一种3d打印的肿瘤疫苗组合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种3d打印的肿瘤疫苗组合物及其制备方法与应用 (Tumor vaccine composition for 3D printing and preparation method and application thereof ) 是由 汪超 张越 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种3D打印的肿瘤疫苗组合物及其制备方法与应用。本发明的肿瘤疫苗组合物是将肿瘤抗原或疫苗制剂与生物安全性大分子材料制备成3D打印墨水,通过3D打印,制备多孔结构的肿瘤疫苗组合物；其中,所述的多孔结构是在肿瘤疫苗组合物的表面和内部设置若干孔径为1-10μm的孔隙。本发明的肿瘤疫苗具有良好的生物安全性和生物相容性,制备过程简便,易于大规模生产、储存和使用。本发明还公开了基于3D打印技术的肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫疗效,与免疫检查点抑制疗法联合后,可以显著提高肿瘤组织中的免疫细胞浸润,有效预防、治疗肿瘤。(The invention discloses a 3D printed tumor vaccine composition, and a preparation method and application thereof. The tumor vaccine composition is prepared by preparing a tumor antigen or a vaccine preparation and a biosafety macromolecular material into 3D printing ink, and preparing the tumor vaccine composition with a porous structure through 3D printing; wherein, the porous structure is formed by arranging a plurality of pores with the pore diameter of 1-10 mu m on the surface and in the tumor vaccine composition. The tumor vaccine has good biological safety and biocompatibility, simple and convenient preparation process and easy large-scale production, storage and use. The invention also discloses an anti-tumor immune curative effect of the tumor vaccine based on the 3D printing technology, and the anti-tumor immune curative effect can obviously improve the immune cell infiltration in tumor tissues and effectively prevent and treat tumors after being combined with an immune checkpoint inhibition therapy.)
技术领域
本发明涉及一种3D打印的肿瘤疫苗组合物及其制备方法与应用，属于生物医药材料技术领域。
背景技术
3D打印技术作为新兴的增材制造技术，由于其快速制造、低成本、可定制等一系列优点，因此具有广泛的应用前景。与传统的制造工艺相比，3D打印技术通过数字模型计算，运用一些可粘合材料进行逐层打印来构建物体，可以实现高精度的制造，以及有效利用原材料，此外，其最大优点还在于可以实现大批量、高品质的快速制造。3D打印技术目前被广泛用于医疗保健、文化教育以及航空航天等领域，是一种热门且应用极广的智能快速成型技术。由于3D打印技术可以实现较高程度的仿生制造，因此，在临床个性化定制领域具有广阔的研究应用前景。
