阅读说明：本技术 基于多联苯芳烃的多肽缀合物、其制备方法和应用 (Polypeptides conjugate based on polybiphenyl arene, preparation method and application thereof ) 是由 袁行义 李春举 崔雷 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于多联苯芳烃的多肽缀合物、其制备方法和应用,以及该化合物在抗菌方面的应用。该缀合物的结构通式如下：<Image he="657" wi="700" file="DDA0002514546870000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明多联苯芳烃-多肽缀合物,其中多肽部分赋予其阳离子性,亲水性,提供了缀合物和细菌细胞膜的识别位点,促进其与细菌细胞膜结合；多联苯芳烃片段赋予其疏水性,降低缀合物溶血毒性,赋予缀合物良好的生物相容性,缀合物通过破坏细菌细胞膜的完整性,导致细胞内容物外泄,最终诱导细菌死亡。(The invention discloses a polypeptide conjugate based on polybiphenyl arene, a preparation method and application thereof, and application of the compound in the aspect of antibiosis. The structural general formula of the conjugate is as follows: the polybiphenyl arene-polypeptide conjugate has cationic and hydrophilic properties endowed by the polypeptide part, provides a recognition site for the conjugate and bacterial cell membranes, and promotes the combination of the conjugate and the bacterial cell membranes; the polybiphenyl arene segment endows the conjugate with hydrophobicity, reduces hemolytic toxicity of the conjugate, and endows the conjugate with good biocompatibility, and the conjugate causes the leakage of cell contents by destroying the integrity of bacterial cell membranes, and finally induces bacterial death.)

基于多联苯芳烃的多肽缀合物、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽物质、其制备方法和应用，特别是涉及一种抗菌肽类似物、其制备方法和应用，应用于抗菌缀合物及生物医药技术领域。

背景技术

由细菌、病毒、寄生虫等病原微生物引起的感染性疾病严重威胁人类的生命健康。细菌性感染在这些感染性疾病中最为常见，每年都有数百万患者遭受这些威胁生命的细菌性疾病的困扰。虽然我们现有抗生素和抗菌药物能够有效控制与快速治疗细菌感染，但由于我们对其过分使用和依赖，导致细菌对现有的抗生素产生耐药性。尤其是多药耐药菌的出现，使得细菌耐药性问题更难解决。因此迫切需要设计与合成具有新型抗菌机制且不易引起耐药性产生的抗菌药物。

近年来，抗菌肽因具有广谱抗菌活性、快速杀菌效应及特有的抗菌机制引起国内外研究者们的广泛关注。与传统抗生素不同，抗菌肽的阳离子性与两亲性结构特征是其发挥抗菌活性的关键因素。抗菌肽的抗菌活性主要依赖于与细菌细胞膜的相互作用，这一特有的抗菌机制使其具有不易产生耐药性等诸多优势。但是抗菌肽也存在着很多的局限性与不足：潜在的细胞毒性，在生理条件下极其不稳定，对蛋白酶、血浆等极其敏感，以及较高的合成成本。

抗菌肽类似物作为一种继承了抗菌肽的优点并改善了其缺陷的化合物被广泛研究，通常以饱和烷基链作为疏水片段，富含阳离子氨基的多肽作为亲水片段，两者通过化学反应偶联得到的缀合物往往具有较好的血浆或蛋白酶稳定性和广谱的抗菌活性。有文献报道，较饱和烷烃而言，不饱和烷烃作为疏水片段所形成的缀合物往往具有较低的溶血毒性，但现有公开的缀合物的细菌细胞膜结合能力和稳定性还不理想，制造方法比较复杂，成本高，这成为亟待解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于多联苯芳烃的多肽缀合物、其制备方法和应用，本发明的多联苯片段赋予缀合物疏水性，多肽片段赋予缀合物亲水性、阳离子型，该缀合物与细菌细胞膜作用，破坏细菌细胞膜的完整性，导致胞内物质外泄，进而诱导细菌死亡。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于多联苯芳烃的多肽缀合物，包括共价键连接的多联苯芳烃和多肽两部分，所述基于多联苯芳烃的多肽缀合物结构通式为如下式I或式II所示：

上述式I或式II其中n为0、1或2。

一种本发明基于多联苯芳烃的多肽缀合物的制备方法，由炔基修饰的多联苯芳烃和多肽RRR(N₃)，通过click点击化学反应形成基于多联苯芳烃的多肽缀合物，包括以下步骤：

