具体实施方式

许多现代疫苗都包括佐剂，其可激活免疫系统并且提供增强的体液或细胞反应。当前批准的佐剂无法针对某些病原体(例如HIV或登革热)提供所需的反应。已开发许多新的佐剂并且显示出有希望的结果，但来自这些佐剂诱发的炎症反应的副作用导致FDA批准有限。目前尚无佐剂具有独立调节炎症和保护的能力。本公开提供包含NF-кB抑制剂与佐剂组合的方法和组合物，其可以限制与疫苗接种相关的炎症和副作用，同时使用多种佐剂保留保护性反应。所得疫苗减少全身炎症并且增强抗体反应。在流感攻击模型中，该方法在实施例中证明以增强保护。该方法适用于广泛的佐剂和抗原。

I.定义

如本文所用，术语“佐剂”是指与单独施用抗原相比，在施用抗原之前、与抗原一起施用或施用抗原之后施用时，加速、延长和/或增强针对抗原的免疫应答的品质和/或强度的物质。

如本文所用，术语“疫苗”旨在表示可施用于人或动物以诱导免疫系统反应的组合物；该免疫系统反应可导致产生抗体或仅激活某些细胞，特别是抗原呈递细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞。在某些实施方案中，疫苗能够产生导致患者产生关于疫苗中提供的抗原的中和抗体的免疫应答。疫苗可以是用于预防目的或治疗目的或两者的组合物。

如本文所用，术语“抗原”是指可用于疫苗中的任何抗原，无论其涉及完整微生物还是其一部分，以及各种类型：(例如，肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、糖脂、脂肽等)。因此，术语“抗原”是指可以在抗原接受者体内引发体液和/或细胞免疫应答的分子。在特定实施方案中，抗原是引起疫苗接种会有利治疗的疾病的分子。在一些实施方案中，抗原包含如下物质，其用于刺激抗体的产生并且提供抵抗一种或多种疾病的免疫力，由疾病的病原体、其产品或合成替代品制备，经处理作为抗原而不诱发疾病。在一些实施方案中，抗原包含肽或多肽。

如本文所用，术语“减毒重组病毒”是指如下病毒，其已通过现代分子生物学方法例如限制性内切核酸酶和连接酶处理进行遗传改变，并且通常通过删除特定基因或通过在非天然宿主细胞系中或在低温下连续传代而使其毒力低于野生型。

术语“药学上可接受的载体”是指不会在其施用对象中引起过敏反应或其他不良反应的载体。合适的药学上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多于一种及其组合。此外，如果需要，疫苗可包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂和pH缓冲剂。

术语“芳基”包括未经杂原子取代的芳基、经杂原子取代的芳基、未经杂原子取代的Cn芳基、经杂原子取代的Cn芳基、杂芳基、杂环芳基、碳环芳基、联芳基和衍生自多环稠合烃(PAH)的单价基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳基”是指如下基团，其具有单个碳原子作为连接点，其中碳原子是仅包含碳原子的芳环结构的一部分，还具有总共n个碳原子、5个或更多氢原子并且无杂原子。例如，未经杂原子取代的C6-C10芳基具有6至10个碳原子。未经杂原子取代的芳基的非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C₆H₄CH₂CH₃、-C₆H₄CH₂CH₂CH₃、-C₆H₄CH(CH₃)₂、-C₆H₄CH(CH₂)₂、-C₆H₃(CH₃)CH₂CH₃、-C₆H₄CH＝CH₂、-C₆H₄CH＝CHCH₃、-C₆H₄C≡CH、-C₆H₄C≡CCH₃、萘基和衍生自联苯的基团。术语“经杂原子取代的Cn芳基”是指如下基团，其具有单个芳族碳原子或单个芳族杂原子作为连接点，还具有总共n个碳原子、至少一个氢原子和至少一个杂原子，进一步其中杂原子各自独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C1-C10杂芳基具有1至10个碳原子。杂原子取代的芳基的非限制性实例包括基团：-C₆H₄F、-C₆H₄Cl、-C₆H₄Br、-C₆H₄I、-C₆H₄OH、-C₆H₄OCH₃、-C₆H₄OCH₂CH₃、-C₆H₄OC(O)CH₃、-C₆H₄NH₂、-C₆H₄NHCH₃、-C₆H₄N(CH₃)₂、-C₆H₄CH₂OH、-C₆H₄CH₂OC(O)CH₃、-C₆H₄CH₂NH₂、-C₆H₄CF₃、-C₆H₄CN、-C₆H₄CHO、-C₆H₄CHO、-C₆H₄C(O)CH₃、-C₆H₄C(O)C₆H₅、-C₆H₄CO₂H、-C₆H₄CO₂CH₃、-C₆H₄CONH₂、-C₆H₄CONHCH₃、-C₆H₄CON(CH₃)₂、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、吲哚基和咪唑基。在某些实施方案中，设想了经杂原子取代的芳基。在某些实施方案中，设想了未经杂原子取代的芳基。在某些实施方案中，芳基可以被一个或多于一个含杂原子的取代基进行单取代、二取代、三取代、四取代或五取代。

术语“烷氧基”包括直链烷氧基、带支链的烷氧基、环烷氧基、环状烷氧基、未经杂原子取代的烷氧基、经杂原子取代的烷氧基、未经杂原子取代的C_n烷氧基和经杂原子取代的C_n烷氧基。在某些实施方案中，设想了低级烷氧基。术语“低级烷氧基”是指1至6个碳原子(即1、2、3、4、5或6个碳原子)的烷氧基。术语“未经杂原子取代的C_n烷氧基”是指具有-OR结构的基团，其中R为未经杂原子取代的C_n烷基，如该术语如上所定义。未经杂原子取代的烷氧基包括：-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₃、-OCH(CH₃)₂和-OCH(CH₂)₂。术语“经杂原子取代的C_n烷氧基”是指具有-OR结构的基团，其中R为经杂原子取代的C_n烷基，如该术语如上所定义。例如，-OCH₂CF₃是经杂原子取代的烷氧基。

术语“烯基”包括含有一个双键并且具有2至6个碳原子的直链和带支链的烃基，例如，乙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等。术语“烯氧基”是指烯基醚基团，其中烯基如上定义。

术语“烯丙基”是指基团H₂C＝CH─CH₂。术语“醚”是指通过氧与另一个烃基连接的烃基。因此，烃基的醚取代基可以是烃基-O-。醚可以是对称或不对称的。醚的实例包括但不限于乙烯基醚和烯丙基醚。术语“乙烯基”是指包含碳-碳双键的分子部分。

本文所述的各种基团，包括羟基、芳基、烯氧基、烷氧基和烯基，可以任选地被一个或多于一个取代基取代。取代基的非限制性实例包括卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、巯基、甲酰基、羧基、氨基甲酰基、烷基、杂烷基、烷氧基、烷基硫基、烷基氨基、(烷基)₂氨基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。

如本文说明书中所用，“一个”或“一种”可表示一个(种)或多个(种)。如本文权利要求中所用，当与措辞“包含”结合使用时，措辞“一个”或“一种”可以表示一个(种)或多于一个(种)。

权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个(种)”可表示至少第二个(种)或更多。

在整个该申请中，术语“约”用于表示一个值包括用于确定值的装置、方法的误差的固有变化，或研究对象之间存在的变化。

术语“主要由...组成”可以包括列举的活性成分，例如列举的抗原、佐剂和/或NFкB抑制剂，以及任何未列举的缓冲剂、药物赋形剂等，但不包括任何其他活性成分，如其他抗原、佐剂和/或NFкB抑制剂。

II.NFкB抑制剂

NFкB是指活化B细胞的核因子κ-轻链增强子。下表提供在本公开的方法和组合物中有用的NFкB抑制剂。

预想在本公开的某些实施方案中具体排除上表中的一种或多于一种NFкB抑制剂。

III.佐剂

几十年来，疫苗接种策略主要用于培养保护性免疫力，以防止患者在接触传染源后免于患上疾病。共同施用佐剂可以进一步刺激特异性免疫应答。

佐剂具有不同的作用机制。首先确定的佐剂作用机制是所谓的储存效应，其中凝胶型佐剂如氢氧化铝(明矾)或乳液型佐剂如不完全弗氏佐剂(IFA)与抗原结合并且促进抗原运输至引流淋巴结，其中产生免疫应答。在一些实施方案中，本公开的方法和组合物中使用凝胶型佐剂。

佐剂诱导的各种细胞因子作用于淋巴细胞，以主要促进Th1或Th2反应。在一些实施方案中，佐剂包含细胞因子。示例性细胞因子包括IFN-γ、GM-CSF和白细胞介素-(IL)-12。预想在本公开的某些实施方案中具体排除该段落所列举的一种或多于一种佐剂。

另一组佐剂通过toll样受体起作用。Toll样受体(TLR)识别微生物成分、特别是来自病原体的成分的特定模式，并且调节先天免疫和适应性免疫的激活。未成熟的树突细胞响应这些微生物成分而成熟。迄今为止，已经识别TLR家族的10个成员。TLR激动剂可用作本公开的方法和组合物中的佐剂。TLR激动剂下面进一步描述。

TLR激动剂在本领域中是已知的。TLR激动剂可包括对于如下的激动剂：TLR1(例如肽聚糖或三酰基脂蛋白)、TLR2(例如脂磷壁酸；来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌0111:B4、大肠杆菌K12或金黄色葡萄球菌的肽聚糖；非典型脂多糖(LPS)，例如钩端螺旋体病LPS和牙龈卟啉单胞菌LPS；合成二酰化脂蛋白，例如FSL-1或Pam2CSK4；来自耻垢分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖或脂甘露聚糖；三酰化脂蛋白，例如Pam3CSK4；来自支原体的脂蛋白，例如MALP-2和MALP-404；伯氏疏螺旋体OspA；来自脑膜炎奈瑟菌或流感嗜血杆菌的孔蛋白；耶尔森氏菌；来自分枝杆菌或结核分枝杆菌的脂甘露聚糖；克氏锥虫GPI锚；曼氏血吸虫溶血磷脂酰丝氨酸；利什曼原虫主要脂磷聚糖(LPG)；恶性疟原虫糖磷脂酰肌醇(GPI)；zymosan)、TLR3(例如双链RNA、聚腺苷酸-聚尿苷酸(Poly(A:U))；聚肌苷-聚胞苷酸(Poly(I:C))；聚肌苷-聚胞苷酸高分子量(Poly(I:C)HMW)；和聚肌苷-聚胞苷酸低分子量(Poly(I:C)LMW))、TLR4(例如来自大肠杆菌和沙门氏菌种的LPS)；TLR5(例如来自枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌或鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白)、TLR8(例如单链RNA，例如具有6UUAU重复序列的ssRNA、RNA均聚物(裸ssPolyU)、HIV-1LTR衍生的ssRNA(ssRNA40)，或具有2个GUCCUUCAA重复序列的ssRNA(ssRNA-DR)、TLR7(例如咪唑喹啉化合物咪喹莫特、咪喹莫特VacciGrade^TM、嘎德莫特VacciGradee^TM或Gardiquimod^TM；腺嘌呤类似物CL264；碱类似物CL307；鸟苷类似物洛索立滨；TLR7/8(例如噻唑喹啉化合物CL075；咪唑喹啉化合物CLO97、R848或R848VacciGrade^TM)、TLR9(例如CpG ODN)；和TLR11(例如刚地弓形虫抑制蛋白)。在某些实施方案中，TLR激动剂是上面列出的特定激动剂。在进一步的实施方案中，TLR激动剂是特异性激动一种TLR或两种TLR的激动剂。在某些实施方案中，TLR是上面列出的TLR9激动剂。预想该段落所列举的一种或多于一种佐剂在本公开的某些实施方案中具体排除。

