一种抑制二肽基肽酶iv的四肽及其应用
阅读说明：本技术 一种抑制二肽基肽酶iv的四肽及其应用 (Tetrapeptide for inhibiting dipeptidyl peptidase IV and application thereof ) 是由 胡松青 叶伟 侯轶 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制二肽基肽酶Ⅳ的四肽及其应用。本发明的多肽包含4个氨基酸残基,分子量为511.27,理论等电点为3.70,其氨基酸序列为：色氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(Trp-Pro-Leu-Pro)。本发明的多肽来源于食用酵母酶解产物,可通过固相合成制备。本发明的多肽具有良好的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性,其IC-(50)值为178.90μmol/L,且与低剂量浓度西格列汀(30％抑制率)具有协同抑制作用,可用于降血糖功能药品的开发与制备,具有良好的应用前景。(The invention discloses a tetrapeptide for inhibiting dipeptidyl peptidase IV and application thereof. The polypeptide comprises 4 amino acid residues, has the molecular weight of 511.27, the theoretical isoelectric point of 3.70 and the amino acid sequence of: tryptophan-proline-leucine-proline (Trp-Pro-Leu-Pro). The polypeptide of the invention is derived from an edible yeast enzymolysis product and can be prepared by solid phase synthesis. The polypeptide of the present invention has good dipeptidyl peptidase IV inhibiting activity, IC thereof 50 Has a value of 178.90 μmol-L and has a synergistic inhibition effect with low-dose sitagliptin (30% inhibition rate), can be used for development and preparation of medicines with the function of reducing blood sugar, and has a good application prospect.)
技术领域
本发明涉及功能食品领域，特别涉及一种抑制二肽基肽酶Ⅳ的四肽及其应用。
背景技术
Ⅱ型糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，可导致微血管和大血管等严重并发症，严重危害患者的身心健康。二肽基肽酶Ⅳ(DPP-IV)由于其肠促肠胰岛素调节作用，日益成为糖尿病治疗的主要靶点。通过抑制DPP-IV活性，改善肠促胰岛素的半衰期，能够达到有效控制血糖的目的。
人工合成的降血糖药物，具有良好的降血糖效果，然而其副作用也不容忽视。如引起低血糖、体重增加、肠道胀气和腹泻等不良反应。因此，研发获得具有良好降血糖效果、毒副作用更低的DPP-IV抑制剂，对于Ⅱ型糖尿病的预防和治疗有着迫切的需求。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有DPP-IV抑制活性的四肽。本发明利用枯草芽孢杆菌发酵酶制剂水解食用酵母，以DPP-IV抑制活性为指标，通过乙醇水溶液萃取和凝胶过滤层析的方法逐级富集高抑制活性组分，富集组分经LC-MS/MS鉴定，筛选得到含有序列为色氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(Trp-Pro-Leu-Pro)的四肽。采用固相合成该四肽，研究发现其对DPP-IV具有良好的抑制活性。
本发明的另一目的在于提供上述具有DPP-IV抑制活性的四肽的应用。
本发明的又一目的在于提供一种DPP-IV抑制剂或降血糖药物。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有DPP-IV抑制活性的四肽，其氨基酸序列为色氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(Trp-Pro-Leu-Pro)。
所述的具有DPP-IV抑制活性的四肽可通过本领域常规技术手段制备得到，例如通过固相合成制备。
上述具有DPP-IV抑制活性的四肽在制备DPP-IV抑制剂或降血糖药物中的应用。
上述具有DPP-IV抑制活性的四肽联合西格列汀在制备DPP-IV抑制剂或降血糖药物中的应用。