癌症，作为21世纪人类面临的一项极大难题，正在严重威胁着人类的健康。免疫治疗作为一种应用极广的癌症治疗手法，旨在通过刺激和增强机体的免疫功能来抑制和杀死肿瘤细胞，以达到抑制肿瘤生长或清除肿瘤的目的。目前的免疫治疗包括肿瘤疫苗，免疫检查点抑制以及T细胞过继疗法，它正成为肿瘤治疗的主流疗法之一。肿瘤疫苗，通过提供多种肿瘤抗原来产生持续的抗肿瘤免疫识别和刺激特异性免疫。然而，对癌症疫苗的研究仍处于初级阶段，大多数癌症疫苗临床疗效不佳。这主要是由于机体对肿瘤抗原的摄取和识别水平较低以及较低程度的抗原递呈细胞的激活。基于此，研究人员研究开发了一系列新型的肿瘤疫苗，如通过纳米粒子实现高效的肿瘤抗原递送以及通过凝胶载体实现抗原的递送。尽管这些技术在一定程度上促进了免疫细胞对抗原的识别和摄取，但往往伴随有较强的毒副作用。此外，基于水凝胶的肿瘤疫苗由于自身局限，很难批量稳定的制造和储存。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种3D打印的肿瘤疫苗组合物，构建具有特定结构的可植入肿瘤疫苗，实现快速、稳定的批量制造。
本发明的第一个目的是提供一种3D打印的肿瘤疫苗组合物，所述的肿瘤疫苗组合物是将肿瘤抗原或疫苗制剂与生物安全性大分子材料制备成3D打印墨水，通过3D打印，制备多孔结构的肿瘤疫苗组合物；其中，所述的多孔结构是在肿瘤疫苗组合物的表面和内部设置若干孔径为1-10μm的孔隙。
进一步地，所述的生物安全性大分子材料为明胶、海藻酸钠、琼脂、聚乳酸、聚己内酯、纤维素、丝素蛋白、甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺及其衍生物、透明质酸、卡拉胶等中的一种或多种。
进一步地，所述的肿瘤抗原为可以被抗原递呈细胞识别摄取，在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质，包括蛋白、多肽、核酸，如癌胚抗原(CEA)、糖基抗原、甲胎蛋白(AFP)、糖蛋白抗原(CA50)、细胞抗原、肿瘤裂解物等中的一种或多种。
进一步地，所述的若干孔径为1-10μm的孔隙阵列排布在肿瘤疫苗组合物的表面和内部。
本发明的第二个目的是提供一种所述的肿瘤疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将生物安全性大分子材料充分溶解，得到生物安全性大分子材料溶液；
S2、将肿瘤抗原或疫苗制剂制备成溶液，过滤除菌得到肿瘤抗原或疫苗制剂溶液；
S3、将生物安全性大分子材料溶液与肿瘤抗原或疫苗制剂溶液混合，并去除混合溶液中的气泡，得到3D打印墨水；
S4、设置打印参数，构建打印模型，然后通过3D打印机打印制备肿瘤疫苗支架；
S5、打印结束后，对肿瘤疫苗支架进行固化交联，得到所述的肿瘤疫苗组合物。
进一步地，所述的生物安全性大分子材料与所述的肿瘤抗原或疫苗制剂的质量比为1000:1-200:1。
进一步地，在S3步骤中，去除混合溶液中的气泡是将混合溶液超声处理3分钟以上，然后在1000～3000rpm下离心处理。
进一步地，在S4步骤中，打印参数设置为：打印温度为20～30℃，打印速度为4-20mm/s，层高为0.2～04mm。
本发明的第三个目的是提供所述的肿瘤疫苗组合物在制备抗肿瘤免疫治疗与预防的药物中的应用。
本发明利用肿瘤抗原与生物安全性大分子材料相混合，构建可打印生物墨水，批量、稳定、可定制的制造肿瘤疫苗墨水，用于3D打印肿瘤疫苗支架。通过3D打印技术，构建可植入的肿瘤疫苗，促进免疫细胞对抗原的识别和摄取，诱导强健的免疫反应，实现有效的抗肿瘤免疫治疗与预防。与此同时，基于3D打印技术的肿瘤疫苗还可以结合现有的肿瘤免疫制剂，构建多功能免疫激活微环境，实现高效的免疫系统激活。
