阅读说明：本技术 一种水果水分氢氧同位素比值的测定方法和应用 (Method for measuring hydrogen-oxygen isotope ratio of fruit moisture and application thereof ) 是由 李安 潘立刚 靳欣欣 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种水果水分氢氧同位素比值的测定方法和应用,将水果榨汁后获得的果汁样品过固相萃取柱去除杂质,将经净化的水分样品还原为H<Sub>2</Sub>和CO,然后进行氢氧同位素比值的测定。本发明提供的水果水分氢氧同位素分析方法,与现有方法相比,操作简便快速、测定精度和准确度好,且能实现氢氧同位素的同时测定。本发明方法对于推动氢氧同位素技术进行水果产地溯源、果汁掺伪鉴别等领域的更广泛应用具有重要意义。(The invention relates to a method for measuring hydrogen-oxygen isotope ratio of fruit moisture and application thereof, which comprises the steps of removing impurities in a fruit juice sample obtained after fruit juicing through a solid-phase extraction column, and reducing a purified moisture sample into H 2 And CO, and then the determination of the hydrogen-oxygen isotope ratio is performed. Compared with the existing method, the method for analyzing the hydrogen and oxygen isotopes of the fruit moisture provided by the invention is simple, convenient and quick to operate, has good determination precision and accuracy, and can realize simultaneous determination of the hydrogen and oxygen isotopes. The method of the invention is used for promoting the hydrogen-oxygen isotope technology to carry out the fields of fruit producing area tracing, fruit juice adulteration identification and the likeHas important significance for wider application.)

一种水果水分氢氧同位素比值的测定方法和应用

技术领域

本发明涉及稳定同位素分析领域，具体涉及一种水果水分氢氧同位素比值的测定方法和应用。

背景技术

水果水分中的稳定性氢、氧同位素是水果产地溯源、果汁掺伪鉴别的重要依据。水果原汁中的水分稳定性氢氧同位素组成受水果种植区域的海拔、温度、纬度、与海岸距离等地理、气候和环境因素的影响，因此成为产地鉴别的溯源指标；由于水果生长过程的蒸腾作用，水果中水分稳定性重同位素(²H和¹⁸O)比地下水、大气降水等源水水分相对富集，导致水果中水分的氢氧同位素组成与掺杂的外源水分具有明显差异，因此稳定性氢、氧同位素组成是鲜榨果汁与兑水果汁区分的判别依据。

随着氢氧同位素技术应用越来越广泛，其检测方法也不断得到提升和改进。根据文献报道，水果水分稳定性氢、氧同位素比值分析主要有两种，一是将榨汁后样品水分通过蒸馏方式收集后，利用元素分析仪-稳定同位素质谱仪进行测定；二是采用离线平衡或在线平衡法将水汽与外源气体进行平衡交换后，利用稳定同位素质谱仪进行测定。前者的缺点在于，水分蒸馏过程容易导致重同位素与轻同位素分馏，影响了结果的准确性，此外，蒸馏提取需要专门的水分真空抽提装置，且耗时长(通常彻底蒸馏需2h以上)。后者由于操作较自动化，是目前应用较多的方法，但也存在如下缺点：①平衡过程耗时长，如测定氧同位素需平衡6-15h；②由于平衡时间长，样品容易发酵变质，影响了结果的准确性；③测定氢同位素和氧同位素时需分别进行平衡，不能同时处理；④样品基质中的挥发性成分如乙醇等容易与平衡反应气体进行同位素交换，干扰测定结果。

发明内容

为克服现有技术中存在的缺陷和不足，实现操作简便快速、测定精度、准确度好，氢氧同位素的同时测定，本发明提供一种水果水分氢氧同位素比值的测定方法和应用。

本发明一方面在于提供一种水果水分氢氧同位素比值的测定方法，将水果榨汁后获得的果汁样品过固相萃取柱去除杂质，将经净化的水分样品还原为H₂和CO，然后进行氢氧同位素比值的测定。