所述的应用中，西格列汀以低剂量存在，具体为75～85μmol/L，进一步优选为75～81μmol/L，更进一步优选为81μmol/L。
所述的具有DPP-IV抑制活性的四肽的剂量为25～300μmol/L。
一种DPP-IV抑制剂，含有上述具有DPP-IV抑制活性的四肽。
所述的DPP-IV抑制剂中还含有西格列汀，西格列汀以低剂量存在，具体为75～85μmol/L，进一步优选为81μmol/L。
一种降血糖药物，含有上述具有DPP-IV抑制活性的四肽。
所述的降血糖药物中还含有西格列汀，西格列汀以低剂量存在，具体为75～85μmol/L，进一步优选为81μmol/L。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明的四肽具有良好的DPP-IV抑制活性，其对DPP-IV的半抑制率IC50为178.90μmol/L。
2.本发明的四肽与低剂量浓度西格列汀对DPP-IV活性具有协同抑制作用。
3.本发明方法是一种小分子多肽，结构易于调控，容易合成、修饰、以得到更好的活力，具有明显的应用潜力。
4.本发明的四肽来源于食用酵母的酶解产物，食用酵母被列入FDA发布的“一般认为安全”(GRAS)食品配料，安全性高。
附图说明
图1是凝胶过滤层析分离谱图。
图2是固相合成四肽WPLP色谱图。
图3是固相合成四肽WPLP质谱图。
图4是不同浓度WPLP对DPP-IV的抑制率结果分析图。
图5是多肽WPLP对DPP-IV的Lineweaver-Burk双倒数图。
图6是多肽WPLP和常用降糖药西格列汀的联合抑制作用图。
图7是来源于酵母酶解物的合成多肽DPP-IV抑制活性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例中的枯草芽孢杆菌HU528保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60364，已在中国专利申请CN201810668986.8中公开。
1.酶制剂制备
采用平板划线法取HU528菌种接种于固体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％琼脂)上，在37℃培养箱倒置培养6h，挑单菌落转接于种子培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％蔗糖，0.0001％MgSO4，0.0001％CuSO4，调节pH 7.0)中，然后在37℃，200r/min条件下培养6h(OD600约为1.5)。按1.0％(v/v)将将活化后的菌液接种于5L发酵罐(0.75％葡萄糖，1.5％豆粕粉，0.075％CaCl2，0.045％NaCl)，在装液量70％，发酵温度37℃，通气量4L/min的条件下发酵培养54h后，所得发酵液于4℃、8000×g离心10min后去除菌体，发酵上清液即为酶制剂。
2.酶活力测定
蛋白酶活测定参照国家标准GB/T 23527-2009，采用福林酚法测定。首先用不同浓度的酪氨酸绘制得到酪氨酸标准曲线(y＝0.0077x，R2＝0.999)，样品蛋白酶活的测定具体方法如下所述。发酵液室温离心(8000×g，5min)，所得上清液即为粗酶液。取1mL稀释一定倍数的粗酶液于样品管和空白管中，向样品管加入1mL酪蛋白溶液(2％，w/v)，55℃反应10min，加入2mL 0.4M三氯乙酸终止反应，55℃水浴20min；空白管则先加入2mL 0.4M三氯乙酸，55℃水浴10min使蛋白酶失活，再加入1mL酪蛋白溶液(2％，w/v)，55℃水浴20min。将空白管和实验管室温离心(8000×g，5min)，吸取1mL上清液，加入5mL 0.4M Na2CO3和1mL福林酚试剂，充分混合后在55℃显色20min，以空白管调零于680nm处测定吸光度。测得的OD值通过标准曲线获得相应的酪氨酸浓度，并计算酶活性。酶活力单位定义：在55℃和pH 7.0条件下，1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需酶量，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。测得酶制剂中蛋白酶活力为4200U/mL。
3.酵母源DPP-IV抑制肽的制备、分离与鉴定
在食用酵母粉(来源于广东五洲药业有限公司，干酵母2017年6月)中按8000U/g酵母粉的加酶量添加上述酶制剂，补充无菌水至食用酵母粉与混合液体积比(料液比，w/v)为1:10。调节混合液的pH为8.0。在55℃酶解反应4.5h后，100℃下灭酶10min，离心取上清，将上清液冷冻干燥制成酵母酶解物冻干粉。
向酵母酶解物冻干粉中加入60％(v/v)的乙醇水溶液，搅拌均匀，4℃静置12h后，室温离心(2500×g，20min)，将上清液55℃减压浓缩去除乙醇后冷冻干燥。再将乙醇水溶液萃取得到的冻干粉经过Sephadex Peptide 10/300GL层析柱分离，以超纯水为洗脱液，洗脱流速为0.5mL/min，在214nm检测波长下检测并收集第2个组分F2(图1)。