在一些实施方案中，TLR选自脂磷壁酸；来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌0111:B4、大肠杆菌K12或金黄色葡萄球菌的肽聚糖；非典型脂多糖(LPS)，例如钩端螺旋体病LPS和牙龈卟啉单胞菌LPS；合成二酰化脂蛋白，例如FSL-1或Pam2CSK4；来自耻垢分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖或脂甘露聚糖；三酰化脂蛋白，例如Pam3CSK4；来自支原体的脂蛋白，例如MALP-2和MALP-404；伯氏疏螺旋体OspA；来自脑膜炎奈瑟菌或流感嗜血杆菌的孔蛋白；耶尔森氏菌；来自分枝杆菌或结核分枝杆菌的脂甘露聚糖；克氏锥虫GPI锚；曼氏血吸虫溶血磷脂酰丝氨酸；利什曼原虫主要脂磷聚糖(LPG)；恶性疟原虫糖磷脂酰肌醇(GPI)；和酵母多糖。预想该段落所列举的一种或多于一种佐剂在本公开的某些实施方案中具体排除。

IV.抗原

如本文所用，术语“抗原”是指对象可以针对其引发体液和/或细胞免疫应答的分子。抗原可以是任何类型的生物分子，例如简单的中间代谢产物、糖类、脂质和激素，以及大分子，例如复杂的碳水化合物、磷脂、核酸、蛋白质。常见的抗原类别包括但不限于病毒抗原、病原体抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫病、过敏和移植排斥的抗原以及其他杂项抗原。在本公开的某些组合物和方法中，抗原是肽。

发明人证明NFкB抑制剂改善了疫苗抵抗Th1反应性疾病的结果，并且NFкB抑制剂与来自黄病毒家族、正粘病毒、慢病毒、逆转录病毒和细菌病原体的抗原一起工作。发明人还发现粘膜组织中的IgA抗体增加，这将能够增强对性传播疾病、上呼吸道疾病和肠道病毒的保护。在本公开的方法和组合物中有用的抗原包括，例如，来自如下的抗原成分：炭疽、癌症、基孔肯雅热、登革热(1,2,3,4-登革热)、白喉、大肠杆菌、产志贺毒素(STEC)、埃博拉、非脊髓灰质炎肠道病毒、肠道病毒D68(EV-D68)、淋病、甲型肝炎(Hepatitis A)(甲型肝炎(Hep A))、乙型肝炎(Hepatitis B)(乙型肝炎(Hep B))、丙型肝炎(Hepatitis C)(丙型肝炎(Hep C))、丁型肝炎(Hepatitis D)(丁型肝炎(Hep D))、戊型肝炎(Hepatitis E)(戊型肝炎)(Hep E))、疱疹、带状疱疹、HIV、HPV、流感、疟疾、麻疹、病毒性脑膜炎、细菌性脑膜炎、腮腺炎、诺如病毒、百日咳、鼠疫；腺病毒、败血症、肺炎、肺炎球菌病、脊髓灰质炎(Poliomyelitis)(脊髓灰质炎(Polio))、脓疱性皮疹病(天花、猴痘、牛痘)、Q热病、狂犬病、沙门氏菌肠胃炎(沙门氏菌)、严重急性呼吸系统综合症、志贺氏菌病(志贺氏菌)、天花、破伤风、结核病、水痘(Varicella)(水痘(Chickenpox))、病毒性出血热(埃博拉、拉沙、马尔堡)、西尼罗河病毒、黄热病、耶尔森氏菌(Yersenia)(耶尔森氏菌(Yersinia))和寨卡病毒感染。预想该段落所列举的一种或多于一种抗原和抗原成分在本公开的某些实施方案中具体排除。

在本公开的方法和组合物中有用的抗原的进一步实例在下文和整个公开内容中提供。

A.病毒抗原

病毒抗原的实例包括但不限于，逆转录病毒抗原，例如来自人免疫缺陷病毒(HIV)抗原的逆转录病毒抗原，例如gag、pol和env基因的基因产物、Nef蛋白、逆转录酶和其他HIV成分；肝炎病毒抗原，例如乙型肝炎病毒的S、M、L蛋白，乙型肝炎病毒的前S抗原，其他肝炎，例如甲、乙、丙型肝炎，病毒成分例如丙型肝炎病毒RNA；流感病毒抗原，例如血凝素和神经氨酸酶以及其他流感病毒成分；麻疹病毒抗原，例如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒成分；风疹病毒抗原，例如蛋白E1、E2和其他风疹病毒成分；轮状病毒抗原，例如VP7sc和其他轮状病毒成分；巨细胞病毒抗原，例如包膜糖蛋白B和其他巨细胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原，例如RSV融合蛋白、M2蛋白和其他呼吸道合胞病毒成分；单纯疱疹病毒抗原，例如即刻早期蛋白、糖蛋白D和其他单纯疱疹病毒抗原成分；水痘带状疱疹病毒抗原，例如gpI、gpII和其他水痘带状疱疹病毒抗原成分；乙型脑炎病毒抗原，例如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS 1、NS 1-NS2A、80％E，和其他乙型脑炎病毒抗原成分；狂犬病毒抗原，例如狂犬糖蛋白、狂犬病毒核蛋白和其他狂犬病毒抗原成分。对于病毒抗原的其他实例，参见Fundamental Virology，第二版，e's.Fields,B.N.and Knipe,D.M.(Raven Press,NewYork、1991)。预想该段落所列举的一种或多于一种抗原和抗原成分在本公开的某些实施方案中具体排除。

B.细菌抗原

可用于本公开的组合物和方法的细菌抗原包括但不限于，百日咳细菌抗原，例如百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌抗原成分；白喉细菌抗原，例如白喉毒素或类毒素和其他白喉细菌抗原成分；破伤风细菌抗原，例如破伤风毒素或类毒素和其他破伤风细菌抗原成分；链球菌细菌抗原，例如M蛋白和其他链球菌细菌抗原成分；革兰氏阴性杆菌细菌抗原，例如脂多糖和其他革兰氏阴性细菌抗原成分；结核分枝杆菌细菌抗原，例如分枝菌酸、热休克蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其他分枝杆菌抗原成分；幽门螺杆菌细菌抗原成分；肺炎球菌细菌抗原，例如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌荚膜多糖和其他肺炎球菌细菌抗原成分；流感嗜血杆菌细菌抗原，例如荚膜多糖和其他流感嗜血杆菌细菌抗原成分；炭疽细菌抗原，例如炭疽保护抗原和其他炭疽细菌抗原成分；立克次体细菌抗原，例如romps和其他立克次体细菌抗原成分。本文所述的细菌抗原还包括任何其他细菌、分枝杆菌、支原体、立克次体或衣原体抗原。预想该段落所列举的一种或多于一种抗原和抗原成分在本公开的某些实施方案中具体排除。

C.真菌抗原

可用于本公开的组合物和方法的真菌抗原包括但不限于，念珠菌真菌抗原成分；组织胞浆菌抗原，例如热休克蛋白60(HSP60)和其他组织胞浆菌抗原成分；隐球菌真菌抗原，例如荚膜多糖和其他隐球菌真菌抗原成分；球孢子菌真菌抗原，如小球抗原和其他球孢子菌真菌抗原成分；和癣真菌抗原，例如毛癣菌素和其他球虫真菌抗原成分。预想该段落所列举的一种或多于一种抗原和抗原成在本公开的某些实施方案中具体排除。

D.寄生虫抗原

原生动物和其他寄生虫抗原的实例包括但不限于，恶性疟原虫抗原，例如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子体/配子表面抗原、血期抗原pf 1 55/RESA和其他疟原虫抗原成分；弓形虫抗原，例如SAG-1、p30和其他弓形虫抗原成分；血吸虫抗原，例如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其他血吸虫抗原成分；主要利什曼原虫和其他利什曼原虫抗原，例如gp63、脂磷聚糖及其相关蛋白和其他利什曼原虫抗原成分；和克氏锥虫抗原，例如75kDa至77kDa抗原、56kDa抗原和其他锥虫抗原成分。预想该段落所列举的一种或多于一种抗原和抗原成分在本公开的某些实施方案中具体排除。

E.肿瘤抗原

可用于本公开的组合物和方法的肿瘤抗原包括但不限于，端粒酶成分；多药耐药性蛋白，例如P-糖蛋白；MAGE-1、甲胎蛋白、癌胚抗原、突变型P53、B细胞源性恶性肿瘤的免疫球蛋白、由染色体易位并列的基因表达的融合多肽、人绒毛膜促性腺激素、降钙素、酪氨酸酶、乳头状瘤病毒抗原、神经节苷脂或黑色素瘤或其他肿瘤细胞的其他含碳水化合物成分。本公开内容预期来自任何类型的肿瘤细胞的抗原可用于本文所述的组合物和方法。预想该段落所列举的一种或多于一种抗原和抗原成分在本公开的某些实施方案中具体排除。

F.与自身免疫相关的抗原

涉及自身免疫疾病、变态反应和移植排斥的抗原可用于本公开的组合物和方法。例如，涉及以下任何一种或多种自身免疫疾病或病症的抗原可用于本公开的内容：糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)、多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、牛皮癣、干燥综合征、包括继发于干燥综合征的角结膜干燥症、斑秃、节肢动物咬伤引起的过敏反应、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感音神经性听力损失、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、克罗恩氏病、格雷夫斯眼病、肉样瘤病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化。参与自身免疫性疾病的抗原的实例包括谷氨酸脱羧酶65(GAD 65)、天然DNA、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂蛋白脂质、乙酰胆碱受体成分、甲状腺球蛋白和甲状腺刺激激素(TSH)受体。涉及变态反应的抗原的实例包括花粉抗原，例如日本雪松花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原，动物源性抗原例如尘螨抗原和猫抗原，组织相容性抗原，和青霉素，以及其他治疗药物。涉及移植排斥的抗原的实例包括待移植到移植受体中的移植体的抗原成分，例如心脏、肺、肝脏、胰腺、肾脏和神经移植成分。抗原也可以是用于治疗自身免疫性疾病的改变的肽配体。预想该段落所列举的一种或多于一种抗原和抗原成分在本公开的某些实施方案中具体排除。进一步预想自身抗原在本公开的实施方案中具体排除。

可用于本公开的组合物和方法的混合抗原的实例包括内源性激素例如促黄体激素、促卵泡激素、睾酮、生长激素、催乳素和其他激素，成瘾药物例如可卡因和海洛因，和抗原受体的独特型片段，例如抗瘦素受体抗体的含Fab部分。

V.药物组合物

组合物的施用通常将通过任何普通途径进行。这包括但不限于肠胃外、原位、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、鼻内或静脉内注射。在某些实施方案中，可以吸入疫苗组合物(例如，美国专利第6,651,655号，将其具体通过引入并入)。适用于其他施用方式的其他制剂包括口服制剂。口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂的形式，并且含有约10％至约95％，优选约25％至约70％的活性成分。

通常，组合物以与剂量制剂相容的方式施用，并且以治疗有效和免疫修饰的量施用。施用量取决于待治疗对象。需要待施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断。

施用方式可以广泛地变化。任何施用抗体的常规方法都是适用的。认为这些包括口服施用生理学上可接受的固体基质或生理学上可接受的分散体、肠胃外施用、通过注射施用等。药物组合物的剂量将取决于施用途径并且将根据对象的大小和健康状况而变化。

在许多情况下，需要最多约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次的多次施用。施用可以是2天到12周的间隔，更通常是1到2周的间隔。施用过程之后可以进行同种异体反应性免疫应答和T细胞活性的测定。

短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不良反应、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则预想到其在免疫原性和治疗组合物中的用途。

佐剂、抑制剂或抗原可配制用于肠胃外施用，例如配制用于经静脉、皮内、肌肉内、皮下甚至腹腔途径进行注射。在一个具体实施方案中，组合物通过皮内注射施用。在进一步的实施方案中，组合物通过静脉注射施用。在进一步的实施方案中，组合物通过肌肉内注射施用。本公开的组合物可以制成注射剂，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射之前加入液体之后制备溶液或悬浮液的固体形式；也可以将制剂乳化。

适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须是可容易注射的流体。它还应该在制造和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

组合物可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成的盐)并且与无机酸如盐酸或磷酸或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

载体还可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，都可以起到防止微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌可注射溶液通过将所需量的活性成分与上面列举的各种其他成分(根据需要)并入适当溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将各种灭菌的活性成分并入包含基本分散介质和上述列举的那些所需其他成分的无菌载体中来制备的。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分。