在生物学中，一个关键观点是结构决定功能。我们使用3D打印技术构建了一个“人工三级淋巴结构(aTLS)”，可以模拟体内的淋巴结构。在我们的研究中，具有多孔结构的打印支架具有与真实淋巴器官相似的功能。例如，肿瘤疫苗复合的3D支架本身也可以吸引大量先天性免疫细胞，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NK)，从而形成免疫微环境，用于增强癌症疫苗效果。3D打印的支架建立了有利于免疫细胞浸润的微环境。这种精确的多孔结构很难通过传统的水凝胶或化学工程方法来实现。此外，3D打印技术能够实现快速制造，高可塑性的个性化医疗和相对较低的成本，这为疫苗支架的制造提供了新的机会。
本发明的有益效果是：
1、本发明的疫苗载体是由生物安全性高分子材料为基底，具有良好的生物安全性，副作用小；
2、本发明所述的肿瘤疫苗与现阶段肿瘤疫苗相比，其制造、储存更为便捷，相较于传统疫苗的佐剂，其生物安全性高分子材料的潜在佐剂效应具有更低的副作用，可以有效促进抗原的识别和摄取，诱发强健的抗肿瘤免疫反应；
3、本发明所述的3D打印肿瘤疫苗第一次将3D打印技术与肿瘤免疫治疗相结合，可以模拟体内的淋巴结构。具有多孔结构的打印支架具有与真实淋巴器官相似的功能。例如，肿瘤疫苗复合的3D支架本身也可以吸引大量先天性免疫细胞，利用3D打印技术的潜在优势，为临床应用转化提供了可能。
4、基于3D打印技术的肿瘤疫苗可以结合传统疫苗和个性化治疗的优点，为精准医疗，个性预防提供基础。
附图说明
：图1为本发明的支架模型及孔隙结构；
图2为本发明的打印墨水的流变性能与剪切频率的关系；
图3为本发明的打印墨水的流变性能与温度的变化关系；
图4为本发明的装载抗原前后打印材料的XRD分析，其中A为单纯的打印墨水，B为装载肿瘤抗原的打印墨水；
图5为本发明的可打印墨水的相关力学性能；
图6为本发明的打印支架疫苗的扫面电镜图片；
图7为本发明的打印支架疫苗的批量制造以及打印性能的证明；
图8为本发明的3D打印支架疫苗的体内降解以及相关表征；
图9为本发明的3D打印支架疫苗埋植后接种区域附近组织皮肤的HE染色切片图片；
图10为本发明的3D打印支架疫苗体外诱导骨髓来源树突状细胞成熟；
图11为本发明的3D打印支架疫苗体外诱导骨髓来源树突状细胞相关细胞因子分泌；
图12为本发明的3D打印免疫疫苗接种后七天小鼠主要器官的HE染色切片图片；
图13为本发明的3D打印支架疫苗接种后小鼠相关血常规参数的变化；
图14为本发明的3D打印支架疫苗体内细胞招募；
图15为本发明的3D打印支架疫苗体内招募DC细胞促进DC细胞成熟和抗原递呈；
图16为本发明的3D打印支架疫苗体内招募巨噬细胞，促进巨噬细胞分化和抗原递呈；
图17为本发明3D打印支架疫苗接种后的肿瘤生长曲线；
图18为本发明3D打印支架疫苗接种后的小鼠的生存曲线以及体重变化；
图19为本发明3D打印支架疫苗接种后的小鼠的肿瘤组织的免疫细胞浸润情况及免疫激活；
图20为在手术切除肿瘤前通过3维激光扫描系统对切除肿瘤进行数学模拟并进行仿生制造；
图21为本发明的3D打印支架疫苗在手术切除后在切除部位接种后的肿瘤转移预防的肿瘤生长曲线；
图22为本发明的3D打印支架疫苗在手术切除后在切除部位接种后的肿瘤转移预防的小鼠生存曲线以及小鼠体重图；
图23为在手术切除后，在切除部位接种本发明的3D打印支架疫苗后小鼠血清中相关细胞因子的分泌情况；
图24为小鼠在手术切除后接种打印支架疫苗的肿瘤HE染色切片图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠购于常州卡文斯实验动物有限公司。所有小鼠实验按照苏州大学实验动物中心批准的动物实验方案进行。
小鼠黑色素瘤B16-OVA肿瘤细胞购于中国科学院上海生物科学研究所细胞库。骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)按照既定方法从7-8周龄C57BL/6小鼠骨髓腔提取。使用第三代或者第四代传代培养的细胞用于本发明的各实施例。
实施例1：3D支架免疫疫苗打印墨水的制备以及支架疫苗的构建
