包含抗人干扰素α受体1（IFNAR1）单克隆抗体的液体制剂
阅读说明：本技术 包含抗人干扰素α受体1（IFNAR1）单克隆抗体的液体制剂 (Liquid formulations comprising anti-human interferon alpha receptor 1(IFNAR1) monoclonal antibodies ) 是由 薛刚 朱华杰 王云霞 黄文俊 戴长松 李帅 张秋月 吴亦亮 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种包含抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的液体制剂,所述的液体制剂包含蛋白质浓度为100-200mg/ml的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体以及氨基酸浓度为5-300mM的碱性氨基酸；所述抗IFNAR1单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3),其中：(a)CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；(b)CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；(c)CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(d)CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；(e)CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；且(f)CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。所述的液体制剂的粘度较低,可用注射器轻松推注,因此可以用作注射剂,尤其是皮下注射剂。(The invention discloses a liquid preparation containing an anti-human interferon alpha receptor 1(IFNAR1) monoclonal antibody, which comprises an anti-human interferon alpha receptor 1(IFNAR1) monoclonal antibody with the protein concentration of 100-200mg/ml and basic amino acid with the amino acid concentration of 5-300 mM; the anti-IFNAR 1 monoclonal antibody comprises three heavy chain complementarity determining regions (CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3) and three light chain complementarity determining regions (CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3), wherein: (a) the amino acid sequence of CDR-H1 is shown in SEQ ID NO:1 is shown in the specification; (b) the amino acid sequence of CDR-H2 is shown in SEQ ID NO:2 is shown in the specification; (c) the amino acid sequence of CDR-H3 is shown in SEQ ID NO:3 is shown in the specification; (d) the amino acid sequence of CDR-L1 is shown in SEQ ID NO:4 is shown in the specification; (e) the amino acid sequence of CDR-L2 is shown in SEQ ID NO:5 is shown in the specification; and (f) the amino acid sequence of CDR-L3 is as shown in SEQ ID NO: and 6. The liquid preparation has low viscosity and can be easily injected by a syringe, and thus can be used as an injection, particularly a subcutaneous injection.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种包含抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的液体制剂。
背景技术
生物制剂市场作为一个快速增长的市场，拥有众多的研发管线，同时为患者带来更多创新疗法，针对一些传统化药较难治疗的疾病，生物制剂靶向药物提供了更多的选择。另一方面为了降低生物制剂的临床使用成本，并提高患者的依从性，生物制剂剂型逐渐由冻干剂型向水针剂型转变，由静脉给药方式向皮下注射剂型转变。由于单克隆抗体注射液的给药剂量通常在100mg～600mg范围，而皮下注射药液体积一般限制在2ml以下，在所述情况下，必须制备高度浓缩的蛋白制剂，通常蛋白含量可达到100mg/ml或者更大的浓度。
高浓度的单克隆抗体注射液给生产工艺的可制造、工艺放大、及最终的患者施用带来了许多挑战。最主要的一个挑战是超高的粘度，由于单克隆抗体的生物高分子特性，以及蛋白分子间相互作用力(如疏水、电荷作用等)在高浓度条件时增强，倾向于形成高粘性溶液。在某些极端情况下甚至会形成凝胶状物质，这对超滤膜和超滤设备本身带来不小的挑战，比如最终浓缩时压差的急速上升导致的切向流速减小，浓差极化逐渐失控，直至出现蛋白沉淀将膜堵塞的现象，如此必然会造成回收率降低或工艺失败。另一方面，即使通过改进设备或膜包类型获得最终的高浓度蛋白溶液，也难以将其投入到实际的临床应用中，因为皮下给药时需要使用一次性无菌注射器吸取或者采用预充针的最终包装形式，而过高的粘度将导致装药注射器的滑动性能降低，从而无法手动推注入皮下。超滤浓缩高浓度单克隆抗体药液的另一个难题是在高度浓缩时蛋白样品容易聚集形成可溶性聚体，进一步会聚集形成蛋白沉淀。
