提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒及其应用 (Kit for increasing number of canine ovarian cumulus-oocyte complexes and application thereof ) 是由 胡敏华 汪荣根 倪庆纯 赵志宏 杜志国 杨玲 周治东 于 2020-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus Oocyte Complexes,COCs)数量的试剂盒及其应用,其试剂盒中添加有苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600三种激素,还建立了一种能在较短时间内使间情期Beagle犬进入发情前期的简易激素诱导方法,此方法能显著提高犬卵巢可用COCs数量,此方法在国内外尚属首次。本发明所述的提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒在十天内使间情期的犬进入发情前期,通过穿刺法从卵巢回收的COCs数平均58枚左右,显著高于正常发情犬只(平均33.7枚左右)。(The invention relates to a kit for increasing the number of canine ovarian Cumulus-Oocyte Complexes (COCs) and application thereof, wherein the kit is added with three hormones, namely estradiol benzoate EB, chlorprostenol PGF2 alpha and a novel hormone preparation FG600, and a simple hormone induction method capable of enabling an episodic Beagle dog to enter the early stage of estrus in a short time is also established. The kit for increasing the number of the canine ovarian cumulus-oocyte complexes enables the intercalary dogs to enter the early estrus stage in ten days, and the number of COCs recovered from the ovaries by a puncture method is about 58 on average and is obviously higher than that of normal estrus dogs (about 33.7 on average).)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒及其应用。
背景技术
Beagle犬是国际公认的实验动物，广泛应用于科学研究的各领域。国内的Beagle犬资源是从国外引进的，目前国外对Beagle的种质资源把控比较严格，因此对国内现有资源的保存和开发显得尤为重要。同时，Beagle犬遗传背景清晰，其基因组与人类相似性高达95.7％，以Beagle犬为实验材料构建疾病模型成为广大学者研究的热点。在犬体外保种工作和疾病模型制备过程中，获得成熟的卵母细胞是至关重要的一步。相对其他哺乳动物而言，由于犬独特的生殖生理特性，其辅助繁殖技术还不成熟。
母犬大部分时间处于发情间期，绝大部分母犬一年只发情1-2次，过长的发情周期制约着犬的生产效益以及育种进度，也影响了疾病模型犬的制备效率。犬排卵时卵母细胞处于生发泡期(Germinal vesicle,GV)，需要在输卵管内进一步发育才能成熟。通过手术活体取成熟的卵母细胞需要耗费大量的人力物力，且每头母犬所排卵母细胞有限。如从犬卵巢收集卵巢卵丘-卵母细胞复合体(COCs:Cumulus Oocyte Complexes,COCs)进行体外培养来获得成熟的卵母细胞将极大的提高工作效率。
处于不同发情阶段的犬，其卵巢所能提供的COCs数量差异较大，有研究证明卵泡期能获得的优质COCs最多(22.7枚)，黄体期次之(10.7枚)，间情期最少(7.3枚)(李继鹏,王锡香,尹熙俊,等.不同生殖周期阶段对犬卵巢卵母细胞体外发育的影响[J].中国畜牧兽医,2012,39(2):125-128.)。而且对于从不同时期的卵巢中获得的COCs的体外成熟能力在诸多研究中还存在争议(Lopes G,Sousa M,Luvoni G C,et al.Recovery rate,morphological quality and nuclear maturity of canine cumulus-oocyte complexescollected from anestrous or diestrous bitches of different ages[J].Theriogenology,2007,68(6):825.)。但普遍认为从卵泡期(发情前期/发情期)卵巢获得的COCs比其他生殖阶段获得的COCs具有更高的核成熟潜能。而犬每年只发情1-2次，间情期长达8个月，要想获得卵巢处于卵泡期的母犬并不容易。因此，如能寻找一种快速有效的使间情期的Beagle犬进入发情前期/发情期(卵巢处于卵泡期)的方法，对Beagle犬卵母细胞体外成熟培养以及后续的辅助繁殖技术的探究都具有积极的推动作用，可大大加快重要种质资源体外保存和疾病模型犬构建研究。
