一种具有抗炎效果的溶菌酶制剂
阅读说明：本技术 一种具有抗炎效果的溶菌酶制剂 (Lysozyme preparation with anti-inflammatory effect ) 是由 陈生红 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有抗炎效果的溶菌酶制剂,其中活性成分溶菌酶和白毛藤提取物的重量比为1：(1-5),所述白毛藤提取物为白毛藤生物碱、白毛藤多糖或其混合物。本发明含溶菌酶的制剂制备方法简单,配伍合理,多种活性成分在发挥各自功效的同时,又能产生协同增效作用,具有显著的抗炎效果。本发明的溶菌酶和白毛藤提取物来源天然,无毒副作用。(The invention relates to a lysozyme preparation with anti-inflammatory effect, wherein the weight ratio of active ingredients of lysozyme to solanum lyratum extract is 1: (1-5), the solanum lyratum extract is solanum lyratum alkaloid, solanum lyratum polysaccharide or a mixture thereof. The preparation method of the lysozyme-containing preparation is simple, the compatibility is reasonable, the various active ingredients can generate the synergistic interaction while playing respective effects, and the lysozyme-containing preparation has a remarkable anti-inflammatory effect. The lysozyme and the solanum lyratum extracts have natural sources and no toxic or side effect.)
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种溶菌酶制剂。
背景技术
炎症反应是伴随多种疾病状态的一种共有的病理现象，在有血管分布的组织或细胞在应对损伤性刺激时，通过释放炎性介质所发生的防御反应，具有杀灭病原体，限制感染和修复损伤等作用。炎症反应通常需要精确调控，反应紊乱会造成组织损伤危害机体，严重时可危及生命。
溶菌酶存在于卵清、唾液等生物分泌液中，能够催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键的水解。当与带负电荷的病毒蛋白相互结合时，溶菌酶能够与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，这种复盐可使病毒失去活力。
溶菌酶对革兰氏阳性菌如喜氧性孢子形成菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌等具有明显的抗菌作用，而对人体生物兼容性好且无免疫原性，在临床上广泛应用于有抗菌、抗病毒、止血、增强免疫力及加快组织恢复功能等。特别是溶菌酶已被国际食品法典委员会和我国卫生部门允许作为食品应用于防腐剂应用于干酪及发酵酒，现已被广泛应用于食品加工领域。
白毛藤又名白英，别名毛风藤、毛葫芦、毛秀才，系茄科植物白英的全草，是一种多年生蔓性草本植物，广泛分布于浙江、江苏、江西、安徽、湖南等省，主要在夏季采收，资源相当丰富。白毛藤干燥全草作为传统中药已有2000多年的历史，根据《神农本草经》记载，白英味甘寒。主寒热，消渴，补中益气，久服轻身延年。白毛藤以全草及根入药，具有清热利湿、解毒消肿、抗癌等功能，主治感冒发热、黄疸型肝炎、胆囊炎、淋病、风湿性关节炎、胆石症、疟疾、子宫糜烂、白带、疔毒、肾炎水肿等症，临床上也用于治疗各种癌症，尤其对子宫颈癌、肺癌、食道癌、肝癌、胃癌、声带癌等有一定疗效。白毛藤主要化学成分为β-羟基甾体生物碱，其次是多糖、咖啡酸和香草酸等。
目前，将溶菌酶与白毛藤提取物组合用于抗炎药物的应用尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能有效抗炎，无毒副作用，活性成分来源天然的药物制剂。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是，提供一种具有抗炎效果的溶菌酶制剂，其中活性成分溶菌酶和白毛藤提取物的重量比为1：(1-5)。