因此，针对高浓度的抗人IFNAR1单克隆抗体皮下注射剂的制备，需要开发一种能够有效降低超滤浓缩液的粘度、减少单克隆抗体聚集并提高其稳定性的液体制剂。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种包含抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的液体制剂，所述液体制剂包含蛋白质浓度为100-200mg/ml的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体以及氨基酸浓度为5-300mM的碱性氨基酸，所述的液体制剂能够有效降低超滤浓缩液的粘度、减少抗人IFNAR1单克隆抗体聚集并提高其稳定性，可以用于注射剂，尤其是皮下注射剂。
抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体(QX006N)为自主研发的靶向人I型干扰素素α/β受体1的重组人源化单克隆抗体，阻断包括IFNα、IFNβ和IFN-ω在内的所有I型干扰素的活性，拟用于系统性红斑狼疮(SLE)的治疗，拟采用静脉或皮下注射方式给药。目前国内外尚未有上市的靶向人干扰素α/β受体1(IFNAR1)单克隆抗体药物，阿斯利康开发的Anifrolumab进度最快，目前正在进行3期临床研究，其制剂规格为150mg/1ml，拟给药方式为静脉或皮下注射。体外药效学研究表明QX006N生物学活性与Anifrolumab相当。将该新的抗人I型干扰素素α/β受体1单克隆抗体制备成皮下注射液，则该皮下注射液中的蛋白含量要高达100～150mg/mL。
本发明具体技术方案如下：
1.一种包含抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的液体制剂，所述液体制剂包含蛋白质浓度为100-200mg/ml的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体以及氨基酸浓度为5-300mM的碱性氨基酸；
所述抗IFNAR1单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，其中：
(a)CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(b)CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(c)CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(d)CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(e)CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；且
(f)CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.根据项1所述的液体制剂，其中，所述抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.根据项2所述的液体制剂，其中，所述抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
4.根据项1-3中任一项所述的液体制剂，其中，所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸和脯氨酸中的一种或两种以上。
5.根据项4所述的液体制剂，其中，所述碱性氨基酸包含100-200mM的精氨酸和5-50mM的组氨酸。
6.根据项4所述的液体制剂，其中，所述碱性氨基酸包含100-200mM的赖氨酸和5-50mM的组氨酸。
7.根据项4所述的液体制剂，其中，所述碱性氨基酸包含100-200mM的脯氨酸和5-50mM的组氨酸。
8.根据项1-7中任一项所述的液体制剂，其中，所述液体制剂还包含20-150mg/ml的蔗糖，优选为50-100mg/ml的蔗糖。
9.根据项1-4中任一项所述的液体制剂，其中，所述液体制剂还包含0.5-50mg/ml的山梨醇，优选为1-20mg/ml的山梨醇。
10.根据项1-4中任一项所述的液体制剂，其中，所述液体制剂还包含20-300mg/ml的氯化钠，优选为100-200mg/ml的氯化钠。
11.根据项1-10中任一项所述的液体制剂，其中，所述液体制剂的pH为5.5～6.5。
发明的效果
本发明所述的液体制剂，其包含抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体，并且所述的液体制剂的粘度较低，可用注射器轻松推注，因此可以用作注射剂，尤其是皮下注射剂。
所述的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体，其与现有的抗人干扰素α受体1单克隆抗体(Anifrolumab)相比，结合IFNAR1的亲和力相当，在细胞水平的中和活性与Anifrolumab相当。
所述的单克隆抗体在细胞水平显示出与Anifrolumab(根据专利公开序列表达制备)相当的中和活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。
附图说明
图1是显示构建HZD1203-45瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。其中，M：Marker；条带1：PCR产物362VH-Hu6；条带2：pHZDCH，HindIII/NheI；条带3：PCR产物362VK-Hu20；条带4：pHZDCK，HindIII/BsiWI。
图2是瞬转表达流程图。
图3是QX006N(HZD1203-45-IgG4.1)的电泳检测图。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种包含抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的液体制剂，所述液体制剂包含蛋白质浓度为100-200mg/ml的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体以及氨基酸浓度为5-300mM的碱性氨基酸；
所述抗IFNAR1单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，其中：
(a)CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(b)CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
