Gphb5糖蛋白激素在降脂和改善胰岛素敏感中的应用
阅读说明：本技术 Gphb5糖蛋白激素在降脂和改善胰岛素敏感中的应用 (Application of GPHB5 glycoprotein hormone in reducing blood fat and improving insulin sensitivity ) 是由 赵子建 萧耿苗 李芳红 赵正刚 千爱君 张馨丹 王帅 于 2020-04-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了GPHB5糖蛋白激素在制备减少肥胖以及降脂药物,或治疗肥胖人群中葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗或糖尿病的药物中的应用；应用包括利用从组织中纯化或重组表达并纯化的GPHB5蛋白,通过注射或口服,使肥胖人群减肥降脂,或者使肥胖人群改善胰岛素敏感,降低血糖；本发明依据于GPHB5糖蛋白激素在减肥减脂中的作用,揭示一种垂体调控体重和脂肪代谢的新机制。(The invention provides an application of GPHB5 glycoprotein hormone in preparing medicines for reducing obesity and reducing blood fat, or medicines for treating glucose intolerance, insulin resistance or diabetes in obese people; the application comprises that GPHB5 protein purified or recombined and expressed from tissues and purified is used for reducing weight and fat of obese people or improving insulin sensitivity and reducing blood sugar of the obese people through injection or oral administration; the invention discloses a novel mechanism for regulating body weight and fat metabolism by pituitary based on the action of GPHB5 glycoprotein hormone in weight reduction and fat reduction.)
技术领域
本发明涉及代谢系统疾病领域，具体地，本申请提供了GPHB5糖蛋白激素在制备减少肥胖以及降脂药物，或治疗肥胖人群葡萄糖不耐受或胰岛素抵抗的药物中的应用；本发明提供了一种具有减肥减脂功效的糖蛋白激素GPHB5，揭示一种垂体调控体重和脂肪代谢的新机制。
背景技术
肥胖是一种很常见的可预防死因，也是21世纪最重要的公共卫生问题之一。目前成人与儿童的肥胖盛行率都在上升，且女性较男性更常发生。从1979年到2016年，肥胖成年妇女人数从六千九百万人增加到三亿九千万人，肥胖男性从三千一百万增加到两亿八千一百万。肥胖会带来一系列的并发症，如2型糖尿病、心血管疾病、不孕不育、哮喘、睡眠呼吸暂停综合征等，还与乳腺癌、直肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生有关，严重影响了国人的健康和生活质量。
GPHB5是糖蛋白激素家族组成员CGH的亚组，主要由垂体前叶的促肾上腺皮质激素分泌细胞分泌。糖蛋白激素家族成员包括促卵泡激素(FSH)、促黄体素(LH)、促甲状腺激素(TSH)、绒毛膜促性腺激素(CG)，以及2002年被证实为新的糖蛋白激素家族成员CGH。在哺乳动物中，糖蛋白激素对性腺和甲状腺功能起关键作用，促性腺激素能调节生长及卵巢、睾丸的分化，而TSH是机体能量平衡所必须的。
研究表明GPHB5能够和TSH受体(TSHR)结合，并且GPHB5和GPHA2结合形成异质二聚体CGH后，激活TSHR产生cAMP的能力比TSH强4倍。另外，激活脂肪组织TSHR能促进脂肪甘油三酯的水解，进而降低脂肪含量，使体重下降。因此，GPHB5极可能与脂肪组织TSHR结合，刺激甘油三酯水解，可作为一种潜在的减肥减脂分子靶标。
发明内容
本发明主要解决的问题在于提供一种减肥减脂，治疗肥胖人群中葡萄糖不耐受或胰岛素抵抗的新机理；在现有研究的基础上，本发明提出了GPHB5糖蛋白激素在肥胖降脂，和治疗肥胖人群中葡萄糖不耐受或胰岛素抵抗中的应用；依据于GPHB5糖蛋白激素在减肥减脂中的作用，揭示一种垂体调控体重和脂肪代谢的新机制。
