一种检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的方法
阅读说明：本技术 一种检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的方法 (Method for detecting concentration of abamectin and ceftazidime in blood plasma ) 是由 成晓亮 李美娟 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的方法,属于药物分析技术领域。该方法具体是取预处理的血浆,先利用超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离,再通过质谱得到待测物与其对应同位素内标物的质荷比,利用同位素内标定量法,根据已经建立的校准曲线,即可计算出阿维巴坦和头孢他啶的含量；所述同位素内标物为阿维巴坦-13C5和头孢他啶-d5。本发明的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单,5.0分钟之内完成血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物的分离和检测,可用于临床上血浆中阿维巴坦和头孢他啶的定量分析,为临床上阿维巴坦和头孢他啶浓度监测提供简单快速的检测方法。(The invention discloses a method for detecting the concentration of abamectin and ceftazidime in blood plasma, belonging to the technical field of drug analysis. The method specifically comprises the steps of taking pretreated plasma, separating an object to be detected from a plasma matrix by using ultra-high performance liquid chromatography, obtaining the mass-to-charge ratio of the object to be detected and a corresponding isotope internal standard substance thereof by using mass spectrometry, and calculating the content of abamectin and ceftazidime by using an isotope internal standard quantitative method according to an established calibration curve; the isotope internal standard substance is avibactam-13C 5 and ceftazidime-d 5. The method disclosed by the invention is high in sensitivity, strong in specificity, accurate and simple in pretreatment process, can be used for completing the separation and detection of the abamectin and the ceftazidime in the blood plasma within 5.0 minutes, can be used for clinically quantitatively analyzing the abamectin and the ceftazidime in the blood plasma, and provides a simple and rapid detection method for clinically monitoring the concentration of the abamectin and the ceftazidime.)
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的方法。
背景技术
阿维巴坦(Avibactam，AVT)是非-β-内酰胺β-内酰胺酶抑制剂，研究表明其在临床的相关剂量本身不具有抗菌活性。然而，阿维巴坦可保护β-内酰胺抗生素免受β内酰胺酶的降解，并由此保持β-内酰胺抗生素的抗菌活性。因此，其可与β-内酰胺抗生素联用，用于治疗细菌感染。头孢他啶(Ceftazidime，CTD)属于第三代头孢类抗生素，头孢他啶具有抗菌谱广、耐酶等特点，它对铜绿假单胞菌的抗菌活性强，被广泛用于治疗各种中、重度感染，是治疗感染格兰阴性菌危害患者的首选药物。随着抗菌药物引起的耐药和毒副作用等药物性疾病的不断增加，在使用药物时需要对病人的需要浓度进行监测，从而保证疗效、降低毒副作用、实现个性化给药和治疗。
目前针对阿维巴坦和头孢他啶药物体内浓度检测的方法主要是高效液相色谱法和超高效液相-串联质谱法。文献(梁健成,HPLC法测定微泵给药后头孢他啶血药浓度[J].中国药师,2008,11)公开的检测方法样本量需要大，线性范围较窄，且只针对一种药物进行检测，不适用于临床开展；文献(Henrik Sillén,Determination of avibactam andceftazidimein human plasma samples by LC-MS[J].Bioanalysis.2015；7(12):1423-34)公开的检测方法线性范围较窄，前处理为固相萃取法，前处理方法困难，且成本较高，不利于应用到临床。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的方法：取预处理的血浆，先利用超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，利用同位素内标定量法，通过质谱得到待测物与其对应同位素内标物的质荷比，根据已经建立的校准曲线，即可计算出阿维巴坦和头孢他啶的含量；
所述同位素内标物为阿维巴坦-13C5和头孢他啶-d5；
所述预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液氮气吹干，加入甲醇水溶液复溶，再振荡离心后取上清液进样检测；
所述校准曲线是以标准品与内标物的浓度比为X轴、标准品与内标物的峰面积比为Y轴建立。
所述超高效液相色谱条件如下：
流动相：流动相A为0.01％～0.2％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18；
流速为0.2～0.4mL/min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～5μL；
流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，流动相A和流动相B的初始比例为85～95:25～5，所梯度洗脱过程如下：在0～0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持在85～95:25～5，在0.5～2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85～95:25～5匀速渐变至60:40，在2.5～3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98，在3.0～5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为5.0分钟。
进一步地，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相A和流动相B的初始比例为90:10，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
所述质谱条件如下：
在电喷雾电离正负离子切换检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为ESI+3.0kV、ESI-2.5kV，源温度为150℃，雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h。