基于预期目标确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理离散单位，每个单位包含预定量的组合物，其经计算产生上文讨论的与其施用(即合适的途径和方案)相关的所需反应。根据治疗次数和单位剂量的施用量取决于所需的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于从业者的判断，并且因每个人而异。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标(缓解症状与治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗或预防有效的量施用。制剂容易以多种剂型例如上述注射溶液的类型来施用。

VI.治疗方法

如上所述，使用这些组合物的组合物和方法可以治疗患有、怀疑患有或有发展感染或相关疾病的风险的对象(例如，预防感染或引起对抗原的强烈免疫应答)。

如本文所用，短语“免疫应答”或其等同的“免疫学反应”是指针对接受体患者中的本发明的蛋白、肽或多肽的体液(抗体介导的)、细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)或体液和细胞两者的反应。治疗或疗法可以是由施用免疫原诱导的主动免疫应答，或者是由施用抗体、含有抗体的材料或引发的T细胞产生的被动疗法。

细胞介导的免疫应答的存在可以通过增殖测定(CD4(+)T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞反应对免疫原的保护或治疗效果的相对贡献可通过从免疫的同源动物中分别分离IgG和T细胞并且测量第二对象的保护或治疗效果来区分。如本文和权利要求中所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用。

任选地，抗体或优选抗体的免疫学部分可以化学缀合至或表达为与其他蛋白的融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求的目的，所有这种融合蛋白均包括在抗体或抗体的免疫学部分的定义中。

在一个实施方案中，方法包括治疗或预防由病原体引起的疾病或病况。此外，在一些实施例中，治疗包括施用通常用于对抗病毒感染的其他试剂，例如一种或多种抗病毒或抗逆转录病毒化合物。

治疗组合物以与剂量制剂相容的方式施用，并且以治疗有效的量施用。待施用量取决于待治疗的对象。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断。初始施用和加强剂的合适方案也是可变的，但以初始施用后随后后续施用为代表。

施用方式可以广泛地变化。施用治疗性多肽的任何常规方法都是适用的。认为这些包括口服施用生理学上可接受的固体基质或生理学上可接受的分散体、肠胃外施用、通过注射施用等。组合物的剂量将取决于施用途径并且将根据对象的大小和健康状况而变化。

在某些情况下，将需要对组合物进行多次施用，例如，施用2次、3次、4次、5次、6次或多于6次。施用可以是1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周至5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周的间隔，包括其间所有范围。

在某些实施方案中，对象施用约、至少约或最多约如下的微克、mg、μg/kg或mg/kg(或其中可推导出的任何范围)的NFкB抑制剂、佐剂、抗原或组合物：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7.3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0.19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、445、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000。

剂量可以根据需要基于或每隔1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18或24小时(或其中可推导出的任何范围)进行施用或每天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次(或其中可推导出的任何范围)。可以在出现病症之前或之后首先施用剂量。在一些实施方案中，在患者经历或表现出该病况的体征或症状之后的如下时间施用第一剂方案：1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时(或其中可推导出的任何范围)或1天、2、3天、4天或5天(或其中可推导出的任何范围)。患者可接受治疗持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或多于10天(或其中可推导出的任何范围)或直到病况的症状消失或减轻或在感染症状消失或减轻之后6小时、12小时、18小时或24小时后或1天、2天、3天、4天或5天。

VII.组合治疗

组合物和相关方法、特别是施用佐剂和NFкB抑制剂也可与施用传统疗法组合使用。

一方面，预想疗法与抗病毒或抗逆转录病毒治疗结合使用。或者，疗法可以在其他试剂治疗之前或之后间隔数分钟至数周。在其中单独施用其他试剂和/或蛋白质或多聚核苷酸的实施方案中，通常会确保在每次递送时间之间没有很长的时间段，使得治疗组合物仍然能够发挥对对象有利的组合作用。在这种情况下，预想可以在彼此约12至24小时内，更优选地在彼此约6至12小时内施用两种方式。在某些情况下，可需要显著延长施用时间，然而，其中在各自管理之间几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)失效。

在又一方面，疫苗可作为初免/加强免疫策略的一部分施用。可以在本文所述的任何实施方案中施用初免疫苗剂量。可以通过使用相同类型或不同类型疫苗的第二疫苗施用疫苗加强。这种不同疫苗的实例包括裸DNA疫苗或重组痘病毒。

可以采用多种组合疗法，例如佐剂是“A”和NFкB抑制剂是“B”：

向患者/对象施用组合物将遵循施用这种化合物的一般方案，并且考虑到组合物的毒性，如果有的话。预计治疗周期将根据需要重复。还预想到各种标准疗法例如水合作用可以与组合。

VIII.实施例

包括以下实施例以表明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开的内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得同样或相似的结果。

实施例1–通过NF-кB调节提高疫苗安全性和改善疫苗保护的免疫增强剂

本实施例描述了使用免疫增强剂将部分炎症反应与几种佐剂的抗原呈递作用分离的方法。使用广泛的TLR激动剂，发明人在体外和体内证明了使用免疫增强剂减少促炎细胞因子同时维持适应性免疫功能。在体内，发明人发现将免疫增强剂与2017-2018流感疫苗共同施用减少与疫苗接种相关的副作用并增加保护。免疫增强剂与CpG-ODN1826(CpG)和登革热衣壳蛋白的共同施用导致疫苗接种后全身性促炎细胞因子的消除，并产生增加的中和抗体。此外，将免疫增强剂与CpG和gp120(一种HIV病毒衣壳蛋白)一起施用，增加血清IgG和阴道IgA抗体并改变IgG抗体表位识别。最后，发明人观察到几种TLR激动剂的免疫增强作用，暗示了一种通用方法。免疫增强可用于减少许多佐剂疫苗与炎症相关的全身副作用(19)，为安全使用许多PRR激动剂创造潜力，增加适应性免疫谱的多样性，并扩大疾病预防和治疗的范围。

A.免疫增强剂的选择

在寻求免疫增强方法的过程中，发明人探索了对TLR激活途径的广泛研究。这种强大的机制框架让发明人假设TLR激活如何指导炎性细胞因子和抗原呈递。随着TLR途径与NF-кB激活汇合，炎症和适应性反应NF-кB，亚基被激活而发生分歧，发明人假设他们可以通过选择性抑制来解耦这些过程，从而导致副作用减少，但保持适应性反应。TLR激活后，转录因子NF-кB启动促炎细胞因子(如IL-6和TNF-α)和细胞表面受体(如MHC-II、CD40、CD80和CD86)的转录(20-22)。NF-кB家族是转录因子家族，由两个亚基组成：DNA结合域和转录激活子(23、24)。每个NF-24二聚体控制不同组基因的表达，用于不同的细胞过程，大体上，一些二聚体控制炎症表达，而另一些二聚体控制抗原呈递(23-25)。发明人推测，选择性地调节通路可导致抗原呈递增加，同时减少炎症。NF-кB抑制剂已广泛用于降低肿瘤中的细胞因子表达(26-29)、自身免疫性疾病(30,31)和败血症(32-34)，但它们尚未被用作免疫增强剂。这种缺乏实验研究可能是因为，人们普遍理解NF-кB激活是建立足够的适应性免疫应答所必需的(29,35)。然而，只有某些亚基介导抗原呈递(36)。作为概念验证免疫增强剂，发明人选择SN50(一种细胞渗透性肽)，其由NF-кB亚基p50的核定位序列(NLS)组成，阻断含有p50的二聚体进入细胞核(37)。

首先，发明人试图确定SN50是否能够抑制先天免疫细胞的NF-кB。发明人证实SN50以剂量依赖性方式降低人(THP-1单核细胞)和小鼠(RAW巨噬细胞)细胞中的总NF-кB的活性(图5A-D)。

B.CpG诱导的炎症和由此产生的免疫应答的检查

发明人试图验证SN50会使抗原呈递细胞能够上调细胞表面受体，同时限制促炎细胞因子的产生。发明人用SN50和CpG或单独的CpG孵育鼠骨髓衍生的树突细胞(BMDC)6小时，并分析增效剂如何改变细胞因子产生和细胞表面受体表达(图1A)。细胞内细胞因子染色显示，用SN50处理的细胞表现出，表达TNF-α的细胞减少21％，表达IL-6的细胞减少13％。同时，CD86上调22％，CD40仅下调2.5％。因为p65-p50二聚体是在静息细胞中发现的最丰富的二聚体并且参与炎性细胞因子的产生，发明人推测通过抑制该二聚体，它们能够在限制炎性细胞因子的同时实现细胞表面受体的转录和翻译。这与之前的敲除实验一致(36)。结果是降低炎症反应，同时启动有效的适应性免疫通讯。

在观察到SN50可以限制炎症而不降低体外细胞表面受体表达后，发明人接着想要检查体内效果。为了确定抑制NF-кB是否可以降低与CpG疫苗接种相关的促炎细胞因子的全身水平，发明人用100μg卵清蛋白(OVA)和PBS、SN50(500μg)、CpG(50μg)、SN50+CpG或SN50M(500μg)+CpG肌肉注射(i.m.)接种小鼠。SN50M是SN50的物理对照，因为它是一种弱得多的抑制剂。发明人选择测量促炎细胞因子TNF-α和IL-6的全身水平，因为高水平是不安全的并且会导致副作用(17、18,38)。发明人在所有组中在注射后1小时、3小时、6小时、24小时和48小时测量这些促炎细胞因子以确定响应CpG接种的细胞因子达到峰值的时间点(图1B、图1C、图6A、图6B)。接种OVA和PBS或单独接种SN50的小鼠未引起全身细胞因子反应。CpG在1小时时间点显示出TNF-α(1325pg/mL)和IL-6(1269pg/mL)的最高响应。对两种细胞因子来说，CpG+SN50组显示完全消除了细胞因子。尽管不如CpG+SN50观察到的幅度大，CpG+SN50M组显示出细胞因子水平的降低。发明人证实炎性细胞因子的这种减少是由于注射SN50M引起的高度局部抑制而不是物理聚集(图7)。为了确定SN50如何影响体液反应，发明人分析了第28天的血清抗体水平(图1D)。与单独的PBS相比，CpG组表现出抗OVA抗体增加2.4倍。接种有CpG+SN50的小鼠表现出比PBS组增加5.9倍，比CpG组增加2.7倍。这些数据证实高水平的全身TNF-α和IL-6可以与体液、适应性免疫应答分离的假设。发明人惊讶地发现，SN50的添加增强了下游适应性反应，导致免疫增强。由于这种适应性反应的增加和疫苗接种后安全性的提高，发明人认为SN50是一种免疫增强剂。

C.确定作用机制

为了更直接地检查TNF-α和IL-6的早期全身表达如何影响即时炎症反应和下游适应性反应，发明人用CpG和TNF-α中和抗体(TNF-αN)或IL-6中和抗体(IL-6N)接种小鼠，并测量全身细胞因子(图1E、1F)。CpG+IL-6N组显示TNF-α表达降低1.4倍，全身IL-6表达完全降低。CpG+TNF-αN组表现出全身TNF-α的完全消除和IL-6表达降低3倍。该结果得到了对照同种型抗体的证实，以排除任何非特异性相互作用。尽管IL-6N和TNF-αN对组均表现出更高的平均抗体滴度，但这些差异不是统计学上显著的(图1G)。这表明通过初始疫苗接种减少来自CpG的炎症对抗体滴度无害。

在观察到这种体内调节后，发明人试图确定SN50是局部作用还是全身作用。为了检验这种机制，发明人在左下肢肌肉注射SN50，并在右下肢立即注射CpG+OVA(SN50,L+CpG,R)。CpG和SN50,L+CpG,R组之间测试的全身细胞因子水平没有显著差异(图1H、1I)，而同时注射的SN50+CpG证明TNF-α和IL-6减少。在第28天，发明人分析了抗体滴度，发现SN50+CpG和SN50,L+CpGR组之间有5.5倍的差异(图1J)。这证明共同施用组分的重要性，因此表明SN50正在局部发挥作用，以提高安全性和保护性。

从这些实验中，发明人得出结论，SN50在注射部位局部起作用以抑制即时细胞因子产生，在它全身分布之前抑制炎症。基于发明人的体外数据，发明人认为CpG+SN50能够以降低的水平局部产生TNF-α和IL-6。发明人的体外数据表明，暴露于CpG+SN50的免疫细胞表达更高水平的细胞表面受体，这对抗原呈递和有效T细胞活化很重要。发明人的实验证实SN50减少全身炎症并增加体内抗体滴度。