称取海藻酸钠溶解于10mL去离子水中，在混匀仪下充分混合溶解。得到均一的海藻酸钠溶液后，称取一定质量的明胶加入海藻酸钠溶液中，在60℃油浴30分钟，使明胶充分溶解，得到可打印墨水。称取肿瘤相关抗原，溶解在PBS中，将配置好的无菌抗原溶液加入打印墨水中，通过物理混合，使抗原溶液和打印墨水充分混合。将制备好的肿瘤疫苗打印墨水超声1分钟，随后在1500-3000rpm离心3分钟，除去溶液中的气泡，避免影响后续打印的稳定性和降低材料的力学性能。除去气泡后，将制备好的溶液吸取到无菌的注射器中，放置于冰箱储存待用。
通过切片软件对支架疫苗进行建模，通过构建10*10*4mm的六方体支架疫苗、10mm圆柱支架疫苗以及通过定制化制备的个性化模型。通过调节填充率，调节支架疫苗外在的孔隙分布，填充率越高，孔隙间隔越小。以0.25mm层高为例，通过打印堆叠，构建16层堆叠的支架节构，20％填充率时，外在支架孔隙在500μm，内在孔径分布在10μm左右，如图1所示。基于不同模型，打印速度4-20mm/min，打印层高0.2-0.4mm，打印温度20-30摄氏度，填充率20-100％，并输出打印G代码。通过3D打印机，构建支架疫苗，打印完成后，将支架疫苗放置于2％CaCl2溶液中处理3分钟，通过钙离子交联提高支架疫苗的稳定性和力学性能。
实施例2：3D打印支架疫苗的相关表征
首先我们通过流变实验验证了肿瘤疫苗的相关流变性能，结果如图2，图3所示，随着剪切频率的变化，肿瘤疫苗打印墨水仍具有良好的流变性能。此外，随着温度的增加，出现凝胶-溶胶转变。XRD分析证明，在抗原加入前后，材料均是无定型结构，如图4所示。采用力学测试系统对加入抗原前后的打印墨水的力学性能进行研究，结过如图5所示，再加入抗原后，材料的力学性能出现一定程度的提升，其拉伸应力、断裂应变以及压缩应力都有效提高，证明抗原可以在系统中充当组分。利用扫描电镜对制备的支架疫苗进行表征，结果如图6所示，支架结构完整，没有明显的结节，此外，支架疫苗具有良好的孔洞结构，平均孔隙约为5μm。对于打印系统以及批量温蒂制造进行了证明，结果如图7所示，可以通过3D打印机批量稳定的制造支架疫苗，此外，打印系统也具有良好的还原性，可以较好地制造所需模型。
实施例3：3D打印制剂疫苗的生物安全性分析
小鼠皮下接种支架疫苗，研究支架疫苗的体内降解情况，结果如图8所示，随着埋植时间的延长，支架疫苗逐渐降解，在第七天，大部分支架疫苗降解。此外，扫描电镜图片也对不同时间点的支架疫苗的形貌结构进行了研究，也佐证了支架疫苗在体内的降解。与此同时，收集接种区域的皮肤组织，研究在疫苗接种后相关区域的毒副作用，通过对皮肤组织的HE染色切片可以发现，在打印疫苗接种区域皮肤没有明显的损伤，证明支架疫苗具有良好的生物安全性以及较低的副作用，实验结果如图9所示。
实施例4：3D打印支架疫苗体外诱导DC细胞成熟和相关细胞因子分泌
根据已有方法提取小鼠骨髓来源树突状细胞，待其成熟度至10％左右时，将其与LPS，PBS，空白支架以及装载肿瘤抗原的支架疫苗共孵育24小时，收集上清液保存于-80℃供后续检测细胞因子，1,200rpm离心3分钟收集BMDCs，通过流式细胞术分析共刺激因子(CD80，CD86)的表达。结果如图10所示，支架疫苗可以有效的促进DC细胞的成熟，此外，空白支架也可以在一定程度上提高DC的成熟度，证明了空白支架的潜在佐剂效应。通过ELISA对刺激后DC细胞分泌的相关细胞因子进行分析，结果如图11所示，经过空白支架以及支架疫苗刺激后，BMDC有效地分泌了TNF-α，IL-1β，IL-6等细胞因子，这为后续体内诱导强烈的抗肿瘤免疫应答提供了依据。
实施例5：3D打印支架疫苗体内生物安全性以及细胞招募
(1)体内生物安全性
小鼠分别接种空白支架，支架疫苗，以及PBS，研究打印支架免疫疫苗在体内的生物安全性。在接种后第七天，收集小鼠主要器官，进行HE染色切片分析，结果如图12所示，在节中空白支架和支架疫苗后，小鼠的主要器官没有出现明显的损伤，证实了支架疫苗的生物安全性。此外，收集小鼠血液，加入抗凝剂进行血常规测试，结果如图13所示，实验处理组与对照组相比，血常规的主要参数均为出现明显变化，均在正常指标范围内，进一步证明了支架疫苗在体内应用的安全性和合理性。