应用LC-MS/MS鉴定上述F2组分，发现一种序列为色氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(Trp-Pro-Leu-Pro)的四肽，来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae(strain ATCC204508/S288c))乙醇脱氢酶II，蛋白质登录号：P00331。所述小分子四肽的理论等电点为3.70。所述小分子多肽的分子量为511.27g/mol。
实施例2
采用Fmoc固相合成法人工合成制备所述四肽。根据四肽的氨基酸残基组成，以氨基端具有芴甲氧羰酰基(Fmoc-)保护基团的各种氨基酸(Fmoc-Trp、Fmoc-Pro、Fmoc-Leu)为原料，将Fmoc-Pro的羧基以共价键与高分子树脂(Wang树脂)相连；加入20％(v/v)的哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)，反应0.5h脱去氨基保护基Fmoc-；加入过量的Fmoc-Leu，以羟基苯并三唑(HOBT)为缩合剂，在30℃下反应2h，使得Fmoc-Leu的羧基与树脂上Pro的活性氨基缩合；重复脱保护基和缩合反应，依次连接余下的其它氨基酸后，将四肽从树脂上裂解，经C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得该DPP-Ⅳ抑制四肽。通过液相色谱图(图2)分析可知，该法合成的本发明所述小分子多肽，纯度为99.95％。液相色谱-质谱图(图3)证明合成的该多肽序列为色氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(Trp-Pro-Leu-Pro)。
实施例3
在96孔酶标板中，加入25μL样品和50μL浓度为200ng/mL的DPP-Ⅳ酶液(购自sigma公司，货号：D3446)，混合后在37℃下孵育10min，最后加入25μL底物Gly-Pro-AMC(终浓度为0.5mmol/L)，酶标仪在动力学模式下每分钟采集一次荧光读数，测量15-30min(37℃，λex＝360/λem＝460nm)。100mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)代替DPP-Ⅳ酶液作为空白对照，以公认的DPP-Ⅳ抑制三肽Diprotin A(IPI)用作阳性对照，每组实验设3个平行。
对每个孔的数据作“荧光值-时间”的关系图，在图的线性范围内选择两个时间点(T1和T2)及其对应的荧光值(FLU1和FLU2)，由此求出该图像的斜率。DPP-Ⅳ相对抑制率的计算公式如下所示。
式中，T1和T2：图的线性范围内选择的两个时间点；FLU1和FLU2：时间T1和T2所对应的荧光值；SlopeEC：对照组的斜率；SlopeSM：实验组的斜率。
半抑制浓度(IC50)是当DPP-Ⅳ抑制率达到50％时所需样品的浓度。分别配制不同浓度的样品溶液，测定DPP-Ⅳ抑制率，以样品浓度为横坐标，DPP-Ⅳ抑制率为纵坐标，通过非线性曲线进行拟合，并计算出IC50值。
从图4可知，本发明所述的四肽在不同浓度下均对DPP-Ⅳ具有抑制作用，经计算可知其IC50值为178.90μmol/L。本发明小分子多肽具有良好的DPP-Ⅳ抑制活性，可用于降血糖功能药物开发。
实施例4
上述DPP-Ⅳ抑制活性实验中，底物Gly-Pro-AMC分别配置不同浓度梯度：0.0625mmol/L、0.0833mmol/L、0.125mmol/L、0.25mmol/L和0.5mmol/L。测定不同底物浓度下，四肽WPLP在100μmol/L和200μmol/L时对DPP-Ⅳ的抑制率。绘制Lineweaver-Burk双倒数图(图5)，结果显示多肽WPLP对DPP-Ⅳ的抑制类型属于反竞争性抑制。
实施例5
绘制西格列汀和WPLP的浓度-抑制率曲线，得到浓度为81nmol/L(30％抑制率浓度)、124nmol/L(50％抑制率浓度)和196nmol/L(70％抑制率浓度)的西格列汀对应于WPLP的等效剂量(ED)分别为91μmol/L、177μmol/L和319μmol/L。
固定西格列汀的浓度为81nmol/L、124nmol/L和196nmol/L，然后分别与25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L的WPLP复配，测定各复配体系的DPP-IV抑制率。以WPLP浓度为横坐标，复配体系的DPP-IV抑制率为纵坐标，绘制西格列汀和WPLP的联合效应曲线。将联合效应曲线和基础线(抑制多肽WPLP的浓度-抑制率曲线)进行比较，联合效应曲线在基础线上方为协同作用，处于下方为拮抗作用，重合则为相加作用。结果如图6所示，低剂量浓度西格列汀(30％抑制率)与WPLP具有一定的协同作用，而中高剂量浓度西格列汀(50％和70％抑制率)与WPLP的联合抑制作用表现为相加作用。
实施例6
在本发明研究过程中，通过LC-MS/MS从实施例1中F2组分中鉴定了186条多肽。通过固相合成法合成了其中数条多肽，利用实施例3的方法对这些多肽的DPP-IV抑制活性进行研究，所述多肽在0.40mmol/L浓度时DPP-IV抑制活性如图7所示。可以发现，四肽WPLP对DPP-IV的抑制活性最好，显著优于其他多肽，效果突出，由此可见本发明的多肽DPP-IV具有不可预期性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。