进一步地，所述含内标的蛋白沉淀剂是将混合内标溶液加至蛋白沉淀剂后得到；
所述混合内标溶液是用甲醇配制的阿维巴坦-13C5和头孢他啶-d5的混合溶液，阿维巴坦-13C5的浓度为10000ng/mL，头孢他啶-d5的浓度为40000ng/mL；
所述蛋白沉淀剂是甲醇与乙腈混合溶液，甲醇与乙腈体积比为1-2:1。
进一步地，混合内标溶液和蛋白沉淀剂的体积比为1：99。
进一步地，所述预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆中，向其中加入150μL含内标工作的蛋白沉淀剂，振荡3-10min，在12000～15000r/min、10-20℃离心4～10min，取100μL上清，氮气吹干，加入80μL 10％甲醇水溶液复溶，振荡2-5min，12000～15000rpm、10～20℃离心2-5min，取上清进样。
进一步地，所述校准曲线所采用的标准品浓度如下：
阿维巴坦的八个浓度点为依次为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、25000ng/mL；
头孢他啶的八个浓度点为依次为：40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL、20000ng/mL、40000ng/mL、100000ng/mL。
有益效果：
采用本发明的检测方法，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0分钟之内完成血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血浆中阿维巴坦和头孢他啶的定量分析，为临床上阿维巴坦和头孢他啶浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为实施例1中阿维巴坦和头孢他啶标准品的提取离子流谱图。
图2为实施例1血浆中阿维巴坦和头孢他啶的提取离子流谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的方法，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的阿维巴坦和头孢他啶，血浆样本通过预处理后，振荡、离心取上清氮气吹干复溶后进样，先利用超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算阿维巴坦和头孢他啶的含量，
所述阿维巴坦和头孢他啶对应的内标物分别为：阿维巴坦-13C5和头孢他啶-d5。
具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为85～95:25～5；所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持在85～95:25～5；在0.5-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85～95:25～5匀速渐变至60:40；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为5.0分钟；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正负离子切换检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)和2.5kV(ESI-)；源温度为150℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中阿维巴坦和头孢他啶的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5分钟之内完成阿维巴坦和头孢他啶的分离和检测。
在本发明中，流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，在一种优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和0.01％～0.2％甲酸水溶液作为流动相，色谱柱型号为ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强，准确度和精密度基本满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用阿维巴坦-13C5和头孢他啶-d5作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中的阿维巴坦和头孢他啶时的重现性、准确度均较好。
在本发明中，流动相A和流动相B的初始比例为85～95:25～5。在一种优选方案中，流动相A和流动相B的初始比例为90:10。
在一种方案中，流速为0.2～0.4mL/min，优选为0.3mL/min。
在一种方案中，柱温为30～50℃，优选为40℃。
在一种方案中，进样体积为0.2～5μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的阿维巴坦和头孢他啶时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为90:10；所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持在90:10；在0.5-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至60:40；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为5.0分钟；梯度洗脱方式具体见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
表1流动相梯度洗脱参数
时间(min)
流速(mL/min)
％A
％B
Curve
0.0
0.3
90
10
-
0.5
0.3
90
10
6
2.5
0.3
60
40
6
3.0
0.3
2
98
6
5.0
0.3
90
10
1
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正负离子切换检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)和2.5kV(ESI-)；源温度为150℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表3。
表2质谱源参数
项目
参数
喷雾电压(kV)
ESI+(3.0)/ESI-(2.5)
源温度(℃)
150
雾化气温度(℃)
400
雾化气流速(L/h)
800
锥孔气流速(L/h)
150
表3阿维巴坦和头孢他啶检测质谱参数
化合物
母离子
子离子
去簇电压(V)
碰撞电压(V)
ESI(+/-)
AVT
264.1
96.0
42
24
-
AVT-13C5
269.1
96.0
36
24
-
CTD
547.2
167.0
10
45
+
CTD-d5
552.2
396.1
6
16
+
本发明提及的血浆为人或动物的血浆。
本发明提及的经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液氮气吹干，后加入甲醇水溶液复溶，再振荡离心后取上清液上机检测。所述蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈体积比为1～2:1；更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:1。所述甲醇水溶液为1％～50％甲醇水溶液；优选地，甲醇水溶液为10％甲醇水溶液。
在一种优选方案中，本发明提及的经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入150μL含内标工作的蛋白沉淀剂，振荡3～10min，在12000～15000r/min、10～20℃离心4～10min后，取100μL上清，氮气吹干，加入80μL 10％甲醇溶液复溶，振荡2～5min，12000～15000rpm、10～20℃离心2～5min，取上清到进样瓶中，待进样。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为0.1～0.3:19.9～19.7。