自1939年开始，国内外学者对犬诱导发情排卵的方法进行了很多研究，据有关文献报道，诱导犬发情的外源性激素和药物一般有：促性腺激素释放激素、促性腺激素、前列腺素、雌激素和多巴胺受体激动剂等，几种激素联合使用要优于单种激素，多巴胺受体激动剂类能取得良好的诱导发情效果，但是给药时间长(Kutzler M A.Induction andsynchronization of estrus in dogs[J].Theriogenology,2005,64(3):766-775.)，限制了规模化生产应用。新型激素制剂FG600中包括新型长效重组促卵泡素rFSH，其稳定性高，半衰期更长、活性更高、价格便宜且更容易获得，且在母猪上能有效的应用(陈志林,陈预明,袁梦,等.新型激素制剂FG600对后备母猪同期发情及繁殖性能的影响[J].猪业科学,2014,31(12):102-104.)，但在犬上的应用还暂未发现相关报道。
发明内容
：本发明的目的之一是在于提供一种提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒，其包括有苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600。
在其中一些实施例中，所述犬处于间情期。
在其中一些实施例中，所述犬是Beagle犬。
在其中一些实施例中，所述氯前列醇PGF2α与苯甲酸雌二醇EB的给药单位的比例为：0.1mg：490-510μg。
在其中一些实施例中，所述新型激素制剂FG600的给药单元的量分别为60、40、30和20IU/头。
本发明的目的之一是还在于提供所述苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600在制备提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒中应用。
本发明的目的之一是还在于提供一种提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的方法。
实现上述目的的技术方案如下。
首先对间情期的母犬联合使用PGF2α和EB处理，然后使用新型激素制剂FG600处理，激素处理完成后第三天将实验犬麻醉，手术取卵巢，通过穿刺法获得卵丘-卵母细胞复合体；PGF2α与EB联合注射，PGF2α的注射量为0.1mg/头，方式为肌肉注射。EB的注射量为490-510μg/头，方式为皮下注射，两种激素分别注射两次，时间间隔为48h；新型激素制剂FG600以剂量递减的方式(60、40、30和20IU/头)，连续注射四天。
本发明提供了一种提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒及其应用，其试剂盒包括有苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600，还建立了一种能在较短时间内使间情期Beagle犬进入发情前期的简易激素诱导方法，此方法能显著提高犬卵巢可用COCs数量，此方法在国内外尚属首次。本发明所述的提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒在十天内使间情期的犬进入发情前期，通过穿刺法从卵巢回收的COCs数平均58枚左右，显著高于正常发情犬只(平均33.7枚左右)。
附图说明
图1：间情期和进入发情前期的母犬外阴及阴道涂片。
图2：激素处理后的卵巢。
图3：回收的COCs形态。
具体实施方式
本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
犬间情期和发情前期的区别方法：
选取2-3岁的无繁殖疾病的Beagle犬，间情期的特点主要可通过犬的外阴以及阴道涂片进行判断。处于间情期的犬：外阴皱缩，无明显肿胀，无阴道液体分泌物流出；阴道粘膜脱落的上皮细胞很少，可见的上皮细胞多为中间型或副基质细胞。进入发情前期的犬：外阴肿胀，触摸僵硬,阴门下角悬挂着红色液体小滴；阴道上皮细胞有明显的细胞核，大且染色清晰，细胞呈圆形或椭圆形，视野内可视上皮细胞开始增多，中间型和副基质细胞慢慢减少，阴道上皮细胞开始逐渐角质化，有较多红细胞。
激素的注射方法
第一和第三天，肌肉注射PGF2α0.1mg/头，皮下注射EB 490-510μg/头，犬只对氯前列醇较为敏感，可能会有呕吐作用，会自行恢复；第四天开始，以60、40、30和20IU/头的递减剂量连续注射四天。
回收COCs的方法