(c)CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(d)CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如SEQID NO:4所示；
(e)CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如SEQID NO:5所示；且
(f)CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如SEQID NO:6所示。
其中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列如下所示：
SYYMT
SEQ ID NO:2的氨基酸序列如下所示：
VINVYGGTYYASWAKG
SEQ ID NO:3的氨基酸序列如下所示：
EDVAVYMAIDL
SEQ ID NO:4的氨基酸序列如下所示：
QASQSISNQLS
SEQ ID NO:5的氨基酸序列如下所示：
DASSLAS
SEQ ID NO:6的氨基酸序列如下所示：
LGIYGDGADDGIA
例如，蛋白质浓度可以为100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、200mg/ml等；
氨基酸浓度例如可以为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM等。
使用上述所述的特定浓度的碱性氨基酸以及特定浓度的蛋白质，能够使液体制剂的粘度控制在10cP以下，可以用注射器轻松推注，因此，可以用作注射剂，尤其是皮下注射。
所述单克隆抗体表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
所述抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人干扰素α受体1，使得所述单克隆抗体可用作靶向人干扰素α受体1的诊断剂和/或治疗剂。
本发明的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人干扰素α受体1以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体与作为其靶标的人干扰素α受体1的结合能力作为100％的情况下，本发明的抗人干扰素α受体1单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
本发明所述的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体与其他动物种属的干扰素α受体1可以不结合。这里，“其他动物种属”是指除人以外的其他动物种属，例如狨猴、食蟹猴、猪、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体与作为其靶标的人干扰素α受体1的结合能力作为100％的情况下，本发明的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体与其他动物种属的干扰素α受体1的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
本发明所述的抗人干扰素α受体1单克隆抗体具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤40nM的平衡解离常数(KD)。
所述抗人干扰素α受体1(Human Interferon alpha/beta Receptor 1，IFNAR1)表示一种源自人的膜蛋白，其胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中，下划线部分表示信号肽。
SEQ ID NO：9：
MMVVLLGATTLVLVAVAPWVLSAAAGGKNLKSPQKVEVDIIDDNFILRWNRSDESVGNVTFSFDYQKTGMDNWIKLSGCQNITSTKCNFSSLKLNVYEEIKLRIRAEKENTSSWYEVDSFTPFRKAQIGPPEVHLEAEDKAIVIHISPGTKDSVMWALDGLSFTYSLVIWKNSSGVEERIENIYSRHKIYKLSPETTYCLKVKAALLTSWKIGVYSPVHCIKTTVENELPPPENIEVSVQNQNYVLKWDYTYANMTFQVQWLHAFLKRNPGNHLYKWKQIPDCENVKTTQCVFPQNVFQKGIYLLRVQASDGNNTSFWSEEIKFDTEIQAFLLPPVFNIRSLSDSFHIYIGAPKQSGNTPVIQDYPLIYEIIFWENTSNAERKIIEKKTDVTVPNLKPLTVYCVKARAHTMDEKLNKSSVFSDAVCEKTKPGNTSK
在一个实施方案中，所述抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
其中，SEQ ID NO：7的氨基酸序列如下所示：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYYMTWVRQAPGKGLEWVSVINVYGGTYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDVAVYMAIDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：8的氨基酸序列如下所示：
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNQLSWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFSGSRSGTKFTLTISSLQPEDFATYYCLGIYGDGADDGIAFGGGTKVEIK
在一个实施方案中，所述抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
其中，SEQ ID NO：10的氨基酸序列如下所示：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYYMTWVRQAPGKGLEWVSVINVYGGTYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDVAVYMAIDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：11的氨基酸序列如下所示：
