待测的dA-AL-I，以子离子m/z 427的含量峰面积来相对定量。结果如图3和图4所示。图3的结果表明：通过合成的标准品的滞留时间判定为待测的dA-AL-I。图4的结果表明：子离子m/z 427的含量峰面积可以反映dA-AL-I的相对含量。且检测的4个样本的相对定量(计算方法为：相对含量＝样本子离子m/z 427的含量峰面积/样本中子离子m/z 427的含量最大峰面积*100％)分别为100％、12.3％、10.7％和9％。

1.3对18个样本(14个马兜铃酸I处理的小鼠的肝(12)或肾(2)组织样本和4个PBS处理的小鼠的肝组织样本)采用本发明的方法进行马兜铃酸I DNA加合物检测和相对定量，其准确率为100％。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。