激素处理后第十天将实验犬只麻醉，保定，手术取出卵巢后置于含1％双抗的38.5℃生理盐水中尽快送回实验室，除去脂肪和卵巢膜，分离出卵巢，用添加1％双抗的生理盐水清洗三次，然后放入含有10％胎牛血清(FBS)的M199冲卵液中，在恒温台上用无菌1mL注射针用适度力量反复穿刺卵巢表面卵泡，尽量使所有卵泡都穿刺上，然后用手术剪刀充分剪碎卵巢，尽量让COCs释出，在立体显微镜下挑选形态规则、包裹有两层以上卵丘细胞、卵胞质暗灰色的COCs。
实施例1：
本发明所述的提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒，其包括有苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600。
氯前列烯醇(PGF2α)，规格：2ml：4mg(宁波三生生物科技有限公司)。
苯甲酸雌二醇(EB)，规格：2ml：4mg(杭州动物药品厂)。
FG600(细胞工程产品类FSH+hCG)，规格：1200IU/瓶(广州威生医药科技有限公司)。
2-3岁雌性Begle犬5头，来自广州医药研究总院有限公司(实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0007)。
实验犬选取要求：外阴皱缩，无明显肿胀，无阴道液体分泌物流出；阴道粘膜脱落的上皮细胞少，多为中间型或副基质细胞；曾经有过正常的繁殖记录。
处理步骤：第一和第三天，肌肉注射PGF2α0.1mg/头，皮下注射EB 490-510μg/头，犬只对氯前列醇较为敏感，可能会有呕吐作用，会自行恢复；第四天开始，FG600以60、40、30和20IU/头的递减剂量连续注射四天，注射FG600的第三天，实验犬只外阴开始肿胀，逐步进入发情前期；第十天将实验犬麻醉，手术取卵巢置于含1％双抗的38.5℃生理盐水中送回实验室，对卵巢清洗处理后使用无菌1mL注射针用适度力量反复穿刺卵巢表面卵泡，尽量使所有卵泡都穿刺上，然后用手术剪刀充分剪碎卵巢，尽量让COCs释出。
结果：在本实施例中，5头实验犬均成功进入了发情前期(如图1所示)。激素处理后的犬卵巢会肿胀(如图2所示)。本实施例中获得174枚优质COCs(如图3所示)，平均每头犬达到了58.0枚。
对比例1：
挑选出6头自然发情处于发情前期且无生殖疾病的Beagle犬，麻醉后手术取卵巢置于含1％双抗的38.5℃生理盐水中送回实验室，对卵巢清洗处理后使用无菌1mL注射针用适度力量反复穿刺卵巢表面卵泡，尽量使所有卵泡都穿刺上，然后用手术剪刀充分剪碎卵巢，尽量让COCs释出。平均每头犬得到48.6枚COCs。
对比例2：
挑选出3头处于间情期且无生殖疾病的Beagle犬，麻醉后手术取卵巢置于含1％双抗的38.5℃生理盐水中送回实验室，对卵巢清洗处理后使用无菌1mL注射针用适度力量反复穿刺卵巢表面卵泡，尽量使所有卵泡都穿刺上，然后用手术剪刀充分剪碎卵巢，尽量让COCs释出。平均每头犬得到17.7枚COCs。
对比例3：
挑选出6头处于间情期且无生殖疾病的Beagle犬，随机分为两组。所用药物有苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600。
氯前列烯醇(PGF2α)，规格：2ml：4mg(宁波三生生物科技有限公司)。
苯甲酸雌二醇(EB)，规格：2ml：4mg(杭州动物药品厂)。
FG600(细胞工程产品类FSH+hCG)，规格：1200IU/瓶(广州威生医药科技有限公司)。
第1组犬只第一和第三天肌肉注射PGF2α0.1mg/头，第四天开始，FG600以60、40、30和20IU/头的递减剂量连续注射四天；第2组犬只第一和第三天皮下注射EB 490-510μg/头，第四天开始，FG600以60、40、30和20IU/头的递减剂量连续注射四天。第十天将两组实验犬麻醉，手术取卵巢置于含1％双抗的38.5℃生理盐水中送回实验室，对卵巢清洗处理后使用无菌1mL注射针用适度力量反复穿刺卵巢表面卵泡，尽量使所有卵泡都穿刺上，然后用手术剪刀充分剪碎卵巢，尽量让COCs释出。第1组平均每头犬得到26.7枚COCs，第2组平均每头犬得到33.4枚COCs。
通过对比实施例1和对比例1、2、3可以看出，采用本发明所述的提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒，能有效的使间情期的Beagle犬进入发情前期，并且从卵巢中获得的COCs数量都显著高于处于正常发情前期和间情期的犬只。本发明所述的提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒能有效的提高卵巢的利用率，为卵母细胞体外培养研究提供更多的实验材料。
本发明所述的提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒，其含有苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600，准备向市场上投放。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
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