(1)在氮气保护下，将炔基修饰的多联苯芳烃和叠氮修饰的多肽化合物分别加入DMF中，再向溶液中加入六氟磷酸四乙腈铜，常温搅拌2h，混合均匀并发生反应；所述多联苯、多肽、六氟磷酸四乙腈铜的摩尔比为1:(0.9-2.5):0.05；

(2)反应结束后，向反应液中加入无水***，剧烈搅拌，使产物充分析出；后经离心，弃去上层清夜，加入不少于5mL的水将粗产物复溶，经制备型高效液相色谱纯化，得到所述基于多联苯芳烃的多肽缀合物。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(1)中，当所述多联苯、多肽、六氟磷酸四乙腈铜的摩尔比为1:0.9:0.05时，主产物为所述式I缀合物；当所述多联苯、多肽、六氟磷酸四乙腈铜的摩尔比为1:2.5:0.05时，主产物为所述式II缀合物。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(1)中的炔基修饰的多联苯芳烃采用如下方法制备，其步骤如下：

a.在氮气保护下，向烷氧基多联苯芳烃的二氯甲烷溶液中加入三溴化硼溶液，常温搅拌至少12h，将反应液缓慢滴加到冰水中，会有白色固体物质析出，在真空干燥箱中不低于50℃烘干，得到多联苯酚；

b.氮气保护下，向在所述步骤a中制备的多联苯酚的丙酮溶液中加入K₂CO₃，在不低于60℃搅拌回流至少1h后，加入3-溴丙炔溶液，继续搅拌回流至少24h，进行薄层色谱法追踪反应，待反应完成后，将反应液冷却至室温，抽滤除去K₂CO₃，并用丙酮反复冲洗滤饼，合并有机相，减压蒸馏干溶剂，得到目标炔基修饰的多联苯芳烃。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所述烷氧基多联苯芳烃和三溴化硼的摩尔比为1:3。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所述多联苯酚、3-溴丙炔、K₂CO₃的摩尔比为1:3:3。

作为本发明优选的技术方案，本发明所述多联苯芳烃为2,2’-联苯、2,2”-三联苯或2,2”’-四联苯，其结构式如下面的式III所示：

其中，n为0、1或2，其中n为0时代表的是2,2’-联苯，n为1时2,2”-三联苯，n为2时2,2”’-四联苯。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(1)中的叠氮修饰的多肽化合物采用如下方法制备，其步骤如下：

①根据多肽序列RRR(N₃)，合成Arg-Arg-Arg-N₃的序列，采用标准的Fmoc保护策略固相合成法，使用负载量为0.53mmol/g的Rink酰胺树脂作为载体，HBTU/HOBt/DIEA为缩合试剂，从C端向N端逐步合成树脂化合物；

②合成结束后，以至少10mL裂解液，将在所述步骤①中得到的树脂化合物上的多肽进行裂解，在冰浴条件下反应至少30min，然后在常温下继续反应至少150min；再加入至少300mL无水***，充分搅拌析出多肽；然后采用G4沙星漏斗抽滤，用水将多肽洗出，溶液经制备型高效液相色谱纯化，得到目标叠氮修饰的多肽化合物。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤(1)中，所述裂解液由三氟乙酸、间甲酚、苯甲醚和水按照质量比为17:1:1:1的比例配制而成。

作为本发明优选的技术方案，所述多肽序列为RRR(N₃)，R(精氨酸)作为阳离子氨基酸，在水中的pKa值是12-13.7，精氨酸在抗菌肽序列中起着不可获或缺的作用，能够感应细胞膜上的电势并且与细胞膜相互作用，相比于其他两种阳离子氨基酸(赖氨酸与组氨酸)，多聚精氨酸有着更有效的细菌细胞膜结合能力；因此，多聚阳离子精氨酸片段能够赋予缀合物高的生物相容性，提供必要的阳离子性，同时提供了缀合物和细菌细胞膜的识别位点；其结构如下面的IV式：

本发明所述多联苯-多肽缀合物的结构是由炔基修饰的多联苯芳烃和多肽RRR(N₃)，通过click点击化学反应形成稳定的化合物，其结构如下面的式V，VI所示：

其中，n为0、1或2。

一种本发明基于多联苯芳烃的多肽缀合物的应用，所述多联苯芳烃的多肽缀合物通过破坏细菌细胞膜，导致细胞内容物外泄，进而导致细菌死亡，从而利用所述多联苯芳烃的多肽缀合物制备对抗细菌感染的药物。