D.体内流感攻击模型中的免疫增强

发明人接下来想要关注SN50可能如何转变为攻击性疫苗。发明人选择流感疫苗作为概念验证疫苗接种，这是因为其普遍性和相对易于用多个参数进行动物攻击实验。发明人试图确定SN50是否会减少与强佐剂性相关的副作用，并观察这种对全身细胞因子的改变对保护作用的影响。发明人肌肉注射2017/2018流感季节四价疫苗(Fz)接种小鼠，其含或不含CpG(50μg)作为免疫佐剂，和500μg SN50(SN50 H)或50μg SN50(SN50 L)作为免疫增强剂。Fz+SN50组较单独Fz的TNF-α水平低(图2B，2C)。在所有组中，SN50的加入将TNF-α与IL-6的水平降至与安慰剂组一致的水平。为了检验SN50是否能减轻接种疫苗的副作用，发明人分析了接种疫苗后24小时、48小时和72小时体重变化百分比(图2D、图8)。体重减轻是衡量小鼠副作用的最简单、最客观的方法。到24小时的时间点，接种Fz和Fz+SN50的小鼠分别平均损失0.85％和0.75％。Fz+Cp组平均损失5.9％。添加SN50 H将重量损失量减少到2.4％，SN50 L减少到5.1％。在第72小时，Fz组的体重是起始体重的-1.1％，而接种Fz+SN50的小鼠体重增加+1.5％。Fz+CpG组减少了-1.6％的起始重量，添加SN50 H导致重量损失减少(0％变化)，添加SN50 L导致-1.3％变化。总体而言，含有SN50小鼠的体重减轻比不含SN50的小鼠少，这表明SN50降低了与疫苗接种相关的副作用。

发明人接着想看添加SN50是否会改变T细胞反应或抗体滴度。在第14天，发明人分析了脾细胞的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞。发明人观察到含有和不含SN50的样品之间没有统计学上的显著差异(图2E、2F)。在第28天，发明人分析了血液中血清的抗体水平(图2G和图9-11)。Fz和Fz+SN50之间的IgG滴度没有显著差异。Fz样品与Fz+CpG之间存在2.9倍的显著差异。接种有CpG的组之间没有显著差异，这意味着添加SN50减少疫苗接种的炎症和副作用，同时保持抗体滴度。

发明人接着试图确定SN50是否会增加对Fluzone的保护。用105PFU A/Michigan/45/2015鼻内对小鼠进行致命攻击。在攻击后第3天，发明人分析了三只小鼠的肺部的病毒滴度(图12)。攻击后14天分析存活率(图2H)。到第7天，所有安慰剂小鼠和60％的Fz小鼠都达到了人道终点并被安乐死。所有其它老鼠都存活了下来。Fz+SN50组比Fz单独组明显受到更多保护。将SN50添加到Fz+CpG提供同等保护，同时改善初始疫苗接种的副作用。出乎意料的是，简单地将SN50添加到Fz赋予了相当于Fz+CpG组的增强保护。

分析小鼠在攻击实验后14天的体重和体温变化(图2I、2J、图13)。Fz(-9.9％)和Fz+SN50(-2.67％)之间的峰值平均体重减轻是统计学上显著的。更大的体重减轻与更强烈的感染有关，这些数据表明在Fz中添加SN50提高对感染的反应。将SN50添加到Fz+CpG没有显示出体重减轻的显著变化，这表明SN50可以减少全身细胞因子和疫苗接种的副作用，而不会对保护性反应产生有害影响。

作为疾病病理学的附加参数，发明人检查了攻击后的体温。与人类不同的是，小鼠表现出感染后体温降低(39)。安慰剂的峰值温度下降幅度最大(-4.57℃)，其次是Fz组(-1.58℃)(图2J)。在Fz或Fz+CpG中添加SN50减轻所有组的体温下降。

新疫苗佐剂的安全性和保护性通常被认为是两个相互依存的变量，具有相反的关系，通过限制安全性获得充分的保护，反之亦然。由于这种增强剂使疫苗更安全和更具保护性，发明人寻求单一方法来分析SN50是如何改变安全性和保护性的。由于这些变量被认为是负相关的，因此很少有相关的先例。然而，在各个领域广泛使用的通用评分系统是基于四分位数的评分系统(40-43)。遵循评分系统的先例，发明人开发了安全性与保护的关系图(图2K)。此图仅用作所有收集数据的直观总结。所有包括疫苗接种SN50的组都提高了疫苗的安全性和保护性。当所有数据被收集在一起时，发明人得出结论，SN50作为免疫增强剂，既提高了安全性，又提高了疫苗的保护效果。

接着，发明人想研究这种免疫增强剂是否能提高安全性，并在更广泛的疾病和抗原中维持适应性反应。发明人选择接种登革热和艾滋病疫苗是因为它们代表了活性疫苗研究的其他重要疾病。在每一种情况下，都已经确定了当前方法的攻击，并且发明人想明白SN50是否能帮助应对这些攻击，以及维持目前疫苗接种策略的功能。对于登革热来说，主要的攻击是产生抗体来中和病毒，抑制细胞吸收。对于HIV来说，关键的攻击是在粘膜界面产生IgA抗体，以及诱导广泛的靶向选择表位的中和抗体。为了探索加入免疫增强剂是如何影响这些反应中的每一个，发明人更详细地分析了每个抗原组。

E.检测免疫增强剂对登革热的中和作用

为了进一步探索登革热，发明人用登革血清型2(DENV-2C)的衣壳蛋白和CpG(50μg)、CpG+500μg SN50接种小鼠。SN50完全消除了全身细胞因子的表达(图3A，3B)。第28天，发明人分析抗体滴度的差异(图3C)。CpG+SN50小鼠的抗体滴度几乎2倍高于CpG组。

为了确定SN50是否改变中和潜力，发明人分析了四株登革热病毒的中和滴度(图3D)。发明人测试了四份血清样本与一种代表每个登革热血清型的菌株。两组间的中和潜力差异无显著性差异，这意味着与发明人的流感结果相似，SN50提高疫苗的安全性，同时保持疫苗的保护性反应。

2.免疫增强剂对HIV疫苗接种的影响的分析

为了进一步测试SN50疫苗的效力，并获得诱导体液免疫应答的更广泛的图像，发明人使用CpG作为免疫佐剂，用gp120接种小鼠，gp120是HIV感染所必需的病毒衣壳蛋白并且是许多HIV疫苗的靶点。接种有CpG的小鼠显示出高水平的TNF-α和IL-6，而包括接种有CpG+SN50的小鼠在内的所有其他组在1小时时间点显示出无法检测到的全身细胞因子水平(图3E，3F)。第28天，发明人分析抵抗gp120的抗体滴度。CpG+SN50组诱导的血清中抗gp120的IgG抗体滴度比CpG组高4.7倍(图3G，3H)。这表明SN50的添加增加了多种抗原的IgG抗体滴度，表明它可用作通用的免疫增强剂。因为粘膜特别容易感染艾滋病病毒，所以发明人还测定阴道分泌物中得抗gp120 IgG和IgA抗体滴度(图3I、3J)。CpG+SN50组表明抗gp120 IgA抗体比单独接种有CpG的小鼠增加了4.4倍。这些结果表明，SN50与gp120可有助于诱导类转换为IgA抗体同型，同时也使之能够定位于粘膜。

发明人接着选择使用重叠肽微阵列来确定gp120表位是否有产生的抗体所识别的任何改变。有趣的是，单独由CpG识别的抗原表位数量高于从CpG+SN50小鼠收集的抗体；然而，在CpG+SN50小鼠中识别的抗原表位的荧光平均强度更高(图3K、3L)，这意味着针对这些表位的抗体浓度更高。在仔细检查所识别的特定表位后，发明人发现，将免疫增强剂添加到制剂中改变表位识别，因为不同的表位仅在CpG和CpG+SN50中识别，通常仅在一种或另一种情况下识别(图3M)。对于当前公认的表位不能足以有效地提供保护的疾病，这可能证明是有价值的。CpG+SN50组中识别度最高的表位对应于最近分离的35O22单克隆抗体识别的表位(46)。从接种有CpG+SN50的小鼠中分离的抗体也识别出几种有效的广泛中和抗体(VRC01、VRC03、b12)所识别的CD4结合位点。根据这些数据，发明人证明，就gp120来说，SN50的添加改变了表位选择性。根据血清样本识别的表位，发明人假设这些抗体可具有更广泛的中和作用。

3.改善多种TLR和物种的佐剂反应

为了检查SN50对广泛的TLR激动剂的影响，发明人对用SN50处理的RAW巨噬细胞进行qPCR，然后用不同TLR的激动剂刺激。发明人用SN50和LPS(10ng/mL)、CpG(5μg/mL)、R848(1μg/mL)和Pam3CSK4(100ng/mL)刺激细胞，并将其转录水平与单独用TLR激动剂处理的细胞进行比较(图4A)。发明人选择这些TLR激动剂是因为如果可以控制炎症副作用，则它们代表了具有商业应用潜力的化合物子集。在RAW巨噬细胞中，发明人观察到TNF-α中和IL-6促炎细胞因子转录水平的下调。与单独的激动剂相比，所有激动剂处理，细胞表面受体CD86和MHCII转录水平上调，这意味着APC与T细胞的细胞通讯可能不会因添加SN50和随后细胞因子产生的减少而减弱。

为了检查这将如何在体内转化，发明人使用gp120作为抗原，用CpG(50在体内、Pam3CSK4(20μg)和R848(50μg)接种小鼠。发明人选择将这些佐剂与最广泛使用的佐剂明矾(250μg)一起使用。

使用CpG，发明人观察到全身性TNF-α和IL-6促炎细胞因子的完全消除(图4B、4C)。使用R848和Pam3CSK4，发明人发现全身细胞因子显著减少。发明人假设因为R848分子的分子量低，能够更快速地全身分布，SN50与R848一起降低细胞因子的效果较差。单独使用明矾不会引起全身细胞因子反应，并且添加SN50不会改变细胞因子谱。SN50的添加增加所有佐剂(包括明矾)的抗体滴度，证明该系统对大量免疫佐剂的广泛潜在用途(图4D)。

为了理解这如何转化为人类疫苗接种，发明人用1μg/mL LPS(含有或不含SN50)处理THP-1单核细胞。用SN50和LPS处理的细胞表达显著较低水平的TNF-α和IL-6(图4E)。发明人还观察到CD40和CD86水平升高(图4F)。此外，发明人检查SN50对非人灵长类动物(NHP)原代外周血单核细胞(PBMC)的影响。发明人用SN50和LPS或单独LPS刺激NHP PBMC持续6小时，并分析细胞上清液中的促炎细胞因子。用LPS刺激的细胞表现出在细胞上清液中的高水平的TNF-α和IL-6，具有SN50的细胞表现出细胞因子水平的显著降低(图4G)。发明人观察到，与单独用LPS刺激的细胞相比，用SN50和LPS刺激的细胞中，CD86表达上调2倍(图4H)。这意味着SN50在NHP和人类中的作用可与在小鼠中的作用相似。

F.结论

使用广泛的TLR激动剂，发明人在体外和体内均表明，NF-κB的p50亚基的细胞渗透性抑制剂增强免疫应答，减少炎症，同时增加抗体反应。CpG与免疫增强剂的共同施用导致促炎细胞因子水平显著降低，通常处于检测不到的水平。同时，炎症的这种减少导致模型抗原OVA抗体的IgG滴度增加3倍。发明人研究了增强作用如何会增强佐剂改善免疫应答的能力。在发明人的流感模型中，发明人直接检查响应于当前商业流感疫苗和Fz+CpG的副作用，并确定添加SN50降低副作用和全身促炎细胞因子水平。发明人还证明可以增强安全性而不会对保护反应产生负面影响。在接种的小鼠受到A型流感攻击后，将SN50添加到疫苗中的小鼠导致提高存活率、较少的体重减轻并减少了体温变化。为了研究增强作用对作为疫苗佐剂的TLR激动剂的影响，发明人选择了三种疾病，流感、登革热和HIV，所有这些疾病在疫苗开发中都面临着不同的挑战。在登革热疫苗接种中，目标是增加抗体中和潜力，同时保持安全性。发明人证明含有SN5的抗体对登革热中和没有不利影响，使我们能够减轻副作用但保持保护性反应。在HIV中，发明人用HIV包膜蛋白gp120、CpG和SN50接种增加了IgG和IgA滴度。这种方法看起来很通用，因为它适用于许多TLR激动剂和抗原。SN50是数百种类似的NF-种类似抑制剂之一。当与适当的TLR激动剂组合使用时，许多可被证明可用于引发针对不同疫苗或免疫疗法的特异性和潜在可调的反应。这种方法可用于减少许多佐剂疫苗中可见的与炎症相关的全身副作用(19)。这种方法有可能使各种PRR激动剂安全地用于疫苗中，增加适应性免疫谱的多样性并扩大疾病预防和治疗的范围。