在一种更优选方案中，本发明提及的经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入150μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:1),振荡5min，在14000r/min、15℃离心5min后，取100μL上清，氮气吹干，加入80μL 10％甲醇溶液复溶，振荡3min，14000rpm、15℃离心3min，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为0.2:19.8(即1:99)。
以甲醇配制如下同位素内标母液：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)1mg/mL和头孢他啶-d5(CTD-d5)1mg/mL；
分别移取各同位素内标母液：阿维巴坦-13C5 10μL和头孢他啶-d5 25μL；再加入至965μL甲醇中得到1mL混合内标溶液；其中，阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)10000ng/mL，头孢他啶-d5(CTD-d5)40000ng/mL。
取200uL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，上述蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1～2:1。更优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:1。
在一种优选方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇配制如下同位素内标母液：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)1mg/mL和头孢他啶-d5(CTD-d5)1mg/mL。
分别移取各同位素内标母液：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)10μL和头孢他啶-d5(CTD-d5)25μL；再加入至965μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。其中，混合内标溶液中包含：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)10000ng/mL，头孢他啶-d5(CTD-d5)40000ng/mL。
取200μL上述混合内标溶液加入至19.80mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈为1:1)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，含内标的蛋白沉淀剂中包含：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)100ng/mL，头孢他啶-d5(CTD-d5)400ng/mL。
浓度参下表4。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。
表4含内标的蛋白沉淀剂配制
在一种方案中，本发明提及的标准品按照如下方法制备：
将阿维巴坦和头孢他啶配制成如下浓度的标准品母液：阿维巴坦(AVT)10mg/mL和头孢他啶(CTD)10mg/mL；
分别移取各标准品母液：阿维巴坦(AVT)50μL和头孢他啶(CTD)200μL；再加入至750μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：阿维巴坦(AVT)500μg/mL、头孢他啶(CTD)2000μg/mL。
将上述混合标准储备溶液以空白血浆基质配制成八个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的八个浓度点为：
阿维巴坦的八个浓度点为依次为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、25000ng/mL；
头孢他啶的八个浓度点为依次为：40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL、20000ng/mL、40000ng/mL、100000ng/mL。
在一种优选方案中，空白血浆基质为不含目标药物的空白血浆。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
分别移取阿维巴坦(AVT)和头孢他啶(CTD)的标准品母液，再加入至750μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液，浓度参下表5。
表5混合标准品储备溶液
本发明将混合标准品储备液以空白血浆基质(不含目标药物的空白血浆)配制成八个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取50μL第一高值浓度点用75μL空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点；取第六高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第八高值浓度点。
本发明采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存，具体过程如下表6。
表6标曲配制
标曲
移取溶液(μL)
空白血浆基质(μL)
AVT(ng/mL)
CTD(ng/mL)
S8
混合标准储备溶液10
190
25000
100000
S7
S8 50
75
10000
40000
S6
S8 40
160
5000
20000
S5
S7 20
180
1000
4000
S4
S6 20
180
500
2000
S3
S5 20
180
100
400
S2
S4 20
180
50
200
S1
S3 20
180
10
40
八个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入150μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:1)，振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取100μL上清，氮气吹干，加入80μL 10％甲醇水溶液复溶，振荡3min，14000rpm，15℃离心3min，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
本发明还包括制备质控品，其中，质控品为含有阿维巴坦和头孢他啶的空白血浆，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
QC(L)为中浓度质控以空白血浆基质稀释50倍。
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血浆基质稀释500倍。
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血浆基质稀释50倍。
优选地，空白血浆基质为不含目标药物的空白血浆。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准储备溶液以不含目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表7所示。
表7质控品对应浓度(单位:ng/mL)
化合物ID
化合物
QC(L)
QC(M)
QC(H)
1
AVT
20
1000
10000
2
CTD
80
4000
40000
QC(L)中包含：阿维巴坦(AVT)20ng/mL和头孢他啶(CTD)80ng/mL。
QC(M)中包含：阿维巴坦(AVT)1000ng/mL和头孢他啶(CTD)4000ng/mL。
QC(H)中包含：阿维巴坦(AVT)10000ng/mL和头孢他啶(CTD)40000ng/mL。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一、实验材料与仪器
1.材料：样本来自于南京鼓楼医院2020年5月份门诊收集的血浆样本。
