阅读说明：本技术 一种测定氨基酸原料药中痕量糖类杂质的方法 (Method for determining trace carbohydrate impurities in amino acid bulk drug ) 是由 惠人杰 姜峰 薛灵杰 杨荻 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种测定氨基酸原料药中痕量糖类杂质的方法,属于药物分析检测技术领域。本发明采用离子交换树脂处理待测氨基酸原料药样品,吸附氨基酸原料药中糖分,再采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)测定氨基酸原料药中5种糖类杂质,采用极性有机相-水为流动相进行梯度洗脱,极性键合相色谱柱进行分离,以氮气作为辅气,直接进样。经验证,该方法可以使各成分实现基线分离,采用外标法测定氨基酸原料药中5种糖类杂质的含量。本发明方法灵敏度高,操作简便,准确度高,适合同时测定氨基酸原料药中5种糖类杂质的含量。(The invention discloses a method for determining trace carbohydrate impurities in an amino acid raw material medicine, and belongs to the technical field of medicine analysis and detection. The method comprises the steps of treating an amino acid raw material medicine sample to be detected by using ion exchange resin, adsorbing sugar in the amino acid raw material medicine, determining 5 kinds of sugar impurities in the amino acid raw material medicine by using high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection (HPLC-ELSD), performing gradient elution by using a polar organic phase-water as a mobile phase, separating by using a polar bonded phase chromatographic column, and directly injecting samples by using nitrogen as auxiliary gas. The verification proves that the method can realize baseline separation of all components, and the content of 5 kinds of carbohydrate impurities in the amino acid bulk drug is determined by adopting an external standard method. The method has the advantages of high sensitivity, simple and convenient operation and high accuracy, and is suitable for simultaneously determining the content of 5 kinds of carbohydrate impurities in the amino acid raw material medicine.)

一种测定氨基酸原料药中痕量糖类杂质的方法

技术领域

本发明涉及一种测定氨基酸原料药中痕量糖类杂质的方法，属于药物分析检测技术领域。

背景技术

氨基酸(Amino acids)是构成人体内第一营养要素-蛋白质(protein)的基本单位，在人类的生长、繁殖和免疫等方面发挥着重要作用。氨基酸的生产方法主要有提取法、发酵法、化学合成、酶法等方法。传统的提取法、化学合成法和酶法由于前体成本较高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的，目前工业上普遍采用发酵法。糖作为发酵过程中微生物的糖源被引入工艺流程，可能成为氨基酸原料药中的痕量杂质，但因为缺乏高灵敏度的检测手段，目前对于氨基酸原料药中残糖的杂质分析还未见报道。

最常用的糖类分析方法主要是高效液相法，常用检测器为紫外检测器、示差折光检测器和蒸发光散射检测器。糖类物质没有特征紫外吸收特性，需经衍生化带上发色基团后，才能采用紫外检测器检测进行测定，应用紫外检测器测定时操作步骤繁琐。示差折光检测器虽可直接测定糖类物质，但检测器灵敏度低，受温度影响较大，且无法与梯度洗脱相兼容。然而蒸发光散射检测器(ELSD)不受这些局限性的困扰，检测原理是基于粒子引起光散射的通用能力，因此ELSD的响应不受样品特殊性质的影响，弥补了高效液相色谱传统检测器的不足。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测同时检测果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的含量，灵敏度高，重复性好，精密度高；本发明适合氨基酸原料药中的痕量果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖糖类杂质的检测。

本发明的第一个目的是提供一种富集氨基酸原料药中糖分的预处理方法，所述预处理方法为先采用离子交换树脂吸附氨基酸原料药中的氨基酸，再采用超纯水冲洗树脂，采集并浓缩氨基酸原料药中糖分；所述超纯水冲洗体积为100-250mL。

本发明的一种实施方式中，所述氨基酸原料药包括但不限于二十种基本氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，包括但不限于D113型树脂、D001树脂或732强酸苯乙烯阳离子交换树脂。

本发明的一种实施方式