总之，发明人已经证明，使用特定NF-кB抑制剂与常见免疫佐剂的组合，可以减少促炎细胞因子的产生，同时促进细胞表面受体的表达，从而在小鼠、人和NHP原代细胞中进行有效的抗原呈递和T细胞活化。在体内使用这种抑制剂，可将全身性TNF-α和IL-6完全降低至基线水平，同时增加来自疫苗接种的下游适应性体液反应。在各种病原体的广泛范围的抗原中观察到这些现象，表明这可证明是在符合严格的安全标准的同时提高疫苗接种反应的一般策略。有数百种记录在案的免疫佐剂可提供足够的抵抗疾病的保护，但会导致不安全的炎症水平，已被批准用于临床(7、45)。此外，还有数百种NF-кB抑制剂，其中一些已经获得FDA的批准，它们可以与不同的TLR激动剂复合以提供广泛的反应(44)。发明人预计该框架将使多种TLR激动剂能够安全地用于人类疫苗中，增加适应性免疫谱的多样性，拓宽疾病预防和治疗的范围。

G.材料和方法

1.RAW Blue NF-кB分析

将RAW-Blue^TM NF-кB细胞(Invivogen)传代并以100k个细胞/孔接种于96孔板中，每孔含有10％HIFBS的180μL DMEM。细胞在37℃和5％CO₂下孵育1小时。以指定浓度添加SN50，将细胞孵育1小时以指定的浓度添加免疫激动剂。使得每个孔的体积为200μL，并在37℃和5％CO₂下孵育18小时。18小时后，将20μL细胞上清液置于180μL新鲜制备的QuantiBlue(Invivogen)溶液中，并在37℃和5％CO₂下孵育达至2小时。使用Multiskan FC读板器(Thermo Scientific)每小时分析一次板，并在620nm处测量吸光度。

2.THP-1Blue NF-кB分析

将THP-Blue^TM NF-k细胞(Invivogen)传代并以400k个细胞/孔接种在96孔板中，每孔含有10％HIFBS的180μL RPMI 1680。细胞在37℃和5％CO₂下孵育1小时。以指定浓度添加SN50，将细胞孵育1小时。以指定的浓度添加免疫激动剂。使得每个孔的体积为200μL，并在37℃和5％CO₂下孵育18小时。18小时后，将板以400x g(Allegra X-30，Beckman Coulter)离心，将20μL细胞上清液置于180μL新鲜制备的QuantiBlue(Invivogen)溶液中，并在37℃和5％CO₂下孵育2小时。使用Multiskan FC读板器(Thermo Scientific)每小时分析一次板，并在620nm处测量吸光度。

3.基因表达

RAW 264.7巨噬细胞或THP-1细胞被传代，并以4x 10⁶个细胞/孔接种于细胞培养液处理的6孔板中，每孔(分别)含有10％HIFBS的1.5mL的DMEM或RPMI。将SN50(250μg/mL)或PBS添加到孔中，并将细胞在37℃和5％CO₂下孵育1小时，持续6小时。使用RNeasy PlusMini试剂盒(Qiagen)提取RNA。根据制造商的方案，使用RT2第一链试剂盒(Qiagen)和BioRad热循环仪进行RT-PCR。cDNA储存在-20℃。使用RT2 SYBR ROX qPCR Master mix(Qiagen)根据制造商的方法进行qPCR扩增。qPCR扩增使用Stratagene Mx3005P热循环仪进行。

4.细胞内细胞因子染色

a.BMDC

单核细胞取自6周龄C57BL/6小鼠。使用补充培养基将单核细胞分化为树突状细胞(BMDC)，补充培养基如下：RPMI 1640(Life Technologies)、10％HIFBS(Sigma)、20ng/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(使用“66”细胞系产生)、2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)、1％抗生素抗真菌剂(Life Technologies)和50μMβ-巯基乙醇(Sigma)。培养5天后，将BMDC与250μg/mL SN50一起孵育。1小时后，添加CpG ODN 1826(IDT)和1μL/mLGolgiPlug(BD Biosciences)。细胞在37℃和5％CO₂下孵育6小时。对细胞进行染色以观测CD40(Biologend，124610)、CD86(Biologend，105109)，细胞内IL-6(Biologend，504508)和TNF-α(Biologend，506308)细胞因子产生，并使用BD-Accuri C6流式细胞仪进行分析。

b.SEM分析

直接从注射混合物中获得的样品悬浮液干燥24小时，安装在碳带上，并用约2-4nmAu/Pd 60:40或Ir进行溅射镀膜(South Bay Technologies)。利用装有Inca EDS的FEIQuanta三维FEG双光束(SEM/FIB)(Oxford仪器)对样品悬浮液进行扫描电镜(SEM)观测。

5.体内研究

a.动物

所有动物处理程序均在芝加哥大学动物护理和使用委员会(IACUC)机构批准的方案下进行。6-8周龄C57/B6雌性小鼠购自Jackson实验室(JAX)。所有化合物在使用前都进行内毒素测试。所有疫苗接种均在后腿肌肉内施用。在指定的时间点从隐静脉收集血液。

抗原购自Sino Biological(HIV M亚类、流感A H1N1(A/California/04/2009)血凝素/HA蛋白、登革热病毒DENV-2(菌株New Guinea C)衣壳蛋白/DENV-C蛋白(His Tag)、Virogen(HIV-1env(gp41)抗原)或Invitrogen(Vaccigrade Ovalbumin)。Vaccigrade CpGODN 1826购自Invivogen或Adipogen。SN50如前所述通过固相肽合成方法合成，并使用Gilson制备型HPLC纯化。

b.疫苗接种

小鼠用异氟醚轻度麻醉，后腿肌肉内注射由含抗原、佐剂和PBS的50μl溶液。抗原剂量：卵清蛋白(100μg)，DENV2-C(5μg)和gp120(3ug)。CpG剂量，50μg。SN50，500μg。TNF-αN，30μg。IL-6N，30μg。

c.血浆细胞因子分析

在指定时间点在0.2mL肝素涂层收集管(VWR Scientific)中从小鼠体内收集血液。通过2000x g离心5分钟来分离血清。收集上清液并储存在-80℃直至使用。根据制造商的方案，使用BD Cytometric Bead Array Mouse Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒或MouseInflammation细胞因子试剂盒分析血清。简而言之，将含有所需细胞因子抗体的珠粒与50μL血清和50μL PE检测试剂混合并孵育2小时。使用BD Accuri C6流式细胞仪清洗和分析珠粒。使用BD Accuri C6软件和Graphpad Prism分析数据。

d.抗体滴度分析

用指示的制剂接种小鼠。在用于血浆的0.2mL肝素涂层收集管(VWR Scientific)或用于血清的未涂层管中指示的时间点收集血液。通过离心(2000xg，5分钟)分离血浆。通过允许血液在室温下凝结15-30分钟并在4℃下离心(2000x g，10分钟)来分离血清。根据指定的方案，使用定量抗卵清蛋白总Ig的ELISA试剂盒(Alpha Diagnostic International)分析血清。使用总小鼠IgG或IgA未包被的ELISA(Invitrogen)分析总IgG和IgA，并使用Multiskan FC读板器(Thermo Scientific)进行分析，在450nm处测量吸光度。使用Graphpad Prism分析数据。

6.流感攻击模型

a.动物

所有动物程序均在伊利诺伊理工学院(IITRI)动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案下进行。6-8周龄C57/B6雌性小鼠购自Charles River。所有化合物在使用前都进行内毒素测试。所有疫苗接种均在后腿肌肉内施用。

初始组分配被安排为使用计算机随机化程序得出的基于体重产生的相似组平均值[版本3.0(PDS Pathology Data Systems,Inc.,Basel,Switzerland)]。小鼠在第0天和第21天后肢肌肉注射接种疫苗。本研究中使用的疫苗材料是四价流感疫苗(Sanofi Pasteur)。每0.5mL剂量的包含至少15μg的血凝素(HA)，来自以下四种推荐用于2017/2018流感季节的流感毒株：A/Michigan/45/2015X-275(H1N1)pdm09样菌株，A/Hong Kong/4801/2014X-263B(H3N2)样菌株，B/Phuket/3073/2013样菌株和B/Brisbane/60/2008样菌株。每种菌株至少使用1μg用于小鼠的疫苗接种。

初始接种后24小时、48小时和72小时收集体重数据。采集初始接种后1小时、3小时、24小时、48小时和72小时的体温。第0、14、28、42、56天采集血样。第0天采集血浆。第14、28、52、56天采集血清。每组5只动物在接种后第14天被人道地处以安乐死。收集脾脏进行T细胞分析。在疫苗接种后第43天，所有小鼠通过鼻内途径接受致命剂量的a/Michigan/45/2015进行攻击。所用攻击病毒的剂量水平相当于5倍的半致死剂量(LD50)。对于接种，小鼠用氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)混合物麻醉。一旦麻醉，将0.025mL接种物滴入鼻孔。把小鼠直立起来，允许病毒被完全吸入，然后回到笼子里。攻击后，每天通过皮下植入每只小鼠的应答器(BioMedic data systems，Seaford，DE)记录体重和体温读数。感染后14天，监测动物的发病率/死亡率。任何符合预先确定的垂死标准(>20％体重减轻)的动物都被人道地处以安乐死。来自每组的三只动物在攻击后第3天(第45天)被人道地处以安乐死，并收集肺用于通过噬斑测定/TCID50进行病毒定量。对病毒滴度的组织称重，然后在乙醇/干冰浴或液氮中快速冷冻并储存在≤-65℃。冷冻器官在37℃下解冻5分钟。一旦解冻，器官在容纳1.4毫米陶瓷珠的管中使用Bead Ruptor 12(Omni International，Kennesaw，Georgia)在10％w/v的MEM中匀浆。匀浆器官在2000匀浆下离心5min以去除细胞碎片。将所得上清液连续稀释10倍，然后转移到96孔板(含有Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)细胞单层)的各个孔中进行滴定。进行TCID5分析。TCID50滴度使用Reed Meunch法计算。每组剩下的5只小鼠在剩余的攻击天数内进行监测。

b.中和测试

针对每种登革热血清型的代表(DENV-1:菌株Hawaii；DENV-2菌株New Guinea C；DENV-3菌株Philippines/H87/1956和DENV-4菌株H241)测试血清样品。血清连续稀释两倍，(开始稀释度为1:100)，然后与每个毒株的标准化病毒浓度的50-120PFU一起孵育。将血清：病毒混合物转移到含有单层Vero细胞的96孔板的各个孔中。细胞在37℃下孵育40小时。孵育40小时后，将细胞用1.0％多聚甲醛定影，并用抗Flavivirus组抗原抗体、克隆D1-4G2-4-15(Millipore Billerica,MA)染色，然后用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Kirkegaardand Perry Laboratories,Gaithersburg,MD处理。斑点是使用真蓝过氧化物酶底物(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)显影的。使用ELISPOT仪器观察和计数斑块。斑块减少中和试验滴度(PRNT)以常规50％PRNT终点滴度表示。