2.仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
3.试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)(Waters Corporation)。
4.标准品：标准品及其对应的内标物，见下表8。
表8标准品和内标
序号
中文名称
厂家
1
阿维巴坦
TRC
2
阿维巴坦-13C5
TRC
3
头孢他啶
TRC
4
头孢他啶-d5
TRC
5.质控品：含有阿维巴坦和头孢他啶的空白血浆，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表7所示。
二、液质条件
1.色谱条件：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
2.质谱条件：在电喷雾电离正负离子切换检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)和2.5kV(ESI-)；源温度为150℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表3。
三、实验过程
1.标准品配制
将阿维巴坦和头孢他啶配制成如下浓度的标准品母液：阿维巴坦(AVT)10mg/mL和头孢他啶(CTD)10mg/mL；
分别移取各标准品母液：阿维巴坦(AVT)50μL和头孢他啶(CTD)200μL；再加入至750μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：阿维巴坦(AVT)500μg/mL、头孢他啶(CTD)2000μg/mL。详见表5。
将上述混合标准储备溶液以空白血浆基质(不含目标药物的空白血浆)配制成八个不同浓度点的校准品溶液，详见表6，所述校准品溶液的八个浓度点为：
阿维巴坦的八个浓度点为依次为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、25000ng/mL；
头孢他啶的八个浓度点为依次为：40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL、20000ng/mL、40000ng/mL、100000ng/mL。
2.含内标的蛋白沉淀剂配制
以甲醇配制如下同位素内标母液：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)1mg/mL和头孢他啶-d5(CTD-d5)1mg/mL；
分别移取各同位素内标母液：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)10μL和头孢他啶-d5(CTD-d5)25μL；再加入至965μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。其中，混合内标溶液中包含：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)10000ng/mL，头孢他啶-d5(CTD-d5)40000ng/mL。
取200μL上述混合内标溶液加入至19.80mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈为1:1)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：阿维巴坦-13C5(AVT-13C5)100ng/mL，头孢他啶-d5(CTD-d5)400ng/mL。
3.质控品配制：
取上述混合标准储备溶液以不含目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表7所示。
QC(L)中包含：阿维巴坦(AVT)20ng/mL和头孢他啶(CTD)80ng/mL。
QC(M)中包含：阿维巴坦(AVT)1000ng/mL和头孢他啶(CTD)4000ng/mL。
QC(H)中包含：阿维巴坦(AVT)10000ng/mL和头孢他啶(CTD)40000ng/mL。
4.样品处理
(1)标准品处理：八个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入150μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:1)，振荡5min，在14000r/min、15℃离心5min后，取100μL上清，氮吹，加入80μL 10％甲醇水溶液复溶，振荡3min，14000rpm、15℃离心3min，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
(2)血浆样品前处理：取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入150μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:1，振荡5min，在14000r/min、15℃离心5min后，取100μL上清，氮吹，加入80μL 10％甲醇水溶液复溶，振荡3min，14000rpm、15℃离心3min，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
(3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血浆样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：阿维巴坦和头孢他啶的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为阿维巴坦和头孢他啶标准品提取离子流谱图，图2为血浆中阿维巴坦和头孢他啶提取离子流谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。阿维巴坦和头孢他啶在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。
表9阿维巴坦和头孢他啶线性回归方程及线性相关系数
序号
化合物
保留时间(min)
线性范围(ng/mL)
线性方程
相关系数(r)
1
AVT
1.03
10-25000
Y＝0.00478988X-0.0205083
0.9992
2
CTD
2.18
40-100000
Y＝0.00138681X-0.00993834
0.9998
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血浆样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，阿维巴坦和头孢他啶的加标回收率在105.32％-110.86％之间，5次重复试验的RSD在1.50％-3.00％范围，统计结果见表10。
表10阿维巴坦和头孢他啶添加回收率结果
4.精密度试验：取无干扰空白血浆样本，加入不同浓度阿维巴坦和头孢他啶标准品，得到低、中、高三个浓度血浆样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定阿维巴坦和头孢他啶的浓度，批内精密度为1.34～11.66％，三日内分3批处理，计算批间精密度为3.26～10.86％，结果见表11。
表11批内及批间精密度试验结果
本发明采用ID-UPLC-MS/MS方法测定了人体血浆中的阿维巴坦和头孢他啶的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，阿维巴坦和头孢他啶的加标回收率为105.32％-110.86％之间，5次重复试验的RSD在1.50％-3.00％范围，准确度良好。
方法的重现性结果表明，阿维巴坦和头孢他啶的批内精密度为1.34～11.66％，批间精密度为3.26～10.86％。且建立的血浆样品前处理过程非常简单，血浆用量仅50μL。
总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.0分钟之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆中阿维巴坦和头孢他啶药物浓度的定量分析，为临床上阿维巴坦和头孢他啶药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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