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNQLSWYQQKPGKAPKLLIYDASSLASGVPSRFSGSRSGTKFTLTISSLQPEDFATYYCLGIYGDGADDGIAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中，SEQ ID NO：10和11均为经人源化的序列。
在一个实施方案中，所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸和脯氨酸中的一种或两种以上。
对于不同碱性氨基酸的浓度，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述碱性氨基酸包含100-200mM的精氨酸和5-50mM的组氨酸。
例如，所述碱性氨基酸可以包含100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM等的精氨酸和5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM等的组氨酸。
例如，所述碱性氨基酸为20mM的组氨酸和150mM的精氨酸。
使用上述所述的碱性氨基酸的组合物，能够使液体制剂的粘度大大降低，例如，粘度在10cp以下。
在一个实施方案中，其中，所述碱性氨基酸包含100-200mM的赖氨酸和5-50mM的组氨酸。
例如，所述碱性氨基酸可以包含100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM等的赖氨酸和5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM等的组氨酸。
例如，所述碱性氨基酸为20mM的组氨酸和150mM的赖氨酸。
使用上述所述的碱性氨基酸的组合物，能够使液体制剂的粘度大大降低，例如，粘度在10cp以下。
在一个实施方案中，所述碱性氨基酸包含100-200mM的脯氨酸和5-50mM的组氨酸。
使用上述所述的碱性氨基酸的组合物，能够使液体制剂的粘度大大降低，例如，粘度在10cp以下。
例如，所述碱性氨基酸可以包含100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM等的脯氨酸和5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM等的组氨酸。
例如，所述碱性氨基酸为20mM的组氨酸和150mM的脯氨酸。
使用上述所述的碱性氨基酸的组合物，能够使液体制剂的粘度大大降低，例如，粘度在10cp以下。
在一个实施方案中，所述液体制剂还包含20-150mg/ml的蔗糖，优选为50-100mg/ml的蔗糖。
例如，所述液体制剂还可以包含20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml等的蔗糖。
在一个实施方案中，所述液体制剂包含50mg/ml的蔗糖。
在一个实施方案中，所述液体制剂还包含0.5-50mg/ml的山梨醇，优选为1-20mg/ml的山梨醇。
例如，所述液体制剂还可以包含0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml等的山梨醇。
在一个实施方案中，例如，所述液体制剂包含70mg/ml的蔗糖。
在一个实施方案中，所述液体制剂还包含20-300mg/ml的氯化钠，优选为100-200mg/ml的氯化钠。
例如，所述液体制剂还可以包含20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、200mg/ml、250mg/ml、300mg/ml等的氯化钠。
在一个实施方案中，例如，所述液体制剂包含150mg/mL的氯化钠，使用所述的氯化钠与组氨酸组合，能够使液体制剂的粘度控制在10cP以下。
对于液体制剂的pH，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述液体制剂的pH为5.5-6.5。
在一个实施方案中，所述含有抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的液体制剂是通过对表达抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的细胞发酵液进行亲和层析、低pH灭活、阴离子层析、阳离子层析和超滤浓缩，然后将超滤浓缩所得到的浓缩液与缓冲液或添加剂母液进行混合得到。
所述细胞发酵液生产使用的哺乳动物包括但不限于目前使用的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，优选的是CHO细胞。
所述亲和层析采用Protein A进行亲和层析。
在一个实施方案中，所述抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体为IgG4型抗体，阻断包括IFNα、IFNβ和IFN-ω在内的所有I型干扰素的活性，拟用于系统性红斑狼疮(SLE)的治疗，拟采用静脉或皮下注射方式给药。该剂型注射液的蛋白浓度高达150mg/ml。
本发明所述的液体制剂，具有较低的粘度，可用注射器轻松推注，因此适合用作注射剂、特别是皮下注射剂。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1抗人干扰素α受体1单克隆抗体QX006N的制备
从上海近岸科技有限公司采购人干扰素α受体1(IFNAR1)，用于免疫新西兰兔，运用B细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合人IFNAR1并具有人IFNAR1抑制活性的单克隆抗体。首先，用BindingELISA检测细胞上清，挑选出与人IFNAR1结合的克隆；再用HEK Blue IFNα/β报告基因细胞法进行检测，挑选出具有人IFNAR1抑制活性的克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。