优选的，所述白毛藤提取物为白毛藤生物碱、白毛藤多糖或其混合物。
更优选的，所述白毛藤提取物为白毛藤生物碱和白毛藤多糖的混合物。
优选的，所述白毛藤生物碱的制备方法为：取白毛藤干燥粉末，加入乙醇于回流提取，减压浓缩，加入酸调节pH至3，充分搅拌溶解后静置，过滤；滤液用正己烷萃取，将萃取后的酸性溶液加碱调节pH至10，用二氯甲烷萃取；然后将碱性母液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩回收溶剂，即得白毛藤生物碱。
更优选的，所述白毛藤生物碱的制备方法为：取白毛藤干燥粉末，加入2倍重量90％乙醇于50℃回流提取6h，减压浓缩，加入稀盐酸调节pH至3，充分搅拌溶解后静置12h，过滤；滤液用等量正己烷萃取2次，将萃取后的酸性溶液加浓氨水调节pH至10，用二氯甲烷萃取3次；然后将碱性母液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩回收溶剂，即得白毛藤生物碱。
优选的，所述白毛藤多糖的制备方法为：取白毛藤干燥粉末，加水混匀后高温浸提，取上清液真空浓缩，用乙醇沉淀，沉淀物再溶于适量水中，用Sevag法脱蛋白，加入乙醇沉淀，真空干燥得白毛藤多糖。
更优选的，所述白毛藤多糖的制备方法为：取白毛藤干燥粉末，加10倍重量的水混匀，在70℃浸提4小时，取上清液真空浓缩，用6倍浓缩液体积的95％乙醇沉淀，沉淀物再溶于适量水中，用Sevag法脱蛋白，加入适量95％乙醇沉淀，真空干燥得白毛藤多糖。
优选的，所述溶菌酶制剂中，溶菌酶、白毛藤生物碱和白毛藤多糖的重量比为1：(1-2)：(1-2)。
更优选的，所述溶菌酶制剂中，溶菌酶、白毛藤生物碱和白毛藤多糖的重量比为1：1：2。
优选的，所述溶菌酶提取自鸡蛋清。
优选的，所述溶菌酶制剂中进一步包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述溶菌酶制剂的剂型为片剂、胶囊或注射剂。
本发明还提供一种上述溶菌酶制剂在制备抗炎药物中的应用。
本发明具有积极有益的效果：令人惊奇的是，经过反复多次试验，本发明意外发现将溶菌酶与白毛藤生物碱和白毛藤多糖组合使用，对于治疗炎症具有协同增效的效果。本发明含溶菌酶的制剂制备方法简单，配伍合理，多种活性成分在发挥各自功效的同时，又能产生协同增效作用，具有显著的抗炎效果。另外，溶菌酶和白毛藤提取物来源天然，无毒副作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例和试验例中使用的溶菌酶均为提取自鸡蛋清中的溶菌酶。
实施例1、白毛藤生物碱提取物的制备
取白毛藤干燥粉末100g，加入2倍重量90％乙醇于50℃回流提取6h，减压浓缩，加入稀盐酸调节pH至3，充分搅拌溶解后静置12h，过滤；滤液用等量正己烷萃取2次，将萃取后的酸性溶液加浓氨水调节pH至10，用二氯甲烷萃取3次；然后将碱性母液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩回收溶剂，即得白毛藤生物碱。
实施例2、白毛藤多糖提取物的制备
取白毛藤干燥粉末100g，加10倍重量的水混匀，在70℃浸提4小时，取上清液真空浓缩，用6倍浓缩液体积的95％乙醇沉淀，沉淀物再溶于适量水中，用Sevag法脱蛋白，加入适量95％乙醇沉淀，真空干燥得白毛藤多糖。
实施例3、含溶菌酶和白毛藤生物碱的胶囊剂
将0.4g溶菌酶、1.2g实施例1制备得到的白毛藤生物碱与1g微晶纤维素、0.3g羧甲基淀粉钠、0.1g硬脂酸镁充分混合干法制成颗粒，灌装于明胶胶囊中，得到单位重量300mg的胶囊剂10粒。
实施例4、含溶菌酶和白毛藤多糖的胶囊剂
将0.4g溶菌酶、1.2g实施例2制备得到的白毛藤多糖与1g微晶纤维素、0.3g羧甲基淀粉钠、0.1g硬脂酸镁充分混合干法制成颗粒，灌装于明胶胶囊中，得到单位重量300mg的胶囊剂10粒。
实施例5、含溶菌酶、白毛藤生物碱和白毛藤多糖(1:1.5:1.5)的胶囊剂
将0.4g溶菌酶、0.6g实施例1制备得到的白毛藤生物碱、0.6g实施例2制备得到的白毛藤多糖与1g微晶纤维素、0.3g羧甲基淀粉钠、0.1g硬脂酸镁充分混合干法制成颗粒，灌装于明胶胶囊中，得到单位重量300mg的胶囊剂10粒。
实施例6、含溶菌酶、白毛藤生物碱和白毛藤多糖(1:2:1)的胶囊剂
将0.4g溶菌酶、0.8g实施例1制备得到的白毛藤生物碱、0.4g实施例2制备得到的白毛藤多糖与1g微晶纤维素、0.3g羧甲基淀粉钠、0.1g硬脂酸镁充分混合干法制成颗粒，灌装于明胶胶囊中，得到单位重量300mg的胶囊剂10粒。