作为本发明优选的技术方案，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌；所述革兰氏阳性菌为葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌中的至少一种；所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩拉菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌中的至少一种。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明多联苯芳烃-多肽缀合物，其中多肽部分赋予其阳离子性，亲水性，提供了缀合物和细菌细胞膜的识别位点，促进其与细菌细胞膜结合；

2.本发明多联苯芳烃片段赋予其疏水性，降低缀合物溶血毒性，赋予缀合物良好的生物相容性，缀合物通过破坏细菌细胞膜的完整性，导致细胞内容物外泄，最终诱导细菌死亡；

3.本发明方法简单易行，成本低，适合推广使用。

附图说明

图1为本发明实施例一中2,2’-BP-OH的¹H-NMR图谱。

图2为本发明实施例一中2,2’-BP-yn的¹H-NMR图谱。

图3为本发明实施例一中2,2”-TP-OH的¹H-NMR图谱。

图4为本发明实施例一中2,2”-TP-yn的¹H-NMR图谱。

图5为本发明实施例一中2,2”’-QP-OH的¹H-NMR图谱。

图6为本发明实施例一中2,2”’-QP-yn的¹H-NMR图谱。

图7为本发明实施例一中多肽化合物RRR(N₃)的质谱图。

图8为本发明实施例一中缀合物2,2’-BP-1的质谱图。

图9为本发明实施例一中缀合物2,2’-BP-2的质谱图。

图10为本发明实施例一中缀合物2,2”-TP-1的质谱图。

图11为本发明实施例一中缀合物2,2”-TP-2的质谱图。

图12为本发明实施例一中缀合物2,2”’-QP-1的质谱图。

图13为本发明实施例一中缀合物2,2”’-QP-2的质谱图。

图14为本发明实施例三中细胞毒性测试结果。

图15为本发明实施例三中溶血毒性测试结果。

图16为本发明实施例四中2,2”’-QP-1浓度-吸收峰面积标准曲线。

图17为本发明实施例四中阳性对照peixiganan浓度-吸收峰面积标准曲线。

图18为本发明实施例四中2,2”’-QP-1与peixiganan的血浆稳定性测试结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条技术或条件的，按照本领域内文献所描述的常规技术或条件和制造商建议的技术或条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，多联苯-多肽缀合物的合成方法如下：

一种炔基取代多联苯的合成，方法如下：

n＝0,1,2

当n＝0时，对应的化合物1为2,2’-二甲氧基联苯，对应的化合物2命名为2,2’-BP-OH，对应的化合物3命名为2,2’-BP-yn；

当n＝1时，对应的化合物1为2,2”-二甲氧基三联苯，对应的化合物2命名为2,2”-TP-OH，对应的化合物3命名为2,2”-TP-yn；

当n＝2时，对应的化合物1为2,2”’-二甲氧基四联苯，对应的化合物2命名为2,2”’-QP-OH，对应的化合物3命名为2,2”’-QP-yn。

下面关于炔基取代的多联苯芳烃的制备，是以炔基取代的联苯芳烃(n＝0)为例，其他的制备方法与炔基四联苯芳烃相似，具体步骤如下：

合成化合物2(2,2’-BP-OH)氮气保护下，向化合物1(2,2’-二甲氧基联苯，9.35mmol，2g)的二氯甲烷溶液(50mL)中加入三溴化硼溶液(23.38mmol，2.20mL)，常温搅拌12h，将反应液缓慢滴加到400mL冰水中，会有白色固体物质析出，在真空干燥箱中50℃烘干即为目标化合物2(2,2’-BP-OH)。

合成化合物3(2,2’-BP-yn)氮气保护下，向化合物2(2,2’-BP-OH,9.30mmol，1.73g)的丙酮溶液(40mL)中加入K₂CO₃(21.39mmol，2.95g)，60℃搅拌回流1h后，加入3-溴丙炔溶液(21.39mmol，1.67mL)，继续搅拌回流24h，薄层色谱法追踪反应，待反应完成后，将反应液冷却至室温，抽滤除去K₂CO₃，并用丙酮反复冲洗滤饼，合并有机相，减压蒸馏干溶剂得到目标化合物3(2,2’-BP-yn)。