根据本发明的一些优选实施方式，包括：

步骤1)，净化：将水果榨汁并离心后的果汁样品过固相萃取柱去除杂质；所述固相萃取柱可有效去除糖分等杂质；

步骤2)，过滤：将步骤1)中除杂后的果汁样品过微孔滤膜，得到进一步净化的水分样品；所述微孔滤膜用于滤除颗粒物和细菌等；

步骤3)，测定：将步骤2)中的所述水分样品还原为H₂和CO并分离，然后进行氢氧同位素比值的测定。

根据本发明的一些优选实施方式，还包括：

步骤4)，校正：采用步骤1)-步骤3)的方法对标准水样进行氢氧同位素测定，建立校正曲线，并对步骤3)中的样品测定值进行校正。

根据本发明的一些优选实施方式，步骤1)中，所述固相萃取柱为活性炭固相萃取柱，优选为500mg/6mL活性炭固相萃取柱。

根据本发明的一些优选实施方式，步骤1)中，样品上样量为2～3mL，收集样品体积为0.25～0.5mL优选0.25mL。

根据本发明的一些优选实施方式，步骤2)中，所述微孔滤膜为0.45μm水系滤膜。

根据本发明的一些优选实施方式，步骤3)中，将步骤2)中，采用元素分析仪-稳定同位素比值质谱进行氢氧同位素的同时测定；优选的，仪器测试参数为：氦气载气流速为90～110mL/min优选100mL/min；高温裂解管温度为1350～1410℃优选1380℃；分子筛色谱柱温度为65～85℃优选75℃；进样量为0.1μL。

根据本发明的一些优选实施方式，所述水分样品进入元素分析仪的高温裂解管转化成H₂和CO，在载气的带动下在分子筛色谱柱内分离，并进入稳定同位素比值质谱仪中，不同质荷比的带电离子在磁场作用下分离，并被法拉第杯接收转化成电信号，系统分别计算出氢和氧的同位素比值，图1为仪器采集相关信号后获得的H₂和CO同位素异构体离子质谱图。在质谱仪中优选H₂被离子源电离成质荷比为2和3的同位素异构体离子，CO被离子源电离成质荷比为28，29和30的同位素异构体离子。

根据本发明的一些优选实施方式，步骤4)中所述校正曲线为以标准水样测量值为横坐标、标准水样真实值为纵坐标的线性拟合曲线。

根据本发明的一些优选实施方式，步骤1)中，所述杂质包括有机物，优选所述有机物为糖分、有机酸、色素；和/或，所述离心的条件为：以8000～12000rpm优选10000rpm离心3～10min优选5min。

本发明另一方面在于提供所述的测定方法在水果产地溯源或果汁掺伪鉴别中的应用。

本发明的有益效果至少在于：本发明提供的水果水分氢氧同位素分析方法，与现有方法相比，至少具有以下优势：①操作简便快速，无需进行费时的水分蒸馏提取操作和水汽平衡反应；②前处理过程干扰因素少，测定精度和准确度好；③可实现氢氧同位素的同时测定，进一步节约检测成本。本发明方法对于推动氢氧同位素技术进行水果产地溯源、果汁掺伪鉴别等领域的更广泛应用具有重要意义

附图说明

图1为果汁水分稳定性氢氧同位素比值测定的同位素质谱图。

图2为不同体积流出液中总糖含量变化。

图3为氢氧同位素比值校正曲线(左：氢同位素；右：氧同位素)。

图4为不同产地桃果氢氧同位素比值分布区间。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的实施方式或实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。本发明中，所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中所用的原料均可在国内产品市场方便买到。

根据本发明的一些实施方式，具体包括以下步骤：

(1)离心：将榨汁获取的果汁样品以10000rpm离心5min。

(2)净化：以500mg/6mL的活性碳固相萃取柱为吸附净化柱，吸附果汁中的糖分，取离心后的果汁上清液2～3mL上样，通过注射器加压使样品缓慢通过固相萃取柱，控制流速为0.5～1mL/min，收集初始流出的0.25mL净化后的水分。

(3)过滤：将收集的水分过0.45μm水系微孔滤膜，滤除过固相萃取柱时淋洗下来的颗粒物杂质和细菌，将样品转移至带有内衬管的进样小瓶中，待上机分析。

(4)测定：利用元素分析仪-稳定同位素质谱仪对净化后的水分测定稳定性氢氧同位素比值测定(δ²H和δ¹⁸O)。水分样品进入元素分析仪的高温裂解管后，水分的氢和氧元素分别转化成H₂和CO，转化气体在载气的带动下在分子筛色谱柱内分离，并先后进入稳定同位素比值质谱仪中，在质谱仪中H₂被离子源电离成质荷比为2和3的同位素异构体离子，CO被离子源电离成质荷比为28，29和30的同位素异构体离子，不同质荷比的带电离子在磁场作用下分离，并被法拉第杯接收转化成电信号，系统分别计算出氢和氧的同位素比值。仪器测试参数为：氦气载气流速为100mL/min；高温裂解管温度为1380℃；分子筛色谱柱温度为75℃；进样量为0.1μL。

