阅读说明：本技术 一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物 (Metabolism marker for diagnosing liver and gall diseases ) 是由 宁慧 张志永 彭章晓 胡哲 陆嘉伟 胡绪俊 付艳蕾 舒烈波 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物及其筛选方法,所述代谢标志物包括血清代谢标志物、尿液代谢标志物,所述血清代谢标志物包括EPA,AA,DHA,TCDA,DCA,GCA,TCA,GCDA,GCDCA,GDCA,CDCA,LPC16-0,LPC18-0,LPC18-1,LPC20-0中的单个或任意组合。所述筛选方法利用预先建立好的LC-MS/MS方法,定量检测临床大样本(血清和尿液)中目标代谢物的含量,筛选诊断标志物。本发明的代谢标志物可以有效地诊断出肝胆疾病,降低肝癌和胆管癌漏检率,非常有利于肝癌和胆管癌的早诊早治,对于改善肝癌和胆管癌预后,降低肝癌和胆管癌的死亡率有很大帮助,具有良好的临床使用和推广价值。在实际应用中,可以按照本发明建模方法选取更多的样本和更多的代谢物组合进行建模,增加模型的准确度。(The invention discloses a metabolic marker for diagnosing liver and gall diseases and a screening method thereof, wherein the metabolic marker comprises a serum metabolic marker and a urine metabolic marker, and the serum metabolic marker comprises one or any combination of EPA, AA, DHA, TCDA, DCA, GCA, TCA, GCDA, GCDCA, GDCA, CDCA, LPC16-0, LPC18-0, LPC18-1 and LPC 20-0. The screening method utilizes a pre-established LC-MS/MS method to quantitatively detect the content of target metabolites in large clinical samples (serum and urine) and screen diagnostic markers. The metabolic marker can effectively diagnose liver and gall diseases, reduce the omission rate of liver cancer and bile duct cancer, is very beneficial to early diagnosis and early treatment of the liver cancer and the bile duct cancer, is greatly helpful for improving the prognosis of the liver cancer and the bile duct cancer and reducing the death rate of the liver cancer and the bile duct cancer, and has good clinical use and popularization values. In practical application, more samples and more metabolite combinations can be selected for modeling according to the modeling method, so that the accuracy of the model is improved.)

一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物

技术领域

本发明属于医药诊断领域，涉及一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物。

背景技术

肝脏是人体最重要的代谢器官，它不仅是人体内源性代谢物(氨基酸、糖类、脂类等)最重要的代谢场所，而且还是人生命周期中所暴露的上百万种外源性毒物最主要的解毒器官。许多因素(例如：高脂、高糖、酒精、化学毒物、肝炎病毒等)会导致健康的肝脏受损，进而发展成为肝炎、肝硬化和肝癌。随着肝病的进展，肝脏会出现不同的代谢表型，根据代谢表型的不同将肝脏的健康状态划分成了四个层级，0期(Phase 0)：健康肝(healthyliver)；1期(Phase 1)：非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)/非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)/酒精性肝病(alcoholicliver disease，ALD)/病毒性肝炎(viral hepatitis)；2期(Phase 2)：肝硬化(cirrhosis)；3期(Phase 3)：肝细胞型肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)/胆管细胞型肝癌(cholangiocarcinoma，CCA)。大量的研究表明，肝病进程中，肝脏的代谢会出现明显的变化，这种代谢表型变化主要包含两个方面，即：能量代谢重塑(脂肪酸的β-氧化、线粒体呼吸和胞质糖酵解)和核心代谢表型产生(血清溶血卵磷脂下降、血清和尿液胆汁酸含量上升)。

诊断标志物的筛选是一个富有挑战性的工作。代谢物(分子量小于1000的内源性小分子)作为生命活动最下游层级(基因→RNA→蛋白→代谢物)，是最接近生物表型的物质，由于信号传导的“级联放大”效应，基因层面的微小变化会导致代谢物表达水平的较大波动，因此代谢物作为诊断标志物具有灵敏度高的天然优势。但是，代谢物作为诊断标志物也有自身的缺陷，那就是特异性较差，因为代谢物的组织特异性不如蛋白的组织特异性高，因此不同的疾病可能会导致相同的代谢物变化。但是，溶血卵磷脂和胆汁酸的合成基本上都在肝细胞中进行，因此，肝脏的病变会直接影响这两类代谢物的表达水平，筛选这两类代谢物中的几个物质作为肝病进程的诊断标志物应该具备很好的灵敏度和特异性。

