一种调节卵巢功能的生物制剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种调节卵巢功能的生物制剂及其制备方法和应用 (Biological agent for regulating ovarian function and preparation method and application thereof ) 是由 符修乐 卞传忠 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种调节卵巢功能的生物制剂及其制备方法和应用,生物制剂为由重组抗缪勒管激素、PEG化的重组抗缪勒管激素、重组卵泡刺激素、PEG化的重组卵泡刺激素、抗缪勒管激素卵黄抗体、卵泡刺激素卵黄抗体中单个或者多个成分组成的口服制剂。本发明中,TAT诱导肽可促进蛋白的肠道吸收,PEG化的重组抗缪勒管激素和卵泡刺激素可延长半衰期,使用这两种重组蛋白分别免疫动物可获得含有这两种蛋白抗体的制品,可直接食用也可制成冲剂及压片制品等。重组抗缪勒管激素和其卵黄抗体制品,重组卵泡刺激素和其卵黄抗体制品,组成了一种可调节卵巢功能的体系,可用于临床治疗卵巢功能障碍及日常保健,且本产品成本低廉便于临床及日常保健使用。(The invention discloses a biological preparation for regulating ovarian function and a preparation method and application thereof, wherein the biological preparation is an oral preparation consisting of one or more components of recombinant anti-mullerian hormone, PEG (pegylated) recombinant anti-mullerian hormone, recombinant follicle-stimulating hormone, PEG (pegylated) recombinant follicle-stimulating hormone, anti-mullerian hormone yolk antibody and follicle-stimulating hormone yolk antibody. In the invention, TAT induction peptide can promote the intestinal absorption of protein, PEG recombinant anti-mullerian hormone and follicle-stimulating hormone can prolong the half-life period, and products containing antibodies of the two proteins can be obtained by immunizing animals with the two recombinant proteins respectively, and can be directly eaten or prepared into granules, tabletting products and the like. The recombinant anti-mullerian hormone and the yolk antibody product thereof, the recombinant follicle stimulating hormone and the yolk antibody product thereof form a system capable of adjusting the ovarian function, can be used for clinically treating ovarian dysfunction and daily health care, and the product has low cost and is convenient for clinical and daily health care use.)
技术领域
本发明涉及基因重组技术领域，具体涉及一种调节卵巢功能的生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
卵巢功能异常的影响因素很多，从激素角度看影响最大的是抗缪勒管激素和卵泡刺激素。抗缪勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)属于转化生长因子β超家族(transforming growth factor-beta，TGF-β)成员的糖蛋白，分子量大小在60kD。AMH在性分化过程中可以促进缪勒氏管退化而使中肾管发育成雄性生殖器官，雌性动物中因缺乏抗缪勒氏管激素使缪勒氏管演变成子宫和输卵管。在成年女性中，AMH抑制原始卵泡的募集和窦卵泡的发育，防止卵泡过早耗竭，是卵巢衰老最准确的生物标志物。卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)是脑垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，由非共价键结合的α亚基和β亚基两个亚基所组成的异二聚体，分子量大小约为38kD，在下丘脑－垂体－性腺生殖轴中起重要的作用。FSH使颗粒细胞增生，内膜细胞分化，卵泡液形成卵泡腔扩大，从而促进卵巢卵泡的生长、卵泡颗粒细胞的增生以及雌激素的合成与分泌。