先后挑选出37个克隆进行重组表达，并测序。经测定，362#与1203#的细胞中和活性最好，且两个克隆的序列很相似。因此，先对362#进行人源化改造，当筛选获得1203#、且发现1203#的活性更好时，在362#人源化的基础上对1203#克隆进行人源化改造。利用NCBIIgBlast进行人IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择IGHV3-66*01作为重链CDR移植模板，将1203#克隆重链的CDR区(即CDR-H1(SEQ ID No:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQ ID No:3))移植入IGHV3-66*01的骨架区；选择IGKV1-6*01作为轻链CDR移植模板，将1203#克隆轻链的CDR区(即CDR-L1(SEQ IDNo:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5)和CDR-L3(SEQ IDNo:6))移植入IGKV1-6*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，获得本发明的单克隆抗体QX006N可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
上述重链可变区(SEQ ID NO：7)的基因和轻链可变区(SEQ ID NO：8)的基因，以362#人源化抗体的基因序列为模板，利用PCR扩增获得。用HindIII和NheI双酶切重链表达质粒pHZDCH；用HindIII和BsiWI双酶切轻链表达质粒pHZDCK；用Infusion重组酶将PCR扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒pHZDCH-362VH-Hu6和轻链表达质粒pHZDCK-362VK-Hu20。在人源化改造过程中，1203#人源化抗体的基因用362编号，蛋白用1203编号。
通过核酸电泳检测质粒的双酶切结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链可变区和轻链可变区PCR扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，轻链可变区约447bp，重链可变区约471bp。
通过对1203#进行人源化改造，获得人源化抗体HZD1203-45。为了降低抗体的ADCC效应，将HZD1203-45重链表达质粒pHZDCH-362VH-Hu6的人IgG1恒定区换成人IgG4，获得重链表达质粒pHZDCH-362VH-Hu6-IgG4.1。
将序列正确的重链表达质粒pHZDCH-362VH-Hu6-IgG4.1和轻链表达质粒pHZDCK-362VK-Hu20共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×106个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6×106个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。
转染后第4-8天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用SDS-PAGE电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX006N(HZD1203-45-IgG4.1)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和25kDa，与重链(48.9kDa)和轻链(23.4kDa)理论分子量一致。
实施例2平衡解离常数(KD)的测定
用BiacoreT200检测QX006N(HZD1203-45-IgG4.1)与人IFNAR1的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化Protein A芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择Kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及解离平衡常数KD值。
除此之外，将QX006N(HZD1203-45-IgG4.1)与目前已经处于临床III期的针对人IFNAR1的单克隆抗体，即Anifrolumab的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对QX006N进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中Anifrolumab根据专利WO2009100309A2提供的9D4序列，构建表达质粒，瞬转ExpiCHO-S细胞自制获得。
表1抗体结合人IFNAR1的亲和力
样品名称
k<sub>a</sub>(10<sup>5</sup>M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>)
k<sub>d</sub>(10<sup>-5</sup>S<sup>-1</sup>)
K<sub>D</sub>(10<sup>-10</sup>M)
HZD1203-45-IgG4.1
3.47E+05
3.76E-05
1.08E-10
Anifrolumab
1.87E+06
1.24E-04
6.65E-11
表中的数据为：每个样品检测三次，计算平均值的数据。
实施例3 QX006N和Anifrolumab中和人干扰素诱导的HEK Blue IFNα/β细胞STAT1/2磷酸化活性
利用HEK Blue IFNα/β报告基因细胞系测定QX006N拮抗干扰素通过IFNAR1介导的胞内信号分子STAT1/2磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4×104细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO2条件下培养过夜。向细胞中加入抗体浓度范围为0至5μg/ml的系列稀释液，并加入0.2ng/ml的IFNα.2b。然后在37℃和5％CO2条件下培养24小时，收集细胞培养上清加入10％的QUANTI-BlueTM检测试剂在37℃和5％CO2条件下反应1小时，然后检测OD630nm值及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，得到QX006N能够抑制干扰素诱导HEKBlue IFNα/β细胞中STAT1/2磷酸化，QX006N抑制干扰素诱导的HEK Blue IFNα/β细胞中1/2磷酸化活性的IC50为5.23ng/ml，而Anifrolumab抑制干扰素诱导的HEK Blue IFNα/β细胞中1/2磷酸化活性的IC50为4.43ng/ml。
实施例4 QX006N和Anifrolumab中和人干扰素抑制Daudi细胞增殖的活性