代谢物作为诊断标志物在临床上已有一些应用，如：葡萄糖作为糖尿病的诊断标志物；苯丙酮酸作为苯丙酮尿症的诊断标志物；肌酐和尿素作为肾功能的诊断标志物；肌氨酸作为***癌的诊断标志物等。但与蛋白类的诊断标志物(如肿瘤标志物:癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、CA19-9、CA125、PSA等，肝功能标志物：ALT、AST等，肾功能标志物：尿β2-微球蛋白、尿白蛋白、尿免疫球蛋白G等)相比，总体来说要少得多，有待进一步开发。目前，用于肝病临床诊断的蛋白类标志物主要有两类：(1)肝功能标志物：ALT、AST；(2)肝癌标志物：AFP。肝功能指标(ALT、AST)反映的是肝脏作为主要代谢解毒器官的功能状态，并非反应肝脏的病变水平；而肝癌标志物AFP主要用于肝癌的诊断和疗效评价指，虽应用广泛，但仍存在许多缺陷，如：(1)对于早期肝癌诊断的灵敏度较差，许多早期肝癌患者血清AFP含量很低(<20μg/L)，假阴性率约为30％；(2)特异性不够，妊娠、胚胎癌如睾丸癌、卵巢癌和极少数胃、胰、胆管、结肠直肠癌也可升，此外其它肝病如肝炎、肝硬化等也会导致AFP升高，因此；血清AFP作为肝细胞癌的诊断标志物，其准确率为60-70％。基于肝病核心代谢表型变化，筛选不同于ALT、AST、AFP等临床常用指标的新标志物作为补充是十分必要和有意义的。

现代分离检测技术的飞速发展，尤其是色谱-质谱联用技术的不断升级以及大数据算法的不断完善，为代谢物的高通量分析提供了可能。非靶向代谢组学(Untargetedmetabolomics)技术就是利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)和/或液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)对生物样本(细胞、组织、体液等)的代谢组(分子量小于1000的内源性代谢小分子)进行全覆盖分析，然后结合化学计量学的方法筛选不同样本组间的差异表达代谢物，图1所示的结果就是等根据大量已经报道的肝病非靶向代谢组学研究结果总结出来的示意图。然而，想要将重要的差异代谢物开发成诊断标志物，还有许多工作要做，主要包括：(1)非靶向代谢组学检测给出的代谢物是相对定量的结果(一般以质谱峰面积表示)，对于同批次检测的样本具有可比性，但对于不同批次间的样本就不具有可比性，因此要想将重要的差异代谢物开发成诊断标志物，必须利用该代谢物的标准品开发其定量检测的方法，这样可以给出代谢物在样本中的绝对浓度信息，使得不同批次的样本具有可比性；(2)需要利用临床大样本进行验证，哪些差异代谢物作为诊断指标时灵敏度和特异性高(保留)，哪些差异代谢物的灵敏度和特异性低(舍弃)，此外还要兼顾诊断标志物是否具有好的稳定性、可检测性等。

发明内容

本发明的目的是利用预先建立好的LC-MS/MS方法，定量检测临床大样本(血清和尿液)中目标代谢物的含量，筛选诊断标志物，并计算出诊断标志物的Cut off值，然后利用筛选出来的诊断标志物评价肝脏的健康水平，跟踪肝病进展，结合AFP进行肝癌早期预警。

本发明提供了一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物，所述代谢标志物包括血清代谢标志物、尿液代谢标志物。

所述血清代谢标志物包括EPA，AA，DHA，TCDA，DCA，GCA，TCA，GCDA，GCDCA，GDCA，CDCA，LPC16-0，LPC18-0，LPC18-1，LPC20-0等中的单个或任意组合；优选地，所述血清代谢标志物为血清标志物组合(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)。