TAT转导蛋白：TAT蛋白转导域是源自人类免疫缺陷病毒Tat蛋白的一段碱性氨基酸多肽，能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部，在药物转运和疾病治疗等领域有着巨大的应用潜力。TAT蛋白转导域首先通过电荷相互作用吸附于细胞膜，然后通过脂筏介导的巨胞饮作用进入细胞。
真核表达技术是蛋白质重组的一种方法类别，是指通过基因克隆技术，将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达细胞的方法，使其在特定真核生物或细胞内表达。其优点在于能够短时间内获得基因表达产物，且可以进行翻译后的修饰加工。方法较简单，适合糖蛋白类的大规模生产。
卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)：通过免疫接种产蛋母鸡(或其他产卵动物)，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗。IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。且IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。
目前有相关机构研制出了重组抗缪勒管激素、卵泡刺激素，但不能口服。且目前尚未见有抗缪勒管激素卵黄抗体，卵泡刺激素卵黄抗体的制备技术。也未见重组抗缪勒管激素与抗缪勒管激素抗体、卵泡刺激素与卵泡刺激素抗体组成的治疗或保健体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调节卵巢功能的生物制剂及其制备方法和应用，用于调节因抗缪勒管激素、卵泡刺激素分泌异常引起的卵巢功能障碍。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种调节卵巢功能的生物制剂，所述生物制剂为由重组抗缪勒管激素、PEG化的重组抗缪勒管激素、重组卵泡刺激素、PEG化的重组卵泡刺激素、抗缪勒管激素卵黄抗体、卵泡刺激素卵黄抗体中单个或者多个成分组成的口服制剂；其中，所述重组抗缪勒管激素为由抗缪勒管激素的氨基酸序列的N端连接TAT转导序列组成；所述重组卵泡刺激素为由卵泡刺激素的氨基酸序列的N端连接TAT转导序列组成；所述抗缪勒管激素卵黄抗体为通过重组抗缪勒管激素免疫卵生动物后，再从卵生动物生产的蛋黄中提取获得；所述卵泡刺激素卵黄抗体为通过重组卵泡刺激素免疫卵生动物后，再从卵生动物生产的蛋黄中提取获得。
进一步改进在于，编码所述重组抗缪勒管激素的氨基酸序列的基因序列如SEQ IDNO:1所示，编码所述重组卵泡刺激素的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步改进在于，所述PEG化的重组抗缪勒管激素和PEG化的重组卵泡刺激素为采用分子量为5kD的甲氧基聚乙二醇琥珀酰-亚胺丙酸酯mPEG-SPA对所述重组抗缪勒管激素和重组卵泡刺激素进行修饰后制备获得。
进一步改进在于，所述卵生动物为鸡。
本发明还提供了一种生物制剂的制备方法，所述重组抗缪勒管激素或重组卵泡刺激素的制备方法，步骤包括：
①取人抗缪勒管激素氨基酸序列或卵泡雌激素氨基酸序列，在N端连接TAT转导序列，反向翻译获得目的基因序列，将目的基因序列连接到pYES2/CT质粒中；
②将质粒用PEG/LiCl法导入到Invscv1酿酒酵母中，获得AMH工程菌或FSH工程菌；
③取AMH工程菌或FSH工程菌进行发酵培养和纯化，获得重组的目的蛋白AMH或FSH。
进一步改进在于，所述PEG化的重组抗缪勒管激素和PEG化的重组卵泡刺激素的制备方法，步骤包括：
将重组抗缪勒管激素或重组卵泡刺激素进行真空冷冻干燥，获得粉剂；
利用mPEG-SPA在反应缓冲体系中进行PEG化处理，获得PEG化修饰的目的蛋白。
进一步改进在于，所述抗缪勒管激素卵黄抗体或卵泡刺激素卵黄抗体的制备方法，步骤包括：
步骤一、利用重组抗缪勒管激素或重组卵泡刺激素对卵生动物进行免疫，至卵生动物血清抗体效价为32以上时开始收集鸡蛋；
步骤二、将鸡蛋的蛋黄液处理成粉状制剂后保存。
本发明还提供了一种生物制剂在作为调节由抗缪勒管激素和卵泡刺激素分泌异常所导致的卵巢功能障碍药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)该生物制剂采用的重组蛋白为TAT诱导肽与抗缪勒管激素或者卵泡刺激素的融合蛋白，TAT诱导肽可促进蛋白的肠道吸收，PEG化的重组抗缪勒管激素和卵泡刺激素可延长半衰期，同时可解决抗缪勒管激素和卵泡刺激素口服的问题。
(2)该生物制剂提供了抗缪勒管激素和卵泡刺激素的卵黄抗体制品，其鲜蛋可直接食用，其卵黄冲剂可口服，解决了抗体应用的高成本问题，可广泛应用于临床和日常保健。