(5)校正：利用标准水样，对同一批活性炭固相萃取柱，按上述果汁水分净化方法处理及相同的仪器参数分析测定，获得标准水样的稳定同位素比值，并建立校正曲线，对样品的氢氧同位素比值进行校正。

实施例1

本实施例提供的具体实施过程及结果如下：

1)将榨汁获取的桃果汁样品以10000rpm离心5min，取澄清果汁分成5份。

2)分别以规格均为500mg/6mL的活性碳固相萃取柱、硅藻土固相萃取柱、硅胶固相萃取柱、弗罗里固相萃取柱、中性氧化铝固相萃取柱为吸附净化柱，取离心后的果汁上清液2.5mL上样，通过注射器加压使样品缓慢通过固相萃取柱，控制流速为0.5～1mL/min，收集初始流出的0.25mL净化后的水分。

3)将收集的水分过0.45μm水系微孔滤膜，滤除过固相萃取柱时淋洗下来的颗粒物杂质和细菌。

4)利用总糖试剂盒检测果汁去除后的糖分，糖分测定采用二硝基水杨酸法，具体操作为：将果汁中的总糖通过盐酸酸水解转化成还原糖，还原糖在碱性条件下与DNS试剂(二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、无水硫酸钠配制而成)共热后被还原成桔红色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光值，以葡萄糖溶液为标准溶液进行显色反应并测定吸光值后绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品中总糖含量。

5)利用SPSS软件分别对不同固相萃取柱净化后样品与净化前样品的总糖含量进行显著性差异分析，结果如表1所示，硅胶柱净化后与净化前样品的总糖含量没有显著性差异(p>0.05)，硅藻土柱和弗罗里柱净化后与净化前样品的总糖含量具有显著性差异(p<0.05)，氧化铝柱和活性炭柱与净化前样品的总糖含量具有极显著差异(p<0.05)。本实施例主要说明了活性碳固相萃取柱的选择原因。糖分是果汁中除水分以为的主要成分，将糖分尽可能去除可有效减少对水分氢氧同位素测定的干扰，通过比较不同固相萃取柱对水果水分的净化效果(以糖分去除率为评价指标)，来选择净化效果最佳的固相萃取柱。本实施例针对总糖含量具有显著差异的净化后样品，分别计算糖分去除率，结果表明，采用活性炭固相萃取柱对糖分的去除效果最优。

表1不同净化柱类型对果汁糖分去除效果

实施例	净化柱类型	总糖含量(％)	净化前差异比较p值	糖分去除率(％)
					实施例1-1	净化前果汁样品	13.68±1.24	-	-
实施例1-2	硅胶固相萃取柱	13.49±0.76	0.787	-
					实施例1-3	硅藻土固相萃取柱	11.99±1.42	0.032	12.40
实施例1-4	弗罗里固相萃取柱	11.90±0.39	0.026	13.00
					实施例1-5	氧化铝固相萃取柱	11.15±0.28	0.003	18.49
实施例1-6	活性炭固相萃取柱	0.02±0.02	<0.001	99.80

实施例2

本实施例提供的具体实施过程及结果如下：

1)将榨汁获取的桃果汁样品以10000rpm离心5min，得到澄清果汁。

2)以规格为500mg/6mL的活性碳固相萃取柱为吸附净化柱，取离心后的果汁上清液3mL上样，通过注射器加压使样品缓慢通过固相萃取柱，控制流速为0.5-1mL/min，分段收集每次流出的0.25mL净化后的水分，总共收集8段共2mL样品。

3)将收集的水分过0.45μm水系微孔滤膜，滤除过固相萃取柱时淋洗下来的活性炭杂质。

4)利用总糖试剂盒检测果汁去除后的糖分，糖分测定采用二硝基水杨酸法，具体操作为：将果汁中的总糖通过盐酸酸水解转化成还原糖，还原糖在碱性条件下与DNS试剂(二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、无水硫酸钠配制而成)共热后被还原成桔红色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光值，以葡萄糖溶液为标准溶液进行显色反应并测定吸光值后绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品中总糖含量。