所述尿液代谢标志物包括LPC16-0，LPC18-0，LPC18-1，AA，GCDA，GCA，GCDCA，TCDA，TCA等中的单个或任意组合；优选地，所述尿液代谢标志物为尿液标志物组合(LPC16-0+TCDA+GCA)。

本发明还提供了一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物的筛选方法，具体包括以下步骤：

(1)基于LC-MS/MS技术定量检测血清和尿液中重要靶标代谢标志物的含量。

(2)进行基于logistic模型的受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve,ROC曲线)计算，筛选最佳的代谢标志物组合数量。

(3)通过不同组间代谢标志物组合的韦恩图分析，筛选到血清和尿液中最佳的代谢标志物组合。

步骤(1)中，所述血清靶标代谢标志物为15个，分别为：EPA，AA，DHA，TCDA，DCA，GCA，TCA，GCDA，GCDCA，GDCA，CDCA，LPC16-0，LPC18-0，LPC18-1，LPC20-0。

步骤(1)中，所述尿液靶标代谢标志物为9个，分别为：LPC16-0，LPC18-0，LPC18-1，AA，GCDA，GCA，GCDCA，TCDA，TCA。

步骤(2)中优选采用R3.6.1软件进行基于logistic模型的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)计算。

步骤(2)中，所述血清的最佳的代谢标志物组合数量为4。

步骤(2)中，所述尿液的最佳的代谢标志物组合数量为3。

步骤(3)中，所述血清的代谢标志物组合为(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)。

步骤(3)中，所述尿液的代谢标志物组合为(LPC16-0+TCDA+GCA)。

本发明还提供了所述代谢标志物在作为肝胆疾病诊断、肝胆疾病疗效评估、肝胆疾病预后干预标志物中的应用。

本发明还提供了所述代谢标志物作为生物标志物在制备肝胆疾病诊断产品和/或肝胆疾病疗效评估产品和/或肝胆疾病预后干预产品中的应用。

本发明还提供了所述的代谢标志物和AFP作为联合标志物在作为肝胆疾病诊断、肝胆疾病疗效评估、肝胆疾病的预后干预标志物中的应用。

本发明还提供了所述的代谢标志物和AFP作为联合标志物在制备肝胆疾病诊断产品和/或肝胆疾病疗效评估产品和/或肝胆疾病预后干预产品中的应用。

本发明还提供了所述代谢标志物的特异性检测试剂在制备肝胆疾病诊断产品和/或肝胆疾病疗效评估产品和/或肝胆疾病预后干预产品中的应用。

本发明还提供了所述代谢标志物和AFP的特异性联合检测试剂在制备肝胆疾病诊断产品和/或肝胆疾病疗效评估产品和/或肝胆疾病预后干预产品中的应用。

本发明还提供了一种肝胆疾病的诊断产品，所述产品包括上述代谢标志物或其组合的特异性检测试剂；或所述产品包括所述代谢标志物和AFP的特异性联合检测试剂。

本发明还提供了一种肝胆疾病疗效评估产品，所述产品包括上述代谢标志物或其组合的特异性检测试剂；或所述产品包括所述代谢标志物和AFP的特异性联合检测试剂。

本发明还提供了一种肝胆疾病预后干预产品，所述产品包括上述代谢标志物或其组合的特异性检测试剂；或所述产品包括所述代谢标志物和AFP的特异性联合检测试剂。

本发明中，所述肝胆疾病相关产品(肝胆疾病诊断产品、肝胆疾病疗效评估产品、肝胆疾病预后干预产品)包括试剂盒、试纸、固体支持体；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。