(3)该生物制剂可解决AMH和FSH异常的针对性治疗和保健。
附图说明
图1为重组抗缪勒管激素wb验证图；图中，泳道M：蛋白Marker、泳道1：空菌对照、泳道2：重组抗缪勒管激素、泳道3：PEG化重组抗缪勒管激素。
图2为重组卵泡刺激素wb验证图；图中，泳道M：蛋白Marker、泳道1：空菌对照、泳道2：重组卵泡刺激素、泳道3：PEG化重组卵泡刺激素。
图3为重组抗缪勒管激素和重组卵泡刺激素免疫蛋鸡的琼脂双扩散图；
图中，A为重组抗缪勒管激素免疫蛋鸡血清效价测试结果；B为重组卵泡刺激素免疫蛋鸡血清效价测试结果。1到6孔分别为血清稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍。中间孔为抗原，A的抗原为重组抗缪勒管激素，B的抗原为重组卵泡刺激素。
图4为卵黄抗体的部分制品展示图：A为鲜蛋，B为卵黄粉，C为卵黄粉压片，D为IgY抗体制剂(冻干和液体)。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：重组抗缪勒管激素的制备
(1)重组抗缪勒管激素的基因序列的获取：
参考GENBANK登录号NM_000479.5，取人抗缪勒管激素氨基酸序列，并在N端连接TAT转导序列，反向翻译即为目的基因。将目的基因序列送华大基因合成获得含有目的基因的pYES2/CT质粒，测序合格，获得如SEQ ID NO:1所示的目的基因序列。
(2)工程菌构建：
将质粒，用PEG/LiCl法导入到Invscv1酿酒酵母中，涂布于氨苄SD-Ura平板上，30℃恒温培养72h，挑取SD-Ura平板上长出的菌落保种并送华大基因测序鉴定目的基因，测序结果与目的基因一致，表示表达载体构建成功，记为AMH工程菌。
(3)发酵表达
取AMH工程菌于摇床30℃，220r/min，SD-Ura葡萄糖发酵培养基培养至OD600为5.0左右，加入5倍量的SD-Ura半乳糖诱导培养基，继续诱导培养96h后收获。7000rpm 4℃离心15min，取上请即为目的蛋白AMH粗制品。
采用GE Chelating Sepharose Fast Flow Ni2+螯合填料装填GE XK50自装柱，pH8.0洗脱，20倍柱体积PBS缓冲液中透析12h。0.22μm无菌过滤处理，处理后样品即为纯化的目的蛋白，记为AMH。
实施例2：重组抗缪勒管激素的PEG化修饰
取纯化后的目的蛋白AMH真空冷冻干燥，获得粉剂。
配制反应缓冲体系，缓冲体系可选pH4.0、5.0的醋酸盐缓冲溶液，pH6.0、7.0、8.0的磷酸盐缓冲溶液。
取冻干后的AMH与mPEG-SPA按摩尔比1:2～1:12，于反应缓冲体系中，使用磁力搅拌器室温下避光搅拌2h～12h。20体积PBS缓冲液中透析12h。0.22μm无菌过滤处理，处理后样品即为PEG化修饰的目的蛋白，记为mPEG-AMH。
调整AMH及mPEG-AMH浓度至1mg/mL，使用abcam公司鼠抗AMH为一抗(货号ab239491)，使用abcam公司山羊抗小鼠IgG(HRP)为二抗(货号ab6789)，做WB实验验证。结果如图1所示，在泳道2AMH在60kD处有明显阳性条带和泳道3mPEG-AMH在65kD处有明显阳性条带，表明重组的目的蛋白为抗缪勒管激素，且PEG化修饰成功。
实施例3：重组卵泡刺激素的制备
(1)重组卵泡刺激素的基因序列的获取：
参考GENBANK登录号AAA52476.1和GENBANK登录号ACM91588.1两者的氨基酸序列，中间使用柔性linker连接，并在N端连接TAT转导序列，反向翻译即为目的基因。将目的基因序列送华大基因合成获得含有目的基因的pYES2/CT质粒，测序合格，获得如SEQ ID NO:2所示的目的基因序列。
(2)工程菌构建：
将质粒，用PEG/LiCl法导入到Invscv1酿酒酵母中，涂布于氨苄SD-Ura平板上，30℃恒温培养72h，挑取SD-Ura平板上长出的菌落保种并送华大基因测序鉴定目的基因，测序结果与目的基因一致，表明表达载体构建成功，记为FSH工程菌。
(3)发酵表达
取FSH工程菌于摇床30℃，220r/min，SD-Ura葡萄糖培养基培养至OD600为5.0左右，加入5倍量的SD-Ura半乳糖诱导培养基，继续诱导培养96h后收获。7000rpm 4℃离心15min，取上请即为目的蛋白FSH粗制品。
采用GE Chelating Sepharose Fast Flow Ni2+螯合填料装填GE XK50自装柱，pH8.0洗脱，20倍柱体积PBS缓冲液中透析12h。0.22μm无菌过滤处理，处理后样品即为纯化的目的蛋白，记为FSH。
实施例4：重组卵泡刺激素的PEG化修饰
取纯化后的FSH真空冷冻干燥，获得粉剂。
配制反应缓冲体系，缓冲体系可选pH4.0、5.0的醋酸盐缓冲溶液，pH6.0、7.0、8.0的磷酸盐缓冲溶液。
取冻干后的AMH与mPEG-SPA按摩尔比1:2～1:12，于反应缓冲体系中，使用磁力搅拌器室温下避光搅拌2h～12h。20体积PBS缓冲液中透析12h。0.22μm无菌过滤处理，处理后样品即为PEG化修饰的目的蛋白，记为mPEG-FSH。