5)计算各段累积总糖含量，以流出体积为横坐标，以累积总糖含量为纵坐标，结果如图2所示。本实施例主要说明了收集初始流出的0.25mL净化后样品的选择原因。活性碳固相萃取柱能有效去除糖分，但活性炭填料的吸附能力逐渐达到饱和的过程，其吸附糖分的能力也逐渐减弱，收集的样品中糖分含量也逐渐增加，因此需考察合适的收集体积，保证收集样品中糖分含量尽可能较低。结果表明，随着流出液体积的增加，总糖含量逐渐升高，糖分去除效果越差，因此选择首段0.25mL流出液作为上机样品。

实施例3

本实施例提供的具体实施过程及结果如下：

1)果粉制备：将9份桃汁预冻后，置于真空冷冻干燥机中冷冻48小时，制成果粉，并记录失去水分重量。

2)加水复溶：将3个已知氢氧同位素比值的水样分成3份，分别按同等失水重量加入到对应果粉中，制成果汁样品。

3)离心：将桃汁和苹果汁样品以10000rpm离心5min。

4)净化：以500mg/6mL的活性碳固相萃取柱为吸附净化柱，吸附果汁中的糖分，取离心后的果汁上清液2.5mL上样，通过注射器加压使样品缓慢通过固相萃取柱，控制流速为0.5-1mL/min，收集初始流出的0.25mL净化后的水分。

5)过滤：将收集的水分过0.45μm水系微孔滤膜，滤除过固相萃取柱时淋洗下来的颗粒物杂质和细菌，将样品转移至带有内衬管的进样小瓶中，待上机分析。

6)测定：利用元素分析仪-稳定同位素质谱仪对净化后的水分测定稳定性氢氧同位素比值测定(δ²H和δ¹⁸O)。水分样品进入元素分析仪的高温裂解管后，水分的氢和氧元素分别转化成的H₂和CO，转化气体在载气的带动下在分子筛色谱柱内分离，并先后进入稳定同位素比值质谱仪中，在质谱仪中H₂被离子源电离成质荷比为2和3的同位素异构体离子，CO被离子源电离成质荷比为28，29和30的同位素异构体离子，不同质荷比的带电离子在磁场作用下分离，并被法拉第杯接收转化成电信号，系统分别计算出氢和氧的同位素比值。仪器测试参数为：氦气载气流速为100mL/min；高温裂解管温度为1380℃；分子筛色谱柱温度为75℃；进样量为0.1μL。

7)校正：利用3种标准物质水样即VSMOW2(δ²H＝0‰；δ¹⁸O＝0‰)、USGS45(δ²H_VSMOW＝-10.32‰；δ¹⁸O_VSMOW＝-2.238‰)和USGS47(δ²H_VSMOW＝-150.2‰；δ¹⁸O_VSMOW＝-19.80‰)，对同一批活性炭固相萃取柱，按上述果汁水分净化方法处理及相同的仪器参数分析测定，获得标准水样的稳定同位素比值，以测量值δ²H_M或δ¹⁸O_M为横坐标，以校正值δ²H_T或δ¹⁸O_T为纵坐标，建立校正曲线(如图3所示)，对样品的氢氧同位素比值进行校正，采用单样本t检验法考察采用本发明方法的测定结果与水分真实值是否一致，结果如表2所示。本实施例说明了本方法的可靠性，将已知氢氧同位素比值的水分加入果粉中制成果汁，再采用本发明方法对果汁中水分氢氧同位素比值进行测定，并将测定值与真实值进行差异显著性比较。所有指标检验结果显示，采用本发明方法的氢氧同位素测定结果与水分真实值测定结果均没有显著性差异，说明本发明方法具有可靠性。

表2实施例3的方法验证结果

实施例4

本实施例以桃汁、苹果汁为对象，采用本发明方法对果汁水分的氢氧同位素比值进行测定，具体实施过程为：

1)离心：将桃汁/苹果汁样品以10000rpm离心5min。

2)净化：以500mg/6mL的活性碳固相萃取柱为吸附净化柱，吸附果汁中的糖分，取离心后的果汁。上清液2.5mL上样，通过注射器加压使样品缓慢通过固相萃取柱，控制流速为0.5-1mL/min，收集初始流出的0.25mL净化后的水分。