本发明中，所述肝胆疾病的诊断产品用于检测人体中血清代谢标志物、尿液代谢标志物的水平，用于监测肝胆疾病的进展及肝癌和胆管癌的早期诊断。

本发明中，所述肝胆疾病的诊断产品含有特异性识别所述代谢标志物(包括血清代谢标志物、尿液代谢标志物中的单个或任意组合)的试剂。

本发明中，所述肝胆疾病的诊断产品含有标准品或阳性对照。

本发明中，所述肝胆疾病包括肝炎、肝硬化、肝癌、胆管癌等。

本发明还提供了一种肝胆疾病的诊断模型，所述模型包括：(1)确定代谢标志物在血清和尿液中的浓度，(2)多标志物的拟合，(3)判别分析，(4)诊断结果的可视化输出。

(1)确定代谢标志物在血清和尿液中的浓度

其中，所述代谢标志物在血清和尿液中的浓度例如可以如图3和图4所示。

(2)多标志物的拟合

本发明提出的所述多标志物的拟合的算法具体指：

logistic回归又称logistic回归分析，其是一种广义的线性回归分析模型，可用于判断疾病的标志物，并根据标志物预测疾病发生的概率。因变量的值可定义为发病(阳性、死亡、治愈等)和未发病(阴性、生存、未治愈等)，自变量可以包括多种标志物。自变量既可以是连续的，也可以是分类的。通过logistic回归分析，可以得到自变量的权重，根据该权重值结合受试者工作特征曲线(ROC)可以判断多指标诊断标志物联合的诊断能力。

其中，用于logistic回归分析的具体算法公式如下：

常规项：α表示自变量X_j为0时个体发病与不发病概率之比的自然对数。

回归系数：β_j(j＝1,2,···,m)表示自变量X_j改变一个单位时Logit(P)的该变量。

其中，受试者工作特征曲线(ROC)分析如下：

ROC曲线图是反映敏感性与特异性之间关系的曲线。横坐标X轴为1-特异性，也称为假阳性率(误报率)，X轴越接近零准确率越高；纵坐标Y轴称为敏感度，也称为真阳性率(敏感度)，Y轴越大代表准确率越好。根据曲线位置，把整个图划分成两部分，曲线下方部分的面积被称为AUC(Area Under Curve)，用来表示预测准确性，AUC值越高，也就是曲线下方面积越大，说明预测准确率越高。曲线越接近左上角(X越小，Y越大)，预测准确率越高。具体算法原理如下图17所示：

其中，假阳性率(fp rate)：原本是错的预测为对的比例(越小越好，0为理想状态)，

真阳性率(tp rate)：原本是对的预测为对的比例(越大越好，1为理想状态)，

精确率(precision)：预测为对的当中，原本为对的比例(越大越好，1为理想状态)，

召回率(recall)：原本为对的当中，预测为对的比例(越大越好，1为理想状态)，

F度量(F-measure)：是对准确率和召回率做一个权衡(越大越好，1为理想状态，此时precision为1，recall为1)；

判对准确率(accuracy)：预测对的(包括原本是对预测为对，原本是错的预测为错两种情形)占整个的比例(越大越好，1为理想状态)，TP＝正类被预测成正类数；FP＝负类被预测成正类数；TN＝负类被预测成负类数；FN＝正类被预测成负类数；N＝预测成负类数；P＝预测成正类数(3)判别分析

所述判别分析的算法具体指：

以训练集数据形成比较组的logistic回归模型，分别将训练集与测试集数据代入logistic回归模型中获得各样本的权重值，权重值的分布趋势即为不同组样本的分布趋势(见图16)，诊断准确性(diagnostic accuracy)的计算公式如下：

TP：训练集的诊断标志物权重阈值将测试集进行有无疾病区分，正类被预测成正类数量；

TN：训练集的诊断标志物权重阈值将测试集进行有无疾病区分，负类被预测成负类数量；

N：测试集总数量。

(4)诊断结果的可视化输出

诊断结果的可视化输出是指图16中的判别结果分布趋势，对于任何的测试样本而言，只需要将其诊断标志物在血清和尿液中的浓度代入logistic回归模型中获得各样本的权重值，将测试样本的权重值与训练集中的诊断阈值进行比较，便能进行有无疾病的区分。

本发明还提供了一种肝胆疾病的诊断模型在诊断肝胆疾病、疗效评估、预后干预中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明的代谢标志物组合可以有效地诊断出肝胆疾病，降低肝癌和胆管癌漏检率，非常有利于肝癌和胆管癌的早诊早治，对于改善肝癌和胆管癌预后，降低肝癌和胆管癌的死亡率有很大帮助，具有良好的临床使用和推广价值。在实际应用中，可以按照本发明建模方法选取更多的样本和更多的代谢物组合进行建模，增加模型的准确度。