c.T细胞分析

如上所述，在指定的时间点从小鼠身上采集脾脏。脾细胞的分离是通过使用注射器柱塞将脾碎片压入连接到50ml锥形管的过滤器。用PBS通过过滤器洗涤细胞，并在500滤器下离心10分钟。吸取上清液，将颗粒重新悬浮在2mL预热裂解液(BD Pharm Lyse^TM裂解液)中，并在37℃下培养持续2分钟。添加30mL PBS，细胞悬液以500悬液离心10分钟。丢弃上清液，将细胞重新悬浮在含有10％HIFBS的RPMI中，浓度为2x 10⁶个细胞/mL。将500μL加到24孔板上。细胞与10μg/mL甲型H1N1流感(A/Michigan/45/2015)血凝素/HA1蛋白(His Tag)(SinoBiological)一起孵育。1小时后，加入GolgiStop(BD Biosciences)并在37℃和5％CO₂下孵育11小时。细胞以500细胞离心10分钟，并对CD4/IL-4(Biolegend o FITC anti-mouse CD4[RM4-5],PerCP/Cy5.5 anti-mouse IL-4[11B11])或CD8/IFN-y(FITC anti-mouse CD8a[53-6.7],PE anti-mouse IFN-.5anti-mou，根据制造商的方案，使用BDCytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit进行染色，并使用NovoCyte流式细胞仪(ACEABiosciences,Inc.)进行分析。

d.表位分析

如上所述收集小鼠血清，并根据制造商的方案使用Multiwell RepliTope^TM微阵列分析样品的合适抗原(JPT Innovative Peptide Solutions)。简而言之，将血清样品在1xTBS-缓冲液+0.1％Tween20(TBS-T)的3％BSA中稀释至最终浓度为10μg/mL。微阵列配备有ArraySlide 24-4室(JPT Innovative Peptide Solutions)以能够多样品分析。将150uL稀释的血清添加到样品孔中，并在30℃下孵育1小时。孔用TBS-T洗涤5次。将150μL二抗(1μg/mL)添加到孔中，并在室温孵育1小时。孔用TBS-T洗涤5次，用纳米纯水洗涤2次。使用Calibre I.D.RS-G4共聚焦显微镜对阵列进行成像，并使用ImageJ进行分析。

e.安全防护评分

发明人分配的安全评分，包括全身性TNF-α、IL-6水平和疫苗接种后的体重减轻。为每只小鼠分配各个TNF-α、IL-6和体重减轻的评分。单只小鼠的安全评分代表这些个体评分的总和。基于存活率、体重变化和攻击后体温变化分配保护评分。评分是通过将值分成四分位数来确定的，并根据四分位数分配一个0到4的数字。较高的值表明安全性提高(较低的TNF-α或IL-6，接种疫苗后体重减轻较少)或保护性提高(存活、体重减轻较少、攻击后体温较高)。

f.统计和重复

数据被绘图并在正文中报告为平均值±据被绘图并。样本大小如所有体内和体外实验中的生物学重复所示。样本大小是根据初步实验或文献先例选择的，表明该数量会足以检测平均值它们应该存在的显著差异。使用双尾未配对异方差t检验计算P值。

实施例2–其他NFкB抑制剂研究

将RAW巨噬细胞用如下物质处理：NF-кB抑制剂(小豆蔻明、魏菲灵A(WA)、木犀草素、begamide B、IRAK 1/4抑制剂、组蛋白乙酰酶抑制剂(HA)、小白菊内酯、辣椒素、MG132、PD 98059、Tpl2激酶抑制剂、姜黄素、白藜芦醇、咖啡酸苯酯(CAPE)和厚朴酚、GYY、LY、IKKVII、PDK1抑制剂、TSA、JNK II抑制剂、5z-7-氧代玉米烯醇(5-z-o)、水杨苷、QNZ或IMD)并且在添加100ng/mL LPS之前孵育45min。在用LPS激活后3小时分析IL-6表达(图14)。单独的LPS表现出高水平的IL-6表达(362pg/mL)。小豆蔻素、小白菊内酯、CAPE、PDK1、TSA和5-z-o显示IL-6完全降低到背景水平。WA、木犀草素、白藜芦醇、和厚朴酚和IKKVII抑制剂表现出促炎细胞因子活性降低，而未完全阻断表达。

为了进一步分析效果，发明人选择检测两类抑制剂：完全抑制IL-6表达的抑制剂和降低表达但不降低到背景水平的抑制剂。对于完全抑制IL-6表达的抑制剂，由于其生物利用度和有效剂量，发明人选择使用WA、小豆蔻素、小白菊内酯、5-z-o和CAPE。对于降低IL-6水平的抑制剂，发明人选择使用辣椒素和和厚朴酚。最后，发明人使用姜黄素来检查在体外没有显示IL-6活性变化的抑制剂在体内疫苗接种研究中的作用。发明人给小鼠接种有NF-кB抑抑制剂、CpG和卵清蛋白。接种疫苗后一小时，发明人分析血浆中的全身性促炎细胞因子TNF-α和IL-6。单独的CpG表现出高水平的全身性TNF-α，加入姜黄素提高了平均表达水平(图15A)。与单独的CpG相比，添加WA、小豆蔻素、小白菊内酯和CAPE显示全身TNF-α水平没有变化。辣椒素抑制TNF-α的表达，使全身TNF-α水平回到背景水平。5-z-o与和厚朴酚都将TNF-α将水平降低了两倍。有趣的是，全身性IL-6水平并不反映TNF-α水平(图15B)。单独CpG引发高IL-6反应。添加姜黄素并没有显著改变IL-6水平。魏菲灵A、小白菊内酯、5-z-o、和厚朴酚和CAPE表明IL-6水平降低了约两倍。添加辣椒素表明IL-6水平与PBS注射一致。在第21天，发明人分析了IgG抗体滴度，与单独的CpG相比，所有抑制剂都增加了抗体滴度(图15C)。

发明人接着想要研究辣椒素、和厚朴酚和WA如何与其他TLR激动剂一起工作。此外，发明人想将这些抑制剂与最常用的抗炎药布洛芬和对乙酰氨基酚进行比较。发明人使用AddaVax(一种水包油乳液)配制疫苗，以确保抑制剂的溶解性。发明人使用CpG(一种TLR9激动剂)或Pam3CSK4(一种TLR 1/2激动剂)作为免疫佐剂，卵清蛋白作为抗原。发明人在接种疫苗后一小时分析全身细胞因子。用NF-кB抑制剂配制的疫苗表明全身TNF-α水平降低。最值得注意的是，辣椒素水平与单独的PBS相当(图16A)。布洛芬、对乙酰氨基酚和WA在降低全身IL-6水平方面效果较差。辣椒素降低至与PBS一致的水平，和厚朴酚显示全身IL-6降低4倍(图16B)。第21天，发明人分析抗卵清蛋白抗体滴度。具有CpG的疫苗总体上表现出更高的抗体滴度。对乙酰氨基酚和布洛芬均显示抗体滴度降低。CpG+和厚朴酚表现出最高的抗体滴度。对乙酰氨基酚和布洛芬均证明抗体滴度降低(图16C)。

实施例3：小分子NF-κB抑制剂作为免疫增强剂用于增强疫苗佐剂

将佐剂添加到疫苗中以增强免疫应答并提供增强的保护。在过去的十年中，已经产生数百种合成免疫佐剂，但许多诱导非预期水平的促炎细胞因子，包括TNF-α和IL-6。在这里，发明人提出小分子NF-κB抑制剂，其可与免疫佐剂组合使用，以减少与安全风险相关的标志物并改善疫苗接种的保护性反应。此外，发明人合成和厚朴酚衍生物文库，确定几种用于疫苗制剂的有希望的候选物。

疫苗仍然是预防疾病最有效的方法之一。尽管它们在预防脊髓灰质炎、破伤风和天花等疾病方面取得了巨大成功，但艾滋病毒和登革热等疾病仍然是目前临床疫苗技术无法攻克的难题。为了解决这个问题，一个已经被探索的策略是包括佐剂，即增强免疫应答的分子。尽管新佐剂产生的免疫应答质量比目前批准的佐剂可实现的免疫应答质量更高，但迄今为止，很少被批准用于人类疫苗。这种脱节部分是由于平衡促炎免疫应答与保护性、适应性免疫应答的挑战。发明人最近报道，可以通过使用肽NF-κB抑制剂SN50与免疫佐剂的组合来改进疫苗。在疫苗佐剂中添加SN5导致提高佐剂的安全性，同时增强保护以对抗疾病。尽管这种方法被证明适用于广泛的佐剂和针对多种疾病的抗原有效，但它仍然需要大量多肽才能够实现最佳的安全性和保护性。肽的规模化存在合成上的挑战，并可导致昂贵的生产成本，从而限制了它们在临床环境中的潜力。肽也可诱导针对自身的免疫应答，从而导致后续疫苗接种中增强的潜力降低。发明人选择探索其他小分子NF-κB抑制剂作为免疫增强剂来克服这些挑战。

在此，发明人证明选择小分子NF-κB抑制剂有效减少佐剂诱导的炎症，同时还增加适应性免疫应答。同时，发明人证明并非所有的NF-κB抑制剂都是有效的免疫增强剂。在测试的分子中，和厚朴酚和辣椒素被证明在限制炎症和增强保护性反应方面都是有效的。通过基因敲除研究，发明人证明抗原特异性抗体的增加独立于抗炎活性。为了确定这些小分子是否会通过化学合成得到改善，发明人探索了和厚朴酚的衍生物，并发现几种可能用于疫苗的潜在候选物。

H.结果和讨论

1.探索体外小分子NF-κB抑制剂

为了开始探索替代的NF-κB抑制剂，发明人调查了潜在候选物的文献。由于NF-κB激活与败血症、癌症和自身免疫性疾病之间的强相关性，已经鉴定了大量NF-κB抑制剂库。发明人首先想分析多种小分子NF-κB抑制剂与一种TLR4激动剂，即脂多糖(LPS)组合进行体外抑制炎症作用的潜力。发明人选择了几种常见的商业可得NF-κB抑制剂，并在RAW巨噬细胞中进行测试。发明人选择检测：小豆蔻明(40μM)、咖啡酸苯乙酯(CAPE)(100μM)、魏菲灵A(WA)(400nM)、白藜芦醇(10μM)、水杨苷(100nM)、5z-7-氧代玉米烯醇(5-z-O)(5μM)、小白菊内酯(20μM)、和厚朴酚(20μM)、辣椒素(200μM)、PDK1/Akt/Flt双通路抑制剂(PDK1)(1μM)和GYY 4137(GYY)(200μM)。为了确定免疫增强作用是针对NF-确定还是针对所有抗炎分子，发明人包括了最常见的FDA批准的抗炎药对乙酰氨基酚(10mM)和布洛芬(800μM)。发明人用抑制剂和LPS处理RAW巨噬细胞并测定上清液的IL-6分泌(图18A)。

2.探索体内小分子NF-κB抑制剂

发明人接着想要研究这些抑制剂将如何改变体内安全性和保护作用。为了在体内进行测试，发明人选择在体外抑制IL-6表达最有效的小分子抑制剂，辣椒素、和厚朴酚和魏菲灵A(WA)，并将它们与对乙酰氨基酚和布洛芬一起使用。发明人选择使用CpG(一种TLR9激动剂)给小鼠接种疫苗。对于体内疫苗接种，发明人使用卵清蛋白(OVA)作为模型抗原来检测体液反应的变化。发明人给小鼠接种有100μg OVA、50μg CpG和抑制剂(800μg布洛芬、2mg对乙酰氨基酚、400μg和厚朴酚、20μg辣椒素或600μg WA)。由于溶解性困难，所有抑制剂都悬浮在AddaVax(一种基于角鲨烯的水包油纳米乳液)中，以能够实现有效的疫苗悬浮液。发明人选择分析TNF-α和IL-6的全身水平，因为这些细胞因子的高水平是热原性的，并且与不良的疫苗相关副作用相关。用CpG接种的小鼠表现出高水平的TNF-α(1067pg/mL)(图18B)。添加NF-κB抑制剂降低TNF-α的水平。布洛芬降低至738pg/mL(1.4倍)、对乙酰氨基酚(1.8倍)、和厚朴酚(2.3倍)、辣椒素(为背景水平的28倍)和WA降低1.8倍。CpG疫苗接种后IL-6的全身水平也很高(941pg/mL)。包括NF-κB抑制剂的组并不总是降低IL-6的水平(图18C)。布洛芬、对乙酰氨基酚和WA没有显著降低IL-6的表达。然而，和厚朴酚和辣椒素使IL-6的全身水平分别显著降低至266pg/mL(3.5倍)和47.4pg/mL(20倍)。