3)过滤：将收集的水分过0.45μm水系微孔滤膜，滤除过固相萃取柱时淋洗下来的颗粒物杂质和细菌，样品转移至带有内衬管的进样小瓶中，待上机分析。

4)测定：利用元素分析仪-稳定同位素质谱仪对净化后的水分测定稳定性氢氧同位素比值测定(δ²H和δ¹⁸O)。水分样品进入元素分析仪的高温裂解管后，水分的氢和氧元素分别转化成的H₂和CO，转化气体在载气的带动下在分子筛色谱柱内分离，并先后进入稳定同位素比值质谱仪中，在质谱仪中H₂被离子源电离成质荷比为2和3的同位素异构体离子，CO被离子源电离成质荷比为28,29和30的同位素异构体离子，不同质荷比的带电离子在磁场作用下分离，并被法拉第杯接收转化成电信号，系统分别计算出氢和氧的同位素比值。仪器测试参数为：氦气载气流速为100mL/min；高温裂解管温度为1380℃；分子筛色谱柱温度为75℃；进样量为0.1μL。

5)校正：利用3种标准物质水样即VSMOW2(δ²H＝0‰；δ¹⁸O＝0‰)、USGS45(δ²H_VSMOW＝-10.32‰；δ¹⁸O_VSMOW＝-2.238‰和USGS47(δ²H_VSMOW＝-150.2‰；δ¹⁸O_VSMOW＝-19.80‰)，对同一批活性炭固相萃取柱，按上述果汁水分净化方法处理及相同的仪器参数分析测定，获得标准水样的稳定同位素比值，以测量值δ²H_M或δ¹⁸O_M为横坐标，以校正值δ²H_T或δ¹⁸O_T为纵坐标，建立校正曲线，对样品的氢氧同位素比值进行校正，结果如表3所示。

表3桃汁和苹果汁中氢氧同位素比值测定结果

实施例5

本实施例以不同产地的桃样品(辽宁省普兰店市17份、北京市平谷区25份、山东省沂水县24份)为对象，采用本发明方法对桃果水分的氢氧同位素比值进行测定，具体实施过程为：

1)离心：将桃果榨汁后，对果汁样品以10000rpm离心5min。

2)净化：以500mg/6mL的活性碳固相萃取柱为吸附净化柱，吸附果汁中的糖分，取离心后的果汁。上清液2.5mL上样，通过注射器加压使样品缓慢通过固相萃取柱，控制流速为0.5-1mL/min，收集初始流出的0.25mL净化后的水分。

3)过滤：将收集的水分过0.45μm水系微孔滤膜，滤除过固相萃取柱时淋洗下来的颗粒物杂质和细菌，样品转移至带有内衬管的进样小瓶中，待上机分析。

4)测定：利用元素分析仪-稳定同位素质谱仪对净化后的水分测定稳定性氢氧同位素比值测定(δ²H和δ¹⁸O)。水分样品进入元素分析仪的高温裂解管后，水分的氢和氧元素分别转化成的H₂和CO，转化气体在载气的带动下在分子筛色谱柱内分离，并先后进入稳定同位素比值质谱仪中，在质谱仪中H₂被离子源电离成质荷比为2和3的同位素异构体离子，CO被离子源电离成质荷比为28,29和30的同位素异构体离子，不同质荷比的带电离子在磁场作用下分离，并被法拉第杯接收转化成电信号，系统分别计算出氢和氧的同位素比值。仪器测试参数为：氦气载气流速为100mL/min；高温裂解管温度为1380℃；分子筛色谱柱温度为75℃；进样量为0.1μL。

5)校正：利用3种标准物质水样即VSMOW2(δ²H＝0‰；δ¹⁸O＝0‰)、USGS45(δ²H_VSMOW＝-10.32‰；δ¹⁸O_VSMOW＝-2.238‰和USGS47(δ²H_VSMOW＝-150.2‰；δ¹⁸O_VSMOW＝-19.80‰)，对同一批活性炭固相萃取柱，按上述果汁水分净化方法处理及相同的仪器参数分析测定，获得标准水样的稳定同位素比值，以测量值δ²H_M或δ¹⁸O_M为横坐标，以校正值δ²H_T或δ¹⁸O_T为纵坐标，建立校正曲线，对样品的氢氧同位素比值进行校正，测得的3个产地的桃果样品氢氧同位素比值，并建立产地区分的二维散点图，如图4所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。