附图说明

图1为优化后的标品检测图，其中，图A为负离子模式下的超高效液相色谱串联质谱检测图；图B为正离子模式下的超高效液相色谱串联质谱检测图。

图2为靶标代谢物含量在血清和尿液QC的RSD均小于15％，其中，图A为4个溶血卵磷脂和3个多不饱和脂肪酸在血清QC样本中的含量；图B为8个胆汁酸在血清QC样本中的含量；图C为3个溶血卵磷脂在尿液QC样本中的含量；图D为5个胆汁酸在尿液QC样本中的含量。

图3为15个目标代谢物在不同组临床血清样本中的含量。

图4为9个目标代谢物在不同组临床尿液样本中的含量。

图5为筛选流程图。

图6为利用血清的诊断指标进行判别分析时，不同诊断组合物数量对应的ROC曲线下面积排序。

图7为血清的正常组和不同疾病组诊断组合物的韦恩图.

图8为血清的不同疾病组诊断组合物的韦恩图。

图9为血清的8个对比组诊断组合物的韦恩图。

图10为利用尿液的诊断指标进行判别分析时，不同诊断组合物数量对应的ROC曲线下面积排序。

图11为尿液的正常组和不同疾病组诊断组合物的韦恩图。

图12为尿液的不同疾病组诊断组合物的韦恩图。

图13为尿液的8个对比组诊断组合物的韦恩图。

图14为健康组和疾病组之间，血清标志物组合、AFP以及二者联合的诊断能力比较。

图15为疾病组之间，血清标志物组合、AFP以及二者联合的诊断能力比较。

图16为诊断准确性考察。

图17为ROC分析的原理图；

TP＝正类被预测成正类数；FP＝负类被预测成正类数；TN＝负类被预测成负类数；FN＝正类被预测成负类数；N＝预测成负类数；P＝预测成正类数。

具体实施方式

结合以下具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：肝胆疾病诊断标志物的筛选

1.研究对象

本研究的临床血清和尿液样本来自于3个独立医学中心，具体样本信息如表1。

表1临床血清和尿样信息

2.血清和尿液样本中目标代谢物的超高效液相色谱串联质谱分析

2.1靶标代谢物的信息

从肝病的核心代谢表型中选取了15个重要的差异代谢物作为此次筛选的靶标代谢物，详细信息见表2。

表2靶标代谢物和内标信息

^*标记的代谢物作为内标使用

2.2仪器和试剂

超高效液相色谱仪串联三重四极杆，色谱系统的型号：ACQUITYUPLC，Waters公司；质谱系统的型号(AB5500，AB Sciex公司)。漩涡振荡器(TYXH-I，上海汗诺仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(TGL-16MS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)

甲醇、水、乙腈均为质谱纯(上海安谱实验科技股份有限公司)

氯仿为分析纯(国药集团)

标准品(Sigma-Aldrich公司)

2.3样本前处理

10μL血清加入90μL纯水，加入300μL蛋白沉淀剂(甲醇:乙腈＝2:1，v/v)(含1.6μg/mL LPC17-0和16ng/mL GCA-C13)。涡旋1分钟，-20℃静置20分钟，4℃离心10分钟，取150μL上清装入LC-MS进样小瓶中，-80℃放置，待测。

50μL尿液加入150μL蛋白沉淀剂(甲醇:乙腈＝2:1，v/v)(含64ng/mL LPC17-0和16ng/mL GCA-C13)，涡旋1分钟，-20℃静置20分钟，4℃离心10分钟，取150μL上清装入LC-MS进样小瓶中，-80℃放置，待测。

血清的质控样本(QC)由血清样本混合而成，尿样的质控样本由尿液样本混合而成。质控样本的前处理方法与对应类型的检测样本前处理方法完全相同。

2.4样本检测

将处理后的所有血清和尿样样本作为分析样本，同类型的样本同批次上机，打乱顺序后随机化排序进样，以排除进样顺序带来的组间差异。每隔50个分析样本加入一个质量控制样品。

分析检测条件如下：

色谱条件：色谱柱BEH C18色谱柱(2.1×50mm²,1.7μm，Waters公司)

流动相：A相，水(含0.1％甲酸)；B相，乙腈(含0.1％甲酸)