(2)体内免疫细胞招募
分别在小鼠体内埋植空白支架以及支架免疫疫苗，研究在不同时间点的支架疫苗的体内免疫细胞招募情况以及相关的免疫细胞激活。结果如图14所示，支架疫苗可以有效的招募T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞以及DC细胞，此外，相比于空白支架，支架疫苗的免疫细胞招募效果也更好。在招募的免疫细胞中，DC细胞和巨噬细胞的比例最多，因此，研究了在两种不同支架中的DC细胞激活和巨噬细胞极化情况。如图15所示，支架疫苗中的DC细胞成熟度相较于空白支架更高，表明装载抗原后支架疫苗可以更有效的激活DC细胞，这与前述的体外DC细胞激活相一致。此外，支架疫苗中的DC细胞的抗原递呈水平也更明显，在第九天，抗原递呈分子MHC II的表达水平是空白支架的一倍，表明支架疫苗可以更有效的促进DC细胞的抗原识别和摄取。巨噬细胞的极化情况也证实支架疫苗相较于空白的支架具有更好的免疫激活效果，在支架疫苗中，更多的巨噬细胞表现出M1型，巨噬细胞的抗原递呈水平也与DC细胞相一致，结果如图16所示。进一步证明，支架疫苗能更有效地促进抗原的识别和摄取，提高机体的免疫激活水平。
实施例6:3D打印支架疫苗体内肿瘤预防和抗肿瘤疗效
通过构建预防模型来验证支架疫苗的体内肿瘤预防疗效。在小鼠接种支架疫苗后，用B16-OVA肿瘤细胞验证支架疫苗的预防疗效，通过检测肿瘤生长情况来判断肿瘤预防疗效。如图17所示，支架疫苗可以显著抑制肿瘤的生长，在联合anti-PD-L1治疗后，可以实现协同治疗，进而有效的抑制肿瘤的生长。支架疫苗组和联合治疗组的小鼠存活时间也得到有效延长，表明支架疫苗具有良好的预防疗效。此外，实验过程中小鼠的体重未出现明显的变化，也表明治疗方法具有较低的副作用，结果如图18所示。通过对肿瘤组织中的免疫细胞进行分析，研究了支架疫苗抑制肿瘤生长的内在机制。如图19所示，支架疫苗治疗组以及联合治疗组中CD8+T细胞出现明显提高。在支架疫苗治疗后，CD8+T细胞与Treg的比例也明显高于对照组，与此同时，Ki67，IFN-γ以及Granmezy B的表达水平也出现明显的提升，证实了在支架疫苗接种后，有效的激活了系统的免疫应答，形成了强健的抗肿瘤免疫微环境。
实施例7:手术切除个性化定制3D打印支架疫苗及肿瘤预防
由于3D打印技术可以实现良好的生物仿生和制造，基于此，结合临床实际，我们将手术切除与支架疫苗相结合，构建个性化的3D打印支架疫苗。首先，我们通过激光扫描三维建模技术，对小鼠待切除肿瘤进行数学模拟，构建个性化肿瘤疫苗模型，结果如图20所示，通过3D打印技术可以有效的实现手术伤口的个性化定制化。在手术切除小鼠肿瘤后，将定制化的支架疫苗埋植在手术部位，进行伤口填充和二次免疫。随后研究在定制化手术填充和免疫后的小鼠对于肿瘤迁移和复发的疗效。结果如图21所示，个性化肿瘤疫苗可以有效的抑制肿瘤的生长，同时有效的延长小鼠的生存时间。联合anti-PD-L1可以更有效的抑制肿瘤的复发和迁徙，同时有效的保证术后小鼠的生存状况，结果如图22所示。在接种个性化疫苗后收集小鼠血清，研究小鼠血清中相关细胞因子的情况，结果如图23所示，在支架疫苗和联合治疗组中，小鼠血清中的TNF-α以及IFN-γ均明显上调，揭示了小鼠内在免疫系统的激活。收集小鼠肿瘤，通过HE染色切片分析发现手术切除后进行个性化肿瘤疫苗接种可以有效的抑制肿瘤的生长，结果如图24所示。
综上，本发明的基于3D打印的肿瘤免疫疫苗不仅可以有效的实现肿瘤的预防，此外还可以充分利用3D打印技术的特点，实现肿瘤疫苗的批量稳定制造以及定制化制造。同时，肿瘤抗原可以作为支架疫苗的内在成分，促进支架疫苗力学性能的提升，支架疫苗通过支架组分的潜在佐剂效应也可以有效的招募免疫细胞，促进免疫细胞对抗原的识别和摄取，从而实现“人工三级淋巴结”的构建，进而实现有效的免疫激活和肿瘤预防。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种鸽球虫病活疫苗及其制备方法和应用