实施例7、含溶菌酶、白毛藤生物碱和白毛藤多糖(1:1:2)的胶囊剂
将0.4g溶菌酶、0.4g实施例1制备得到的白毛藤生物碱、0.8g实施例2制备得到的白毛藤多糖与1g微晶纤维素、0.3g羧甲基淀粉钠、0.1g硬脂酸镁充分混合干法制成颗粒，灌装于明胶胶囊中，得到单位重量300mg的胶囊剂10粒。
试验例1、本发明含溶菌酶制剂的抗炎效果试验
1、细胞炎症模型建立
实验分组：配制LPS浓度分别为0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L和4mg/L的DMEM细胞培养液。在24孔板中加入充分混匀的细胞悬浮液1mL(每孔1×105个细胞)，培养24h后移去培养基，按上述分组加入1mL样品溶液，培养24h，每组设置3个复孔。采用Griess试剂盒测定上述细胞上清液的NO含量，选择NO释放量与对照组有显著性差异的LPS浓度进行后续实验。
2、NO含量测定
在24孔板中加入充分混匀的细胞悬浮液1mL(每孔1×105个细胞)，培养24h，弃去培养基，进行分组实验，每组设3个复孔。实验分组如下：正常对照组(不加药物和LPS)、LPS模型组(1mg/L LPS)、试验组1(1mg/L LPS+1mg/mL溶菌酶溶液)、试验组2(1mg/L LPS+1mg/mL实施例1制备的白毛藤生物碱溶液)、试验组3(1mg/LLPS+1mg/mL实施例2制备的白毛藤多糖溶液)、试验组4(1mg/L LPS+0.25mg/mL溶菌酶溶液+0.75mg/mL实施例1制备的白毛藤生物碱溶液)、试验组5(1mg/LLPS+0.25mg/mL溶菌酶溶液+0.75mg/mL实施例2制备的白毛藤多糖溶液)、试验组6(1mg/L LPS+0.25mg/mL溶菌酶溶液+0.375mg/mL实施例1制备的白毛藤生物碱溶液+0.375mg/mL实施例2制备的白毛藤多糖溶液)、试验组7(1mg/L LPS+0.25mg/mL溶菌酶溶液+0.5mg/mL实施例1制备的白毛藤生物碱溶液+0.25mg/mL实施例2制备的白毛藤多糖溶液)、试验组8(1mg/L LPS+0.25mg/mL溶菌酶溶液+0.25mg/mL实施例1制备的白毛藤生物碱溶液+0.5mg/mL实施例2制备的白毛藤多糖溶液)。除正常对照组以外，其余各组先加入1ml含1mg/L LPS的DMEM细胞培养液(即LPS加入量均为1mg)，培养24h，弃去培养液，再按上述分组加入总计1ml的含溶菌酶和/或白毛藤提取物的各组样品DMEM细胞培养液(即溶菌酶、白毛藤多糖和白毛藤生物碱均溶解于DMEM细胞培养液，每个试验组中活性成分溶菌酶和/或白毛藤提取物的总加入量均为1mg)，培养24h，收集细胞上清液，采用Griess试剂盒测定不同样品对RAW264.7细胞释放NO的含量，具体试验结果如下表1所示。
表1本发明溶菌酶制剂对RAW264.7细胞释放NO含量的影响
试验组
NO含量(μmol/L)
正常对照组
6.2
LPS模型组
35.5
试验组1(溶菌酶)
19.4
试验组2(白毛藤生物碱)
24.3
试验组3(白毛藤多糖)
26.9
试验组4(溶菌酶：白毛藤生物碱＝1:3)
16.4
试验组5(溶菌酶：白毛藤多糖＝1:3)
15.3
试验组6(溶菌酶：白毛藤生物碱：白毛藤多糖＝1:1.5:1.5)
14.9
试验组7(溶菌酶：白毛藤生物碱：白毛藤多糖＝1:2:1)
15.7
试验组8(溶菌酶：白毛藤生物碱：白毛藤多糖＝1:1:2)
9.8
炎症是一种免疫应答反应。当机体受有毒害物质刺激时，炎症反应可以发现致炎物质，作出一系列的免疫反应，可以修复机体组织和细胞的损伤，从而使机体免受伤害，起到保护机体的作用。NO是一种自由基性质的物质，可以由巨噬细胞或者其他免疫激活细胞产生。可以通过测定NO的释放量建立细胞炎症模型。用LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症是一种常用的细胞炎症模型。如表1所示，通过Griess试剂盒检测，LPS作用于RAW264.7细胞24h后，与正常对照组相比，其NO释放量均有极显著性差异，说明建模成功。
本发明不同处方的溶菌酶和白毛藤提取物试验组可以显著降低RAW264.7细胞的NO释放量，表明其对RAW264.7细胞炎症具有明显改善作用。特别是在活性成分总量保持不变的情况下，使用本发明含溶菌酶与白毛藤生物碱和/或白毛藤多糖的组合物较单独使用溶菌酶、白毛藤生物碱或白毛藤多糖，RAW264.7细胞的NO释放量均有不同程度的降低，证明溶菌酶和白毛藤提取物的组合使用产生了协同效果，减少了抗炎成分的使用量。
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