本发明涉及一种具有减肥减脂功效的糖蛋白激素glycoprotein hormone beta 5(GPHB5)。
一方面，本发明提供了GPHB5糖蛋白激素在制备减少肥胖以及降脂药物中的应用。
进一步地，所述的GPHB5糖蛋白导致体重下降。
进一步地，所述的GPHB5糖蛋白使全身脂肪含量减少，而非脂肪含量无显著变化。
另一方面，本发明提供了GPHB5糖蛋白激素在制备治疗肥胖人群葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗或糖尿病的药物中的应用。
所述的GPHB5糖蛋白激素可以为组织中纯化或利用重组表达的GPHB5糖蛋白激素。
所述的GPHB5糖蛋白激素可以被制备为口服或注射剂型。
另一方面，本发明提供了一种肥胖降脂药物，其特征在于，其中包含GPHB5糖蛋白激素，或表达GPHB5糖蛋白激素的载体或细胞。
进一步地，所述药物效果包括体重下降，或者全身脂肪含量减少而非脂肪含量无显著变化。
另一方面，本发明提供了一种治疗肥胖人群葡萄糖不耐受或胰岛素抵抗的药物，其特征在于，其中包含GPHB5糖蛋白激素，或表达GPHB5糖蛋白激素的载体或细胞。
所述的药物可以为口服或注射剂型。
本发明中的GPHB5糖蛋白激素包括各种生物来源的GPHB5糖蛋白激素。
本发明中的GPHB5糖蛋白激素可以是使用各种已知分离纯化方法从组织中纯化得到或者重组表达的GPHB5糖蛋白激素。
本发明中的GPHB5糖蛋白激素中不排斥其他氨基酸序列的存在，只要不妨碍其行使GPHB5糖蛋白激素功能即可。
本发明中的药物中可以含有药学领域/生物领域已知或未知的各种赋形剂、载体、表达细胞，药学领域/生物领域技术人员可以依据现有知识设计相应剂型。
本领域的应用和药物中不排斥包含其他有降脂、治疗葡萄糖不耐受或胰岛素抵抗的药物，本领域技术人员可以尝试将这些成分与GPHB5糖蛋白激素组合并验证其效果。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明依据于GPHB5糖蛋白激素在减肥减脂中的作用，揭示一种垂体调控体重和脂肪代谢的新机制。本发明通过注射或GPHB5重组激素水平低下的病人，将有助于减肥、增强胰岛素敏感性，并改善血脂代谢。
附图说明
图1为GPHB5敲除验证，通过qPCR检测野生型小鼠和敲除鼠的睾丸、大脑、心脏中GPHB5mRNA表达水平，敲除鼠三种组织中GPHB5 mRNA都明显低于野生型，基本不表达。n.d.代表not detectable。
图2为GPHB5敲除鼠(-/-)及同窝野生型小鼠(WT)体重增长曲线。
图3为GPHB5敲除鼠(-/-)及同窝野生型小鼠(WT)体型的对比。
图4为GPHB5敲除鼠(-/-)及同窝野生型小鼠(WT)全身脂肪含量(Fat Mass)与非脂肪含量(Lean Mass)的对比。
图5为GPHB5敲除鼠(-/-)及同窝野生型小鼠(WT)糖耐量(GTT)的对比。
图6为GPHB5敲除鼠(-/-)及同窝野生型小鼠(WT)胰岛素耐量(ITT)的对比。
图7为表达载体pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2质粒的示意图。
图8为表达载体pcDNA3.1-GPHB5-L-GPHA2质粒的示意图。
图9为Western Blot检测重组GPHB5/GPHA2蛋白。
图10为ELISA检测重组蛋白刺激3T3-L1细胞后细胞中cAMP的变化。
图中，*代表p＜0.05，差异显著；**代表p＜0.01，差异极显著；***代表p＜0.001，差异极其显著；****代表p＜0.0001，差异非常显著。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例中，GPHB5糖蛋白激素缺失会导致体重上升，具体地，GPHB5缺失会使全身脂肪含量增加，而非脂肪含量无显著变化，GPHB5缺失会导致葡萄糖不耐受及胰岛素抵抗。
应用包括如下步骤：利用从组织中纯化或利用重组表达及纯化的GPHB5蛋白，通过注射或口服，使肥胖病人减肥降脂；或者利用从组织中纯化或利用重组表达及纯化的GPHB5蛋白，通过注射或口服，使肥胖病人改善胰岛素敏感，降低血糖。
实施例1 GPHB5敲除鼠的构建、验证和相关指标分析
小鼠GPHB5基因的Genbank号为NM_175644.3，人GPHB5基因的Genbank号为NM_145171.4，GPHB5基因全长约为3900bp。所用的GPHB5敲除鼠是委托赛业生物科技有限公司，通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，敲除GPHB5基因的2号及3号外显子，敲除3340bp碱基得到2只GPHB5敲除鼠，标记为line1和line2。通过DNA测序检测可能脱靶的前10个位点，结果表明line1和line2均没有脱靶，说明GPHB5敲除鼠构建成功。