色谱梯度：10–10％B，0–0.2分钟；10–55％B，0.2–3.5分钟；55–80％B，3.5–6分钟；80–100％B，6–6.5分钟；100–100％B，6.5–8分钟，100-10％B，8–8.3分钟；10–10％B，8.3–10分钟。

流速0.6mL/min；柱温：45℃；进样量：3μL

质谱条件：电喷雾离子源，正负离子模式切换。离子源温度：120℃；锥孔载气流速：40L/h；脱溶剂气温：400℃；载气流速：650L/h；正负离子的毛细管电压分别为：+5.5kV和-5.5kV；入口电位和碰撞电位均为10V.去簇电压和碰撞能需要针对单个标准品进行优化选择，详见表3，优化后的标品检测图见附图1，多不饱和脂肪酸和胆汁酸在负离子模式下被检测，溶血卵磷脂在正离子模式下被检测，待测物在当前的色谱质谱条件下，分离度和质谱响应都很好，可以进行后续正式样本的检测分析。

2.5目标代谢物在血清和尿液中的定量结果

根据上述的前处理方法和分析检测条件，本发明检测了所有临床样本的目标代谢物含量，并利用质控样本(QC)中目标代谢物含量的相对标准偏差(RSD)值来评价测试过程的稳定性及数据的可靠性，结果显示，靶标代谢物含量在血清和尿液QC的RSD均小于15％(见附图2)，说明整个分析过程稳定可靠。将不同组样本中目标代谢物的含量以箱体图展示，见附图3和附图4。在肝病进展过程中(N→HS→CH→HC/CC)，血清溶血卵磷脂和多不饱和脂肪酸的含量的趋势是相同的，均为先下降后逐渐稳定；血清胆汁酸(CDCA，GCDA，GCDCA，GDCA，TCDA)的含量在肝病进展过程中(N→HS→CH→HC/CC)呈现先上升后下降的趋势，在肝硬化组(CH)其含量达到峰值；血清胆汁酸GCA和TCA的趋势一致，在肝病进展中呈现先上升，后下降，再上升的双高峰趋势，其中CH组和CC组的含量均比其它组的含量高。血清胆汁酸DCA在HS、CH、HC三种中的含量差异不大，且略低于健康组(N)，在CC组中的含量最低。在肝病进展过程中(N→HS→CH→HC/CC)，尿液溶血卵磷脂和多不饱和脂肪酸AA的含量的趋势是相同的，均为逐渐上升的趋势；尿液胆汁酸基本上都呈现先上升后下降的趋势，其中肝炎组(HS)尿液胆汁酸的含量最高。

表3优化的母、子离子对和相关的质谱检测参数

3.诊断标志物的筛选

3.1筛选流程

筛选流程图如附图5，首先基于LC-MS/MS技术定量检测来自于2个独立医学中心的5种类型临床样本(N：健康人，HS：肝炎，CH：肝硬化，HC：肝癌，CC：胆管癌)血清和尿样中15种重要靶标代谢物的含量，采用R3.6.1软件进行基于logistic模型的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)计算，筛选最佳的代谢物组合数量。通过不同组间诊断标志物组合的韦恩图分析，筛选到血清和尿液中最佳的诊断物组合。将这个最优的诊断物组合的诊断能力与临床常用的诊断指标AFP进行比较，然后利用另一批临床样本(健康人、肝癌病人和胆管癌病人的血清)进行诊断标志物组合的诊断准确性检验。

3.2筛选结果

诊断标志物可以是单个代谢物，也可以是由多个代谢物组成的代谢物组，在此案例中，采用R3.6.1软件进行基于logistic模型的受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,ROC曲线)计算，获得15个代谢物所有组合的ROC曲线下面积(the area under the ROC curve,AUC)。以血清的代谢物组合数为横坐标，以血清的代谢物组合数所对应的AUC值为纵坐标作图(见附图6)，可以发现血清的最优的代谢物组合数量，即：增加组合中代谢物的数量时模型准确度不再上升。结果表明：4个代谢物的组合是最优的。为了筛选能区分不同临床样本分组的最优诊断组合，本发明将寻找不同分组诊断组合物的交集。正常组和不同疾病组诊断组合物的韦恩图见附图7(AUC>0.95，代谢物数目＝4)；不同疾病组诊断组合物的韦恩图见附图8(AUC>0.75，代谢物数目＝4)；8个对比组诊断组合物的韦恩图(正常组vs疾病组的AUC>0.95，疾病组vs疾病组的AUC>0.75，代谢物数目＝4)见附图9。8个对比组诊断组合物的交集有2个，这2个组合在不同对比组中的AUC值见表4。诊断标志物组合1(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)略优于诊断标志物组合2(TCDA+CDCA+LPC18-0+AA)。