利用Daudi人淋巴瘤细胞系测定QX006N拮抗干扰素通过IFNAR1诱导的细胞增殖活性：将培养液中的细胞以每孔4×104细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO2条件下培养过夜。向细胞中加入抗体浓度范围为0至20μg/ml的系列稀释液，并加入0.8ng/ml的IFNα.2b。然后在37℃和5％CO2条件下培养72小时，收集细胞培养物采用CellTiter-Glo检测细胞增殖情况及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，得到QX006N能够抑制干扰素诱导的Daudi细胞增殖，QX006N抑制干扰素诱导的Daudi细胞增殖活性的EC50为29.9ng/ml，而Anifrolumab抑制干扰素诱导的Daudi细胞增殖活性的EC50为31.7ng/ml。
实施例5 QX006N和Anifrolumab中和人干扰素诱导全血释放CXCL10/IP10活性.
利用人全血测定QX006N拮抗干扰素通过IFNAR1诱导的CXCL10/IP10释放活性：将全血按照100μl/孔加入到96孔板中，暂存于37℃和5％CO2条件下，向全血中加入抗体浓度范围为0至40μg/ml的系列稀释液，并加入8ng/ml的IFNα.2b，40ng/ml的TNF-α。然后在37℃和5％CO2条件下培养48小时，收集细胞培养上清采用夹心ELISA法检测上清中CXCL10/IP10的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，得到QX006N能够抑制干扰素诱导的全血释放CXCL10/IP10，QX006N抑制干扰素诱导的全血释放CXCL10/IP10活性的IC50为698ng/ml，而Anifrolumab抑制干扰素诱导的全血释放CXCL10/IP10活性的IC50为562ng/ml。
实施例6包含抗人IFNAR1单克隆抗体和不同碱性氨基酸的液体制剂粘度的比较
使用CHO细胞作为宿主细胞，发酵生产实施例1所述的抗体QX006N，在2L规模的生物反应器上进行发酵，通过离心机或深层膜包过滤获得澄清发酵液，采用Protein A层析进行目的蛋白的捕获，再经过低pH值病毒灭活、阴离子和阳离子层析去除杂质，并进行超滤浓缩得到含有抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体的浓缩液，所得到的浓缩液中含有20mMHis-HCL。
将所得到的浓缩液，采用SEC-HPLC法进行分析，其操作步骤如下：
1.采用高效液相色谱仪(Agilent 1260或等效仪器)、色谱柱(Waters，BEH规格：3.5μm，7.8×300mm；或等效色谱柱)，流动相为PBS缓冲液；
2.拧开四元泵管路，在5ml/min流速条件下100％流动相冲洗管路3分钟，拧紧四元泵开关，接上色谱柱，在1.0ml/min流速条件下100％流动相冲洗色谱柱30min；
3.样品分析方法设置：流速为1.0ml/min，分析时间为15min，进样量为50mg；检测波长为280nm；进样前需先检查系统适应性(使用参考品连续进样，进样次数不少于5次，取后5次结果计算)，然后分析1针空白样品，接着分析样品。
4.按照聚合体、主峰及降解产物等顺序依次积分每个样品的色谱峰，所有与空白样品保留时间不一致的色谱峰均应积分，以面积归一法计算各峰比例，确定该浓缩液中的QX006N单体大于99％，聚体小于1％，基本不含杂蛋白。
采用紫外分光度法测定该浓缩液中QX006N的浓度，测定方法如下：
1.分光光度计波长调至280nm，用空白缓冲液或水作为对照，进行校零。
2.待测用空白缓冲液或水对样品进行稀释，测定样品在280nm的吸光值(吸光值保证在0.5---1.5之间)，并按照之下公式计算样品浓度(QX006N的消光系数为1.469)。
测定该浓缩液中QX006N的浓度为200mg/mL。
采用锐欧森的μVISC粘度计测定该浓缩液的粘度，其操作步骤如下：
1.取一次性专用注射器，抽取200～400微升待检样品，排尽注射器内气泡，并用无尘纸轻擦残留液体；
2.用将注射器安放至管槽中固定，点击仪器主机界面，设置剪切速率，设置完成后，点击“Run”进行检测，记录粘度值，一般多次测量取平均值；
3.对于多个样品的检测，前一个样品完成检测后，取出注射器，排空管内液体，无尘纸轻柔擦拭管口后及可进行下一个样品的吸取测量，测得该浓缩液的粘度为42.1cP。
使用0.2μm滤膜过滤样品后，与表2中不同的缓冲液或添加剂母液混合使得蛋白浓度如表2所示，然后按照上述方法测定粘度值，其结果如表2所示。
表2不同碱性氨基酸母液的加入的粘度结果
一般认为，粘度小于30cP的液体制剂适合用作皮下注射剂，由表2的结果表明，本发明所述的液体制剂，QX006N的皮下注射给药浓度至少可以达到100-180mg/mL或150-180mg/mL。
综上所述，本发明所述的液体制剂粘度较低，所述的液体制剂适合用于注射剂，特别是皮下注射剂，所述的抗人干扰素α受体1(IFNAR1)单克隆抗体，其与现有的抗人干扰素α受体1单克隆抗体(Anifrolumab)相比，结合IFNAR1的亲和力相当，在细胞水平的中和活性与Anifrolumab相当。
所述的单克隆抗体在细胞水平显示出与Anifrolumab(根据专利公开序列表达制备)相当的中和活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 江苏荃信生物医药有限公司
<120> 包含抗人干扰素α受体1（IFNAR1）单克隆抗体的液体制剂
<130> TPE01491
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 1
Ser Tyr Tyr Met Thr
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
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Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 6
Leu Gly Ile Tyr Gly Asp Gly Ala Asp Asp Gly Ile Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
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Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Asn Val Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Glu Asp Val Ala Val Tyr Met Ala Ile Asp Leu Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