多肽RRRN₃的合成方法如下：

根据多肽序列RRR(N₃)，合成Arg-Arg-Arg-N₃的序列采用标准的Fmoc保护策略固相合成法，使用负载量为0.53mmol/g的Rink酰胺树脂作为载体，HBTU/HOBt/DIEA为缩合试剂，从C端向N端逐步合成。合成结束后，以10ml裂解液(三氟乙酸：间甲酚：苯甲醚：水＝85％:5％:5％:5％)将树脂上的多肽进行裂解，冰浴条件下反应30min，常温下反应150min。后加入300mL无水***，充分搅拌析出多肽，G4沙星漏斗抽滤，用少许水将多肽洗出。溶液经制备型高效液相色谱纯化，得到目标多肽4，质谱测试结果如图7所示。制备型高效液相色谱分离条件，A相：0.1％TFA/水；B相：0.1％TFA/30％乙腈/水；色谱柱：C8柱。

联苯、多联苯多肽缀合物的合成方法如下：

n＝0,1,2

当n＝0时，对应的化合物5命名为2,2’-BP-1，对应的化合物6命名为2,2’-BP-2；

当n＝1时，对应的化合物5命名为2,2”-TP-1，对应的化合物6命名为2,2”-TP-2；

当n＝2时，对应的化合物5命名为2,2”’-QP-1，对应的化合物6命名为2,2”’-QP-2。

一种联苯、多联苯多肽缀合物的制备方法，本实施例是以四联苯多肽缀合物(n＝2)为例，其他的制备方法与联苯多肽缀合物相似，具体步骤如下：

氮气保护下，在4mL DMF溶液中加入化合物3(2,2”’-QP-yn，0.097mmol，40mg)，六氟磷酸四乙腈铜(0.0049mmol，1.81mg)和多肽化合物4(0.087mmol，49.48mg；或0.24mmol，137.98mg)。常温搅拌6h。反应结束后，向反应液中加入约40mL无水***，剧烈搅拌，使产物充分析出。后经离心，弃去上层清夜，加入约5mL的水将粗产物溶解，经制备型高效液相色谱纯化，得到缀合物5(2,2”’-QP-1)和6(2,2”’-QP-2)。制备型高效液相色谱分离条件，A相：0.1％TFA/水；B相：0.1％TFA/70％乙腈/水；色谱柱：C8柱。

备注：当化合物3和多肽化合物4的投料比为1:0.9时，主产物为5；

当化合物3和多肽化合物4的投料比为1:2.5时，主产物为6。参见图1-13。

实施例二：

在本实施例中，缀合物的体外抗菌活性评价如下：

1、试验样品

缀合物由实施例一方法制得。

两种冻干菌种S.aureus(ATCC 25923)，E.coli(ATCC 25922)购自上海复祥生物科技有限公司。

2、试验方法

细菌复苏与培养：将冻存在-20℃的菌种取出，划线接种于固体培养基内，孵育18h(37℃，180r/min)。后用灭菌环挑出2-3个单一菌落置于装有5mL营养肉汤的10mL离心管中，恒温振荡孵育18h(37℃，180r/min)。取出后接种到新鲜肉汤中，培养5h至细菌处于对数生长，用营养肉汤将其调整至0.5麦氏比浊标准，后按1:1000稀释备用。

MIC值的测定：用PBS将缀合物配置1mL浓度为1mM的溶液，以1mM的peixiganan作为阳性对照，PBS作为阴性对照。向96孔板中每个孔中加入100μL营养肉汤，并向第一排中加入样品溶液，100μL/孔，每个样品重复三次，采用二倍稀释法进行稀释，从第一排到最后一排逐一倍稀得到浓度为500-1.8μM的样品。最后向每个孔中加入10μL的菌液，孵育18h(37℃，180r/min)，后用酶标仪测定样品在600nm下的吸收值。样品的MIC值通过OD₆₀₀值计算得到，细菌存活率低于50％的澄清孔所对应的浓度即为样品的MIC值。

备注：MIC值(最低抑菌浓度)表示样品完全抑制细菌生长所需要的最低浓度。

3、实验结果

结果如表1所示，表1为本实施例中缀合物的抗菌活性MIC值表。

表1.缀合物的抗菌活性MIC值表

从表1数据中可以看出，所有的缀合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出良好的抗菌活性，并且随着疏水片段的增长，抗菌活性明显提高，其中2,2”’-QP-1的抗菌效果最佳，与阳性对照peixiganan结果相当。