在第21天，发明人分析了抗OVA抗体水平(图18D)。CpG比PBS多1.3倍。布洛芬和对乙酰氨基酚比单独的CpG低3.2和2.4倍。CpG+和厚朴酚比单独的CpG多5.3倍。CpG+辣椒素比单独的CpG高3.5倍。CpG+WA比单独的CpG低1.5倍。

3.辣椒素和和厚朴酚的剂量依赖性

候选物中，辣椒素和和厚朴酚在这些研究中表现出非凡的前景，因此发明人进一步研究它们。为了更好地理解这些分子是如何改变免疫应答的，发明人如上所述对小鼠进行疫苗接种，并在不同时间点分析更多种类的细胞因子，以了解和厚朴酚和辣椒素如何在施用后72小时内改变表达。发明人分析了13种细胞因子：IL-1α、IL-1α、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-23、IL-27、MCP-1、IFN-1、IFN-1A、TNF-1和GM-CSF。其中，只有6种细胞因子在测定中具有可检测水平：TNF-α、IL-6、IL-10、IL-10、MCP-1和IFN-γ(图19A-F)。与先前的发现一致，CpG诱导的TNF-α和IL-6表达在1小时达到峰值。有趣的是，与单独的CpG相比，CpG与辣椒素或和厚朴酚组合在24小时增加了IFN-γ水平，并且MCP-1水平略有升高，这表明辣椒素和和厚朴酚都起到增强免疫应答的作用，而不是简单地抑制免疫激活。发明人接着想了解改变剂量将如何改变先天性和适应性免疫应答。对于和厚朴酚，发明人测试了与原始剂量(400μg)相比2倍高(800μg)和2倍低(200μg)的浓度。在接种有原始剂量辣椒素(20μg)的小鼠中观察到疼痛反应，因此发明人想研究是否可以降低剂量，同时保持足够的抗炎活性和抗体增强潜力。发明人选择测试与原始剂量(20μg)相比4倍低(5μg)和20倍低(1μg)的剂量。与单独的CpG相比，所有剂量的和厚朴酚都表现出TNF-α表达的显著降低，但是不同剂量之间没有显著差异(图19G)。与单独的CpG相比，辣椒素在所有剂量中都显著降低TNF-α水平。5μg和20μg的剂量显著降低TNF-α水平超过1μg(图19G)。仅用400μg和800μg和厚朴酚和20μg辣椒素就能降低IL-6的水平(图19H)。21天后，发明人分析了抗OVA抗体水平的差异，发现与单独使用CpG相比，所有剂量的和厚朴酚都增加抗OVA抗体的水平，发现在400μg和厚朴酚情况下的水平最高(图2I)。与单独的CpG相比，1μg和5μg辣椒素不会改变血清中抗OVA抗体的水平，但是20μg显著增加血清水平。

4.确定辣椒素的TRPV1介导的作用

辣椒素的主要体内靶标是瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TRPV1)。TRPV1以多种方式调节免疫应答，重要的是，它与抑制与败血症相关的全身炎症有关。然而，它从未在疫苗环境中被探索过。为了解TRPV1的激活会如何调节佐剂的作用，发明人比较了野生型小鼠(WT)和TRPV1基因敲除小鼠中接种疫苗的即时炎症反应。发明人用100μg OVA和50μgCpG、50μgCpG+20μg辣椒素或PBS接种WT和TRPV1 KO小鼠。发明人在接种疫苗后1小时分析TNF-α和IL-6的全身水平。发明人发现CpG在WT和TRPV1 KO小鼠中均诱导高水平的TNF-α和IL-6。显著添加辣椒素显著地降低了WT小鼠中的TNF-α和IL-6水平(图20A、20B、24)。尽管TRPV1 KO小鼠中TNF-α和IL-6的平均值略低，但这些差异不是统计学上显著的。这表明TRPV1激活是辣椒素诱导的全身细胞因子水平降低的原因。为了检查增加的抗体水平是否是由于第21天的TRPV1激活，发明人分析了血清中抗OVA抗体的水平(图20C、24)。有趣的是，发明人发现，在WT和KO小鼠中，辣椒素+CpG组的抗OVA抗体水平增加。这意味着辣椒素的抗体增强活性与炎症细胞因子的TRPV1依赖性减少是分开的。该结果证明炎症的减少不是发明人先前证明结果的NF-κB抑制剂的抗体活性增强的原因，并且适应性反应的增强是不依赖于TRPV1的。这些结果虽然不是确定的，但显示了辣椒素的两种独立但相关的机制，导致细胞因子减少和抗体增加。因此，辣椒素作为潜在的临床免疫增强剂不需要进一步检测。发明人将在未来的出版物中更广泛地探索这对免疫增强剂的作用机制的影响。

5.和厚朴酚衍生物库的合成

由于辣椒素具有两种平行机制并具有公认的副作用，发明人探索了和厚朴酚作为候选物的进一步开发。免疫增强剂和和厚朴酚的一个重要问题是标准SAR方法是否会改变增强的活性。为了进一步探讨这个问题，发明人基于和厚朴酚的结构合成了二芳基衍生物库。以往研究已经合成了和厚朴酚衍生物文库，并检测了它们对神经保护⁶⁰、抗菌剂⁶¹和抗癌⁶²等的影响^63,64。然而，迄今为止，尚无检测和厚朴酚类似物对疫苗或抗炎活性和适应性免疫应答组合的影响这类研究。根据图21中描述的反应方案，使用Pd催化的Suzuki偶联，使用相应的碘苯酚和羟基苯基硼酸作为起始材料制备苯基苯酚和联苯酚。这些化合物使用烯丙基溴进行O-烯丙基化。使用二乙基氯化铝对所得化合物进行克莱森重排以产生各种环取代(图21)。

发明人检查了合成化合物的活性，以便了解各种官能团如何影响抗炎作用或适应性免疫应答(图23、25)。发明人用和厚朴酚衍生物和LPS处理RAW巨噬细胞并分析IL-6的表达。单独添加LPS而没有和厚朴酚衍生物产生高水平的IL-6表达(6848pg/mL)。添加和厚朴酚将IL-6水平降低至260pg/mL，降低了26倍。包括化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物8和化合物11在内的几种衍生物显示出类似的IL-6表达的降低。

I.结论

总之，发明人提出，选择NF-κB的小分子抑制剂可降低佐剂接种的炎症作用，从而潜在地能够实现更安全的接种，同时还充当免疫增强剂并增加抗体水平。发明人确定了两种这样的免疫增强剂，和厚朴酚和辣椒素，它们有效减少炎症同时增加适应性反应。发明人另外提供证据，表明炎症的减少与抗体反应的增加是分开的，这可能使两种反应的不同可调性成为可能。该研究还确定只有选择的NF-κB抑制剂才能用作免疫增强剂，这拓宽了进一步调节免疫应答的潜力。发明人另外研究和厚朴酚衍生物库，发现几种和厚朴酚衍生物是未来体内测试的潜在候选物。总之，发明人已经证明，使用小分子NF-κB抑制剂与常见免疫佐剂的组合可减少促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生，同时提高抗体水平。

J.材料和方法

1.体外测试

RAW巨噬细胞的细胞因子分析：将RAW 264.7巨噬细胞传代并以0.5x 10⁶个细胞/孔接种于含有10％FBS的1mL DMEM中的细胞培养物处理的12孔板中。细胞生长2天。将培养基替换为含有10％HIFBS的1mL DMEM。添加指定浓度的抑制剂并孵育45分钟。45分钟后，添加100ng/mL的LPS，并在37℃和5％CO₂下孵育24小时。去除细胞上清液并使用BD细胞珠阵列小鼠炎症试剂盒进行分析。

2.体内测试

所有动物程序均在芝加哥大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案下进行。6-8周龄C57/B6雌性小鼠购自Jackson Laboratory(JAX)。6-8周龄C57/B6雌性Trpv1^tm1Ju小鼠购自JAX用于TRPV1 KO实验。所有化合物在使用前都进行内毒素测试。所有疫苗接种均在后腿肌肉内施用。在指定时间点从隐静脉收集血液。

抗原购自Invitrogen(Vaccigrade Ovalbumin)。Vaccigrade CpG ODN 1826购自Adipogen。AddaVaxn购自Invivogen。

疫苗接种：用异氟醚轻轻麻醉小鼠并在后腿肌肉内注射含有卵清蛋白(100：用异、佐剂、抑制剂和PBS的50S、制剂。佐剂剂量：CpG，50μg。抑制剂浓度：和厚朴酚(400μg)、辣椒素(20μg)、魏菲灵A(600μg)、对乙酰氨基酚(2mg)、布洛芬(800μg)。所有疫苗都含有25μLAddaVax^TM以提高溶解度。

血浆细胞因子分析：在0.2mL肝素涂层收集管(VWR Scientific)中指示的时间点从小鼠收集血液。通过以2000x g离心5分钟来分离血清。收集上清液并储存在-80℃直至使用。根据制造商的方案，使用BD细胞珠阵列小鼠炎症细胞因子试剂盒或LEGENDplex^TM小鼠炎症板(Biolegend)分析血清。

抗体定量：用指定制剂接种小鼠。在用于血浆的0.2mL肝素涂层收集管(VWRScientific)或用于血清的未涂层管中指示的时间点收集血液。通过离心(2000×g，5分钟)分离血浆。通过允许血液在室温下凝结15-30分钟并在4℃下离心(20000下，10分钟)来分离血清。根据指定的方案，使用定量抗卵清蛋白总Ig的ELISA试剂盒(Alpha DiagnosticInternational)分析血清。使用Graphpad Prism分析数据。

3.化学

Suzuki偶联的条件：将羟基苯酚硼酸(20mmol)溶解在100mL水中。加入合适的碘苯酚(10mmol)和K₂CO₃(40mmol)，然后加入Pd/C(2mol％)。将溶液加热至80℃持续3小时。溶液用1M HCl酸化并用EtoAc萃取并用盐水洗涤。真空蒸发溶剂。化合物通过柱色谱来纯化。

O-烯丙基化的条件：将苯酚(1mmol)(衍生物1-？)溶解在干燥丙酮(5mL)中并加入K₂CO₃(2mmol)。滴加烯丙基溴并回流。通过TLC监测反应直至完成(5-12小时)。冷却反应混合物并真空除去挥发物。向混合物中加入10％NaOH，并使用乙酸乙酯进行萃取，用盐水洗涤，并使用MgSO₄干燥有机层。真空除去溶剂，得到油状物质，将其通过柱色谱纯化，得到O-烯丙基化衍生物。

克莱森重排的条件：将O-烯丙基化衍生物(1mmol)溶解在干燥己烷(10mL)中。在氩气下滴加在干燥己烷(4mL)中的Et₂AlCl。混合物在室温下搅拌2小时。将混合物在冰浴上冷却并使用2M HCl(20mL)淬灭。用EtOAc进行萃取，用盐水洗涤并用MgSO₄干燥。真空除去溶剂，得到油状物质，将其通过柱色谱纯化，得到C-烯丙基衍生物。

***

根据本公开，可以在没有过度实验的情况下做出和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但对本领域技术人员来说，显然可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文所述的方法和方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，显然某些化学和生理学相关的试剂，可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员来说明显的类似替代和修改都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献，在它们提供示例性程序或其他细节补充在此阐述的那些的范围内，通过引用具体并入本文。

1.Petrovsky，N.＆Aguilar，J.C.Vaccine adjuvants：Current state andfuture trends.Immunol.Cell Biol.82，488-496(2004).

2.Coffman，R.L.，Sher，A.＆Seder、R.A.Vaccine Adjuvants：Putting InnateImmunity to Work.Immunity 33，492-503(2010).

3.Pashine，A.，Valiante，N.M.＆Ulmer，J.B.Targeting the innate immuneresponse with improved vaccine adjuvants.Nat.Med.11，S63-S68(2005).

4.Hoebe，K，Janssen，E.＆Beutler，B.The interface between innate andadaptive immunity.Nature Immunology(2004).doi：10.1038/hi1004-971

5.DAgostino，P.M.et al.Viral-Induced Encephalitis Initiates Distinctand Functional CD103+CD11b+Brain Dendritic Cell Populations Within theOlfactory Bulb.Proc.Natl.Acad.Sci.109，6175-6180(2012).