调整FSH及mPEG-FSH浓度至1mg/mL，使用abcam公司兔抗FSH-β为一抗(货号ab150425)，使用abcam公司山羊抗兔IgG(HRP)为二抗(货号ab6721)，做WB实验验证。结果如图2所示，在泳道2FSH在29kD处有明显阳性条带和泳道3mPEG-FSH在34kD处有明显阳性条带，表明重组的目的蛋白为卵泡刺激素，且PEG化修饰成功。
实施例5：抗缪勒管激素卵黄抗体的制备
动物免疫
选取4月龄健康蛋鸡进行免疫。抗缪勒管激素使用PBS稀释到2mg/mL，弗氏完全佐剂1:1乳化，以肌肉多点注射的方式进行首次免疫，每只鸡注射总量为2mL；14天后以相同方式进行加强免疫。第21天翅静脉采血，琼脂双扩散法测定血清抗体效价，效价≥32(如图3所示)时开始收集鸡蛋，若不足，按上述方法补充免疫直到效价满足要求。
卵黄抗体制备
①卵黄粉制备：挑选完整未破损的鸡蛋，温水清洗后，经次氯酸钠消毒，压缩空气风干，使用全自动蛋黄蛋清分离，自动检测散黄。收集蛋黄液，转子泵输送至板式换热器瞬间冷却至4℃。使用暂存罐带搅拌及冰水夹套，保持4℃。用温和的灭菌方式，63℃3.5分钟，保证杀灭病毒及有害菌，保持IgY活性。改用压力式低温喷雾干燥，瞬间蒸发时间1秒，蒸发温度低至60℃，水分保持在5％，后过30目筛，既得卵黄粉。
②IgY抗体制备：挑选完整未破损的鸡蛋，温水清洗后，经次氯酸钠消毒，压缩空气风干，使用全自动蛋黄蛋清分离，自动检测散黄。收集蛋黄液。用1:9倍的蒸馏水稀释卵黄，调节pH至5.4，搅拌15min，置4℃过夜自然沉淀，以10000rpm，4℃离心30min去除脂类，收集上清液。加入等体积PBS稀释，再按体积1:1加入饱和硫酸铵，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。再用PBS溶解沉淀，离心去除不溶物，取上清液加入100m饱和硫酸铵至33％饱和度，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。如此重复3次，可获较纯的IgY，20倍体积PBS透析过夜，经0.22μm无菌过滤获得AMH的IgY液体制剂，配伍后冷冻干燥可得冻干制剂。
成品制备
上述所获得的鸡蛋消毒后可作为鲜鸡蛋产品。蛋粉可配合糖、奶粉制成冲剂和压片，液体IgY抗体可配伍后作为注射制剂，如图4所示。
实施例6：卵泡刺激素卵黄抗体的制备
(1)动物免疫
选取4月龄健康蛋鸡进行免疫。卵泡刺激素使用PBS稀释到2mg/mL，弗氏完全佐剂1:1乳化，以肌肉多点注射的方式进行首次免疫，每只鸡注射总量为2mL；14天后以相同方式进行加强免疫。第21天翅静脉采血，琼脂双扩散法测定血清抗体效价，效价≥32(如图3所示)时开始收集鸡蛋，若不足，按上述方法补充免疫直到效价满足要求。
(2)卵黄抗体制备
①卵黄粉制备：挑选完整未破损的鸡蛋，温水清洗后，经次氯酸钠消毒，压缩空气风干，使用全自动蛋黄蛋清分离，自动检测散黄。收集蛋黄液，转子泵输送至板式换热器瞬间冷却至4℃。使用暂存罐带搅拌及冰水夹套，保持4℃。用温和的灭菌方式，63℃3.5分钟，保证杀灭病毒及有害菌，保持IgY活性。改用压力式低温喷雾干燥，瞬间蒸发时间1秒，蒸发温度低至60℃，水分保持在5％，后过30目筛，既得卵黄粉。
②IgY抗体制备：挑选完整未破损的鸡蛋，温水清洗后，经次氯酸钠消毒，压缩空气风干，使用全自动蛋黄蛋清分离，自动检测散黄。收集蛋黄液。用1:9倍的蒸馏水稀释卵黄，调节pH至5.4，搅拌15min，置4℃过夜自然沉淀，以10000rpm，4℃离心30min去除脂类，收集上清液。加入等体积PBS稀释，再按体积1:1加入饱和硫酸铵，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。再用PBS溶解沉淀，离心去除不溶物，取上清液加入100m饱和硫酸铵至33％饱和度，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。如此重复3次，可获较纯的IgY，20倍体积PBS透析过夜，经0.22μm无菌过滤获得FSH的IgY液体制剂，配伍后冷冻干燥可得冻干制剂。
(3)成品制备
上述所获得的鸡蛋消毒后可作为鲜鸡蛋产品。蛋粉可配合糖、奶粉制成冲剂和压片，液体IgY抗体可配伍后作为注射制剂。
实施例7：调节卵巢功能的重组蛋白及其卵黄抗体制品的系统的应用
调节卵巢功能的重组蛋白及其卵黄抗体制品的系统可以根据临床实际需求进行选配，由抗缪勒管激素、PEG化的抗缪勒管激素、抗缪勒管激素卵黄抗体、卵泡刺激素、PEG化的卵泡刺激素、卵泡刺激素卵黄抗体这6种物质中的1种或多种组合。本实施例以单种物质进行研究。
选取安徽省妇幼保健院不孕不育科室选择非器质性排卵障碍的60名女性志愿者，其中血清AMH异常30名(偏高15名，偏低15名)，血清FSH异常30名(偏高15名，偏低15名)。如下表1所示。
表1：入选实验60名患者初始血清AMH、FSH测试值(血清AMH正常范围：2.0-6.8ng/mL，血清FSH正常范围：5-40mIU/mL)
对AMH偏低者10名给予AMH口服，剂量为100mg/次/天，连服90天，记为A组。5名给予生理盐水口服对照，记为B组。对AMH偏高者10名给予AMH卵黄抗体冲服，剂量为200mg/次/天，连服90天，记为C组。5名给予生理盐水口服对照，记为D组。每个月采血测血清AMH，遵医嘱调整AMH或AMH卵黄抗体的用量。
