阅读说明：本技术 一种难溶性多肽的检测方法 (Detection method of insoluble polypeptide ) 是由 徐红岩 秦敬国 李阳 王国军 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种难溶性多肽的检测方法,主要解决样品溶解性差、检测结果不准的技术问题。本发明先用异丙醇和乙腈溶解样品,然后以注入高效液相色谱法分析仪,以C18键合硅胶为色谱柱填料,采用紫外检测器,选用乙腈、异丙醇和水为流动相,三氟乙酸为离子对试剂,梯度洗脱；检测波长为220 nm；流速为1.0ml/min；进样体积为20μl；柱温为50℃。本方法有效地解决了难溶性多肽的检测问题,能保证有关物质的可控性,提高产品质量。(The invention provides a detection method of insoluble polypeptide, which mainly solves the technical problems of poor solubility and inaccurate detection result of a sample. Dissolving a sample by using isopropanol and acetonitrile, injecting the sample into a high performance liquid chromatography analyzer, using C18 bonded silica gel as a chromatographic column filler, adopting an ultraviolet detector, using the acetonitrile, the isopropanol and water as a mobile phase, using trifluoroacetic acid as an ion pair reagent, and performing gradient elution; the detection wavelength is 220 nm; the flow rate is 1.0 ml/min; the injection volume is 20 mul; the column temperature was 50 ℃. The method effectively solves the problem of detection of the insoluble polypeptide, can ensure the controllability of related substances and improve the product quality.)

一种难溶性多肽的检测方法

技术领域

本发明涉及多肽检测，具体涉及一种难溶性肽的检测方法。

背景技术

多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物都可以成为叫多肽。疏水性多肽指的是富含疏水性氨基酸的多肽。疏水性氨基酸为侧链具有高疏水性的氨基酸之总称氨基酸侧链的疏水性，是从各氨基酸的疏水性减去甘氨酸疏水性之值来表示。如亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸是疏水性的，而赖氨酸、组氨酸、精氨酸是亲水性的。难溶多肽主要是其包含的难溶氨基酸引起的，一般来说，难溶氨基酸占多肽比例超过75％就会造成多肽的难溶。溶解性是研究蛋白质和多肽会遇到比较重要的问题，每个氨基酸都有其固有的化学特性。反相高效液相色谱需要将多肽完全溶解到溶剂中，最适合的常规溶剂为H2O、ACN，这样才能利用反相高效液相色谱进行分析检测，但难溶多肽无法溶解在水/乙腈溶液中，给广大科研人员在该操作带来极***烦。

现有解决难溶多肽的方法是选择优良的有机溶剂(如：DMSO，DMF)去溶解多肽，通过破坏多肽的二级结构助溶，会导致高效液相色谱分离效果大大降低，且对难容肽链的溶解能力有限。

专利CN105001298A是通过合成路线改变，增加亲水基团从而达到溶解的目的。对于纯化有一定帮助，但是并没有解决样品分析检测结果不准确的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种难溶性多肽的检测方法，主要解决样品溶解性差、检测结果不准的技术问题。

本发明的技术方案为：一种难溶性多肽的检测方法，包括以下步骤：

（1）将难溶性多肽粗品溶于溶剂中，超声至完全溶解，过滤待测；

（2）用反相高效液相色谱分析仪进行检测，检测器为紫外；流动相A为质量百分比：94.9%水,5%乙腈,0.1%三氟乙酸，流动相B为质量百分比：94.9%乙腈,5%水,0.1%三氟乙酸，流动相C为质量百分比：94.9%异丙醇,5%乙腈,0.1%三氟乙酸；梯度洗脱;检测波长为220 nm；流速为1 .0ml/min；进样体积为20μl；柱温为50℃。

所述难溶性多肽选自多肽序列为：Pal-VGVAPG、Pal-KTTKS或WILFMVYIIFFW中的一种。

所述步骤（1）溶剂为异丙醇和乙腈。

所述步骤（2）所述反相高效液相色谱分析仪其色谱柱填料为C18键合硅胶，粒径为5μm。

本发明的有益效果是：通过三种不同流动相的配比，有效地解决了难溶多肽的检测问题，能保证有关物质的可控性，提高产品质量。目标峰响应值提高10%，分离度大于1.0，保证检测结果的准确性。

附图说明

图1为Pal-VG-6的粗品分析图。

图2为Pal-KS-5的粗品分析图。

图3为WW-11的粗品分析图。

具体实施方式

实施例1

（1）序列为：Pal-VGVAPG，将多肽粗品溶于异丙醇和乙腈中，超声至完全溶解，过滤待测；

（2）用Waters2695反相高效液相色谱分析仪进行检测，色谱柱填料为Kromaisl C18-5μm，检测器为紫外；流动相A为质量百分比为94.9%水,5%乙腈,0.1%三氟乙酸，流动相B为质量百分比94.9%乙腈,5%水,0.1%三氟乙酸，流动相C为质量百分比94.9%异丙醇,5%乙腈,0.1%三氟乙酸；梯度洗脱，梯度如表1;检测波长为220 nm ；流速为1 .0ml/min；进样体积为20μl；柱温为50℃。分析结果见图1。

表1。

实施例2

（1）序列为：Pal-KTTKS，将多肽粗品溶于异丙醇和乙腈中，超声至完全溶解，过滤待测；

（2）用Waters2695反相高效液相色谱分析仪进行检测，色谱柱填料为Kromaisl C18-5μm，检测器为紫外；流动相A为质量百分比为94.9%水,5%乙腈,0.1%三氟乙酸，流动相B为质量百分比94.9%乙腈,5%水,0.1%三氟乙酸，流动相C为质量百分比94.9%异丙醇,5%乙腈,0.1%三氟乙酸；梯度洗脱，梯度如表2;检测波长为220 nm ；流速为1 .0ml/min；进样体积为20μl；柱温为50℃。分析结果见图2。

表2。

实施例3

（1）序列为：WILFMVYIIFFW，将多肽粗品溶于异丙醇和乙腈中，超声至完全溶解，过滤待测；

（2）用Waters2695反相高效液相色谱分析仪进行检测，色谱柱填料为Kromaisl C18-5μm，检测器为紫外；流动相A为质量百分比为94.9%水,5%乙腈,0.1%三氟乙酸，流动相B为质量百分比94.9%乙腈,5%水,0.1%三氟乙酸，流动相C为质量百分比94.9%异丙醇,5%乙腈,0.1%三氟乙酸；梯度洗脱，梯度如表3;检测波长为220 nm ；流速为1 .0ml/min；进样体积为20μl；柱温为50℃。分析结果见图3。

表3。