6.Banchereau，J.＆Steinman，R.M.Dendritic cells and the control ofimmunity.Nature 392，245-252(1998).

7.van Duin，D.，Medzhitov，R＆Shaw，A.C.Triggering TLR signaling invaccination.Trends Immunol，27，49-55(2006).

8.Dale，C.J.et al.Evaluation in macaques of HIV-1 DNA vaccinescontaining primate CpG motifs and fowlpoxvirus vaccines co-expressing IFNγorIL-12.Vaccine 23，188-197(2004).

9.Weeratna，R.，Comanita，L.＆Davis，H.L.CPG ODN allows lower dose ofantigen against hepatitis B surface antigen in BALB/c mice.Immunol.CellBiol.81，59-62(2003).

10.Klinman，D.M.，Xie，H.＆Ivins，B.E.CpG oligonucleotides improve theprotective immune response induced by the licensed anthraxvaccine.Ann.N.Y.Acad.Sci.1082，137-150(2006)

11.Davalia，E.；Kennedy，R.；Celis E.Generation of antitumor immunity bycytotoxic Tlymphocyte epitope peptide vaccination，CpG-oligodeoxynucleotideadjuvant，and CTLA-4 blockade.-Semantic Scholar.Cancer Res.63(12)，3281-8(200003).

12.Krieg，A.M.Toll-like receptor 9(TLR9)agonists in the treatment ofcancer.Oncogene 27，161-167(2008).

13.Bode，C.，Zhao，G.，Steinhagen，F.，Kinjo，T.＆Klinman，D.M.CpG DNA as avaccine adjuvant.Expert Re.Vaccines 10，499-511(2011).

14.Klinman，D.CpG DNA as a vaccine adjuvant：Expert Review of VaccinesExert Review of Vaccines 2(2)，305-315(2003).

15.Kanzler，H.，Barrat，F.J.，Hessel，E.M.＆Coffman，R.L.Therapeutictargeting of innate immunity with Toll-like receptor agonists andantagonists.Nat.Med.13，552-559(2007).

16.Mbow，M.L.，De Gregorio，E.，Valiante，N.M.＆Rappuoli，R.New adjuvantsfor human vaccines.Curr.Opin.Immunol.22，411-416(2010).

17.Christian，L.M，Porter，K.，Karlsson，E＆Schultz-Cherry，S.Proinflammatory cytokine responses correspond with subjective side effectsafter influenza virus vaccination.Vaccine 33.3360-3366(2015).

18.Simon，W.L.，Salk，H.M.，Ovsyannikova，I.G.，Kennedy，R.B.＆Poland，G.A.Cytokine production associated with smallpox vaccineresponses.Immunotherapy 6，1097-1112(2014).

19.Pasquale，A.D.，Preiss，S.，Silva，F.T.D.＆N.Vaccine adjuvants：from 1920 to 2015 and bey ond.Vaccines 3，320-343(2015).

20.Barton，G.M.＆Medzhitov，R.Toll-Like Receptor SignalingPathways.Science 300.1524-1525(2003).

21.Lawrence，T.The Nuclear Factor NF-B Pathway in Inflammation.ColdSpring Harb.Perspect.Biol.1，a001651-a001651(2009).

22.Akira，S.＆Takeda，K.Toll-like receptorsignalling.Nat.Rev.Immunol.4，499-511(2004).

23.Hoffmann，A.，Leung，T.H.＆Baltimore，D.Genetic analysis of NF-κB/Reltranscription factors defines functional specificities.EMBO J.22，5530-5539(2003).

24.Hoffmann，A.＆Baltimore，D.Circuitry of nuclear factor kappaBsignaling.Immunol.Rev.210，171-186(2006).

25.Baeuerle，P.A.＆Henkel，T.Function and Activation of NF-kappaB inthe Immune System.Annu.Rev.Immunol.12，141-179(1994).

26.Dolcet，X.，Llobet，D.，Pallares，J.＆Matias-Guiu，X.NF-kB indevelopment and progression of human cancer.Virchows Arch.446，475-482(2005).

27.Wang，C.-Y.，Mayo，M.W.＆Baldwin，A.S.TNF-and Cancer Therapy-InducedApoptosis：Potentiation by Inhibition of NF-κB.Science 274，784-787(1996).

28.Xia，Y.，Shen，S.＆Verma，I.M.NF-κB，an active player in humancancers.Cancer Immunol.Res.2，823-830(2014).

29.Erstad，D.J.＆Cusack，J.C.Targeting the NF-κB pathway in cancertherapy.Surg.Oncol.Clin.N.Am.22，705-746(2013).

30.Bacher，S.＆Schmitz，M.L.The NF-kB Pathway as a Potcntial Target forAutoimmune Disease Therapy.Curr.Pharm.Des.10(23)，2827-37(2004).

31.Palanki，M.s s.Inhibitors of AP-1 and NF-kB MediatedTranscriptional Activation：Therapeutic Potential in Autoimmune Diseases andStructural Diversity.Curr.Med.Chem.9(2)219-227(2002).

32.Letoha，T.et al.In Vitro and in Vivo Nuclear Factor-κB InhibitoryEffects of the Cell-Penetrating Penetratin Peptide.Mol.Pharmacol.69，2027-2036(2006).

33.Liu，S.F.，Ye，X.＆Malik，A.B.In vivo inhibition of nuclear factor-kappa B activation prevents inducible nitric oxide synthase expression andsystemic hypotension in a rat model ofseptic shock.J.Immunol.159，3976-3983(1997).

34.Eigler，A.，Sinha，B.，Hartmann，G.＆Endres，S.Taming TNF：strategies torestrain this proinflammatory cytokine.Immnuol.Today 18，487-492(1997).

35.Tak，P.P.＆Firestein，G.S.NF-κB：a key role in inflammatorydiseases.J.Clin.Invest.107，7-11(2001).

36.Wang，J.et al.Distinct Roles of Different NF-κB Subunits inRegulating Inflammatory and T Cell Stimulatory Gene Expression in DendriticCells.J.Immunol.178，6777-6788(2007).

37.Zienkiewicz，J.；Armitage，A.；Hawiger，J.Targeting Nuclear ImportShuttles，Importins/Karyopherins alpha by a Peptide Mimicking the NFkB1/p50Nuclear Localization Sequence.J.Am.Heart Assoc.2(5)，e000386(2013).

38.Netea，M.G.，Kullberg，B.J.，Meer，V.der＆M，J.W.Circulating Cytokinesas Mediators of Fever Clin.Infect.Dis.31，S178-S184(2000).

39.Bouvier，N.M.＆Lowen，A.C.Animal Models for Influenza VirusPathogenesis and Transmission.Viruses 2，1530-1563(2010).

40.Daniele，G.et al.The inflammatory status score including IL-6，TNF-α，osteopontin，fractalkine，MCP-1 and adiponectin underlies whole-body insulinresistance and hyperglycemia in type 2 diabetes mellitus.Acta Diabetol.51，123-131(2014).

41.Segev，G，Kass，P.H.，Francey，T.＆Cowgill，L.D.A Novel Clinical ScoringSystem for Outcome Prediction in Dogs with Acute Kidney Injury Managed by Hemodialysis.J.Vet.Intern.Med.d.22，301-308(2008).

42.Page，K.M.Zhang，L.；Medizabal，A.；Wease，S.；Carter，S.；Shoulars，K.；Gentry，T.；Balber，A.；Kurtzberg，J.The Cord Blood Apgar：a novel scoring systemto optimize selection of banked cord blood grafts tor transplantation(CME).Transfusion(Paris)52，272-283(2012).

43.Ramachandran，A.；Snehalatha，C.；Baskar，A.；Mary，S.；Kumar，C.；Selvam，S.；Catherine，A.；Viay，V.Temporal changes in prevalence of diabetes andimpaired glucose tolerance associated with lifestyle transition occurring inthe rural population in India.Diabetologia 47，860-865(2004).

44.Bhardwaj，N，Gnjatic，S.＆Sawhney，N.B.TLR AGONISTS：Are They GoodAdjuvants？Cancer J.Sudbury Mass 16，382-391(2010).

45.Gilmore，T.；Herscovitch，M.Inhibitors of NF-kappaB signaling：785 andcounting.Oncogene 23(51)，6887-99(2006).

46.Huang， J.et al.Broad and potent HIV-1 neutralization by a humanantibody that binds the gp41-gp120 interface.Nature 515，138-142(2014).

47.Audibert，F.M.＆Lise，L.D.Adjuvants：current status，clinicalperspectives and future prospects.Trends in Pharmacological Sciences 14，174-178(1993).

48.Tom，J.K.et al.Applications of Immunomodulatory Immune Synergies toAdjuvant Discovery and Vaccine Development.Trends in Biotechnology 37，373-388(2019).

49.Immune potentiator for increased safety and improved protection ofvaccines by NF-kB modulation|bioRxiv.Available at：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/489732vl.(Accessed：17th March 2019)

50.Lau，J.L.＆Dunn，M.K.Therapeutic peptides：Historical perspectives，current development trends，and future directions.Bioorganic＆MedicinalChemistry 26，2700-2707(2018).

51.Otvos，L.＆Wade，J.D.Current challenges in peptide-based drugdiscovery.Front Chem2，(2014).

52.Advances in understanding sepsis|European Journal ofAnaesthesiology|Cambridge Core.Available at：https://www.cambridge.org/core/journals/european-journal-of-anaesthesiology/article/advances-in-understanding-sepsis/28EBD8952983DA23A573B97AF1C1A750.(Accessed：17th March2019)

53.Scheuren，N，Bang，H.，Münster，T.，Brune，K.＆Pahl，A.Modulation oftranscription factor NF-κB by enantiomers of the nonsteroidal drugibuprofen.British Journal of Pharmacology 123，645-652(1998).

54.Boulares，A.H.，Giardina，C.，Inan，M.S.，Khairallah，E.A.＆Cohen，S.D.Acetaminophen inhibits NF-kappaB activation by interfering with theoxidant signal in murine Hepa 1-6 cells.Toxicol.Sci.55，370-375(2000).

55.Brito，R，Sheth，S.，Mukherjea，D，Rybak，L.P.＆Ramkumar，V.TRPV1：APotential Drug Target for Treating Various Diseases.Cells 3，517-545(2014).

56.Wang，Y.＆Wang，D.H.TRPV1 Ablation Aggravates Inflammatory Responsesand Organ Damage during Endotoxic Shock.Clin.Vaccine Immunol.20，1008-1015(2013).

57.Toledo-J.J.et al.The Transient Receptor Potential Vanilloid1 Is Associated with Active Inflammation in Ulcerative Colitis.Mediators ofInflammation(2018).doi：10.1155/2018/6570371

58.Bodkin，J.V.＆Fernandes，E.S.TRPV1 and SP：key elements for sepsisoutcome？ Br J Pharmacol 170，1279-1292(2013).

59.Fernandes，E.S.et al.TRPV1 deletion enhances local inflammation andaccelerates the onset of systemic inflammatory responsesyndrome.J.Immunol.188，5741-5751(2012).

60.Tripathi，S.，Chan，M.-H.＆Chen，C.An expedient synthesis of honokioland its analogues as potential neuropreventive agents.Bioorganic＆MedicinalChemistry Letters 22，216-221(2012).

61.Kim，Y.-S.et al.Synthesis and microbiological evaluation ofhonokiol derivatives as new antimicrobial agents.Arch.Pharm.Res.33，61-65(2010).

62.Sánchez-Peris，M.，Murga，J.，Falomir，E.，Carda，M.＆Marco，J.A.Synthesisof honokiol analogues and evaluation of their modulating action on VEGFprotein secretion and telomerase-related gene expressions.Chem Biol Drug Des89，577-584(2017).

63.Shen，J.-L.et al.Honokiol and magnolol as multifunctionalantioxidative molecules for dermatologic disorders.Molecules 15，6452-6465(2010).

64.Lee，Y.-J.et al.Therapeutic applications of compounds in theMagnolia family.Pharmacol.Ther.130，157-176(2011).