实施例三：

在本实施例中，缀合物的毒性评价方法如下：

1、实验样品

缀合物由实施例一方法制得。

小鼠成纤维细胞L929由北京协和细胞库提供，人血红细胞由解放军总医院第五医学中心提供。

2、试验方法

细胞培养：L929细胞用DMEM培养基(含有10％FBS,1％青霉素/链霉素)，在5％CO₂，37℃恒温下培养。收集对数期生长的细胞，调整细胞悬液浓度，将细胞悬浮液接种于96孔板，铺板使待测细胞密度至约10000/孔，每孔100μL细胞悬液，在5％CO₂，37℃恒温下孵育24h，待用。

人血红细胞悬液的制备：取4mL肝素抗凝的人血液于10mL离心管中，离心(1000r/min,5min),弃去上层血清，向离心管中加入4mL PBS，吹打均匀，离心(1000r/min,5min)，弃去上层清夜，重复三次。最后，用PBS稀释得到5％的血红细胞悬液，待用。

细胞毒性测试：将96孔板里的培养基吸出，然后加入90μL的培养基和10μL的样品溶液，使得样品混合后浓度分别为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM，每个样品浓度5个平行孔，在最后的5个孔内分加PBS作为空白对照。将培养板放置于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养。24小时后，取出培养板，无菌条件下吸出板中的培养基，每孔加入90μL的PBS和10μL的CCK-8溶液，继续孵育0.5h。在酶标仪490nm处检测各孔的吸收值。

溶血毒性测试：向96孔板中加入90μL 5％血红细胞悬液和10μL的样品溶液，使得样品混合后样品浓度分别为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM，每个样品浓度5个平行孔，以PBS作为空白对照，0.1％Triton X-100作为阳性对照。37℃孵育1h，将96孔板在1800r/min离心5min，后移取50μL上层清夜至另一块96孔板中，在酶标仪405nm处检测各孔的吸收值。

3、实验结果

如图14，15所示，结果表明，所有的样品在40μM浓度下对于L929细胞而言，其细胞存活率在85-100％，对于血红细胞而言，其溶血毒性在3％以下，表明对于正常哺乳动物细胞较为安全。

实施例四：

在本实施例中，缀合物的血浆稳定性测试的方法如下：

1、实验样品

缀合物由实施例一方法制得，以抗菌活性最优的2,2”’-QP-1为代表,阳性对照为抗菌肽peixiganan。

2、试验方法

标准曲线的建立：将缀合物和阳性对照用PBS配置为1mM的溶液，采用二倍稀释法稀释，得到浓度梯度为7.8-1000μM的样品溶液，后取每个浓度梯度的溶液100μL加入300μL新鲜大鼠血浆并迅速移取50μL于装有50μL的淬灭剂(用于终止蛋白/酶解反应，10％三氟乙酸/乙腈溶液)，迅速涡均5s，后在10000r/min离心5min，后经分析液相检测，每次20μL，平行3次，取平均值。将得到的峰进行积分，根据峰面积和相对应的浓度绘制标准曲线。

血浆稳定性实验：1mL的1mM的样品PBS溶液和3mL的新鲜大鼠血浆混合均匀，在恒温孵育箱里孵育(37℃，180r/min)，并在不同的时间点(0min,15min,30min,60min,1h,2h,3h,6h,12h,18h)取50μL于装有50μL的淬灭剂(用于终止蛋白/酶解反应，10％三氟乙酸/乙腈溶液)，迅速涡均5s,后在10000r/min离心5min，后经分析液相检测，每次20μL，平行3次，取平均值。将得到的峰进行积分，根据积分面积在标准曲线对应求的对应的浓度，最后作图。

3、实验结果

如图16、17、18所示，由图16-18可得，缀合物在血浆中的稳定性明显优于阳性对照抗菌肽peixiganan，缀合物2,2”’-QP-1在与血浆孵育18h后仍有约90％的剩余，而阳性对照化合物在与血浆孵育18h后仅有约10％的剩余。由此可得，缀合物明显在血浆中拥有较好的稳定性。

综合上述实施例可知，本发明多联苯芳烃-多肽缀合物，其中多肽部分赋予其阳离子性，亲水性，提供了缀合物和细菌细胞膜的识别位点，促进其与细菌细胞膜结合；多联苯芳烃片段赋予其疏水性，降低缀合物溶血毒性，赋予缀合物良好的生物相容性，缀合物通过破坏细菌细胞膜的完整性，导致细胞内容物外泄，最终诱导细菌死亡。本发明缀合物的细菌细胞膜结合能力和稳定性好，制造方法简单，成本低，该缀合物在抗菌方面的应用前景广泛。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明基于多联苯芳烃的多肽缀合物、其制备方法和应用的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。