通过杂合子与杂合子配繁，得到GPHB5敲除鼠和同窝野生型小鼠。取GPHB5敲除鼠及野生型小鼠的睾丸、大脑、心脏，检测GPHB5 mRNA水平，如图1所示，结果表明GPHB5敲除鼠基本不表达GPHB5 mRNA。
GPHB5敲除鼠与同窝野生型小鼠体重比较：
SPF屏障环境中饲养小鼠，同窝雄鼠放同一笼，每笼3-4只，喂相同的饲料和无菌水。从小鼠6周龄成熟后开始记录体重，每周记录一次，如图2和图3所示。从鼠龄18周之后，GPHB5敲除鼠体重明显高于同窝野生型小鼠，31周时GPHB5敲除鼠体重比野生型小鼠多6g，说明GPHB5缺失会导致肥胖。
全身脂肪含量与非脂肪含量分析：
采用汇佳生物股份有限公司的体成分分析仪Echo MRI，检测GPHB5敲除鼠与同窝野生型小鼠的全身脂肪含量与非脂肪含量。如图4所示，GPHB5敲除鼠的全身脂肪含量明显高于同窝野生型小鼠，而非脂肪含量基本一致，表明GPHB5敲除鼠体重的增加主要来源于脂肪的累积。
糖耐量分析：
GPHB5敲除鼠和同窝野生型小鼠禁食12小时，罗氏血糖仪测空腹血糖值。按2g/kg体重，腹腔注射20％葡萄糖，罗氏血糖仪测注射后15min、30min、60min、90min、120min、150min小鼠的血糖值，如图5所示，结果表明GPHB5敲除鼠的糖耐量明显低于同窝野生型小鼠。
胰岛素耐量分析：
GPHB5敲除鼠和同窝野生型小鼠禁食6小时后，用罗氏血糖仪测空腹血糖，按0.8IU/kg体重，腹腔注射0.2IU/ml的胰岛素稀释液，罗氏血糖仪测注射后15min、30min、45min、60min、75min、90min小鼠的血糖值，并以注射前测得的血糖值为100％作胰岛素耐量曲线，如图6所示。结果表明GPHB5敲除鼠对胰岛素不敏感。
实施例2重组GPHB5/GPHA2蛋白在哺乳动物细胞中的表达和功能分析表达载体pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2质粒的构建：
GPHB5和GPHA2全基因序列由南京金斯瑞公司合成，并进行密码子人源化优化。目的基因克隆至pBudCE4.1载体中，其中GPHB5基因克隆至载体的Hind III/BamH I位点之间，GPHA2基因克隆至载体的Not I/Xho I位点之间，如图7所示。将pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2质粒转化至MJ109大肠杆菌中，挑取单克隆进行质粒酶切鉴定以及DNA测序方法验证插入序列的正确性。pBudCE4.1质粒为哺乳动物细胞表达双基因常用的载体，载体上携带有His标签、V5标签和myc标签序列，根据基因插入位点显示，表达重组蛋白后GPHB5蛋白将携带myc和His标签，GPHA2蛋白将携带V5和His标签，可用于纯化和检测。
表达载体pcDNA3.1-GPHB5-L-GPHA2质粒的构建：
合成含有GPHB5的信号肽以及成熟肽段、连接肽L、GPHA2的成熟肽和His标签的融合基因，克隆至pCDNA3.1载体的EcoR I/Not I位点之间，如图8所示。其中，连接肽L的蛋白序列有两种：常规连接肽GGGGSGGGGSGGGGS，以及能够延长重组蛋白半衰期的CTP肽段PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。
重组GPHB5/GPHA2蛋白在哺乳动物细胞中的表达及功能分析：
将构建的表达载体pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2和表达载体pcDNA3.1-GPHB5-L-GPHA2转染至哺乳动物细胞中，包括HEK 293T细胞、293F细胞、CHO细胞。图9为表达载体pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2转染293T细胞后继续培养2天后，取培养基上清进行Western Blot实验的检测结果，表明GPHB5/GPHA2重组蛋白表达成功。对含有重组蛋白的培养基进行超滤管浓缩5倍，His标签纯化试剂盒进行纯化后，用于刺激3T3-L1细胞20min、60min、90min，ELISA检测细胞内cAMP水平，发现与对照组相比，表达出来的GPHB5/GPHA2重组蛋白刺激20min和60min后cAMP上升，如图10所示，说明表达出来的重组蛋白具有活性。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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