对FSH偏低者10名给予FSH口服，剂量为100mg/次/天，连服90天，记为E组。5名给予生理盐水口服对照，记为F组。对FSH偏高者10名给予FSH卵黄抗体冲服，剂量为200mg/次/天，连服90天，记为G组。5名给予生理盐水口服对照，记为H组。每个月采血测血清FSH，遵医嘱调整FSH或FSH卵黄抗体的用量。
第90天～120天内B超观察实验对象是否有排卵，记录如表2。结果表明使用重组抗缪勒管激素、重组抗缪勒管激素卵黄抗体，重组卵泡刺激素、重组卵泡刺激素卵黄抗体，可调节卵巢功能促使排卵，有效率达92.5％。对于本系统的反向使用也可开发为避孕措施。
表2：入选实验60名患者治疗后一个月内是否排卵记录(+代表排卵，-代表未排卵)
序号
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
是否排卵
+
+
+
+
+
+
+
+
序号
A9
A10
B1
B2
B3
B4
B5
是否排卵
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序号
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
是否排卵
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序号
C9
C10
D1
D2
D3
D4
D5
是否排卵
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+
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-
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-
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序号
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
是否排卵
+
+
+
+
+
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序号
E9
E10
F1
F2
F3
F4
F5
是否排卵
+
+
-
-
-
-
-
序号
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
是否排卵
-
+
+
+
+
+
+
+
序号
G9
G10
H1
H2
H3
H4
H5
是否排卵
+
+
-
-
-
-
-
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽中起生物科技有限公司
<120> 一种调节卵巢功能的生物制剂及其制备方法和应用
<141> 2021-07-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatggtcgta aaaagcgccg acaacggaga aggatgcgtg atttaccttt gacttctctt 60
gctctcgttc tatccgccct gggcgcatta ttgggaaccg aagcgcttcg cgctgaggaa 120
cccgccgtcg ggacatcagg tctcattttt cgagaggacc tagattggcc accgggcatc 180
cctcaggaac ccctgtgttt agtagcattg ggaggggact cgaatggtag tagctctcca 240
cttcgggtgg ttggcgcgct ctccgcttac gagcaagcct tcctaggagc agtccagaga 300
gcgaggtggg ggccgcgtga tctggctacg tttggtgtat gcaacactgg cgaccgccaa 360
gccgcattac cttcattgcg acggcttgga gcgtggctca gagatcccgg gggtcagagg 420
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<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatggtcgta aaaagcgccg acaacggaga aggatggatt actatcgtaa atacgctgcc 60
atttttttag ttactttgtc tgtcttcctt catgtactcc actccgcacc tgacgtgcag 120
gattgtcccg aatgcaccct acaagagaat ccatttttct cacagccggg cgcgcctatc 180
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gattccgact caactgattg taccgtgcga ggtcttggcc cgtcgtattg cagttttgga 780
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