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Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Lys Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ile Tyr Gly Asp Gly Ala
85 90 95
Asp Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工合成的
<400> 9
Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala Val
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Ala Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu Lys Ser
20 25 30
Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe Ile Leu Arg
35 40 45
Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr Phe Ser Phe Asp
50 55 60
Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys Leu Ser Gly Cys Gln
65 70 75 80
Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Leu Asn Val
85 90 95
Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser
100 105 110
Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile
115 120 125
Gly Pro Pro Glu Val His Leu Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile
130 135 140
His Ile Ser Pro Gly Thr Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly
145 150 155 160
Leu Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Val Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val
165 170 175
Glu Glu Arg Ile Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu
180 185 190
Ser Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr
195 200 205
Ser Trp Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr
210 215 220
Val Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln
225 230 235 240
Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met Thr
245 250 255
Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro Gly Asn
260 265 270
His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn Val Lys Thr
275 280 285
Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys Gly Ile Tyr Leu
290 295 300
Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr Ser Phe Trp Ser Glu
305 310 315 320
Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala Phe Leu Leu Pro Pro Val
325 330 335
Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala
340 345 350
Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile
355 360 365
Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile
370 375 380
Ile Glu Lys Lys Thr Asp Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr
385 390 395 400
Val Tyr Cys Val Lys Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Lys Leu Asn
405 410 415
Lys Ser Ser Val Phe Ser Asp Ala Val Cys Glu Lys Thr Lys Pro Gly
420 425 430
Asn Thr Ser Lys
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<210> 10
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
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Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Asn Val Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Glu Asp Val Ala Val Tyr Met Ala Ile Asp Leu Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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