尿液的诊断标志物组筛选方法与上述血清样本的筛选方法相同，以尿液的代谢物组合数为横坐标，以尿液的代谢物组合数所对应的AUC值为纵坐标作图(见附图10)，可以发现最优的尿液的代谢物组合数量为3。正常组和不同疾病组诊断组合物的韦恩图见附图11(AUC>0.9，代谢物数目＝3)；不同疾病组诊断组合物的韦恩图见附图12(AUC>0.7，代谢物数目＝3)；8个对比组诊断组合物的韦恩图(正常组vs疾病组的AUC>0.95，疾病组vs疾病组的AUC>0.75，代谢物数目＝3)见附图13。尿液的8个对比组诊断组合物的交集有3个，这3个组合在不同对比组中的AUC值见表5。综合来看，尿液中最优的诊断标志物组为LPC16-0+TCDA+GCA。

表4.两个组合物在血清样本不同对比组中的AUC值

表5.三个组合物在尿液样本不同对比组中的AUC值

3.3诊断标准物组合与AFP诊断能力的比较

AFP目前是肝癌临床诊断最常用的标志物，通过ROC分析(见附图14、15)和AUC值的比较(见表6)，本发明可以发现在所有的判别分析组里面，筛选出来的诊断标志物组：(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)的AUC值均大于AFP的AUC值，说明诊断组合物(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)的诊断能力优于AFP。在AFP<20μg/L的样本中，(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)的诊断优势更加明显。在AFP≥20μg/L的样本中，肝癌组(HC)和其它组疾病进行判别分析时，AFP的AUC值大于诊断组合物(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)的AUC值，而在除HC组的其它疾病组的判别分析中，诊断组合物(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)的AUC值大于AFP的AUC值。在所有样本中或在AFP<20μg/L的样本中，AFP联合诊断标志物组并不能显著增加诊断能力，诊断标志物组可独立用于诊断，无需与AFP联合，但在AFP≥20μg/L的样本中，AFP联合诊断标志物组能显著增加不同疾病组之间的判别分析能力。

表6.诊断标志物组与AFP的诊断能力比较

实施例2：使用4个血清代谢标志物进行肝胆癌症诊断模型的构建和诊断准确性测试

本实施例的研究对象来自于3个独立医学中心的60例肝癌和60例胆管癌血清样本以及60例体检正常的健康对照血清样本，与特征筛选样本同一来源。本发明实施例2的检测分析方法与本发明实施例1的相同。以4个血清代谢组合(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)为诊断特征，本发明实施例1中754例(健康340例，肝癌220例，胆管癌194例)样本作为训练集，本发明实施例2中180例样本作为测试集，考察筛选出来的血清诊断标志物组合(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)对肝癌和胆管癌诊断准确性，结果如附图16和表7所示，血清诊断标志物组合(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)对健康组和肝癌组，以及健康组和胆管癌组具有很好的判别分析能力，诊断的准确性分别达到了91.7％和86.7％，远高于AFP做为肝癌诊断标志物的准确性(60-70％)。因此，本发明的代谢标志物组合可以有效地诊断出肝胆疾病，降低肝癌和胆管癌漏检率，非常有利于肝癌和胆管癌的早诊早治，对于改善肝癌和胆管癌预后，降低肝癌和胆管癌的死亡率有很大帮助，具有良好的临床使用和推广价值。在实际应用中，可以按照本发明建模方法选取更多的样本和更多的代谢物组合进行建模，增加模型的准确度。

表7.使用血清诊断标志物组合(GCDA+CDCA+LPC18-0+AA)对肝癌和胆管癌诊断准确性考察

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，基于本发明思想的其他实施方式也将落入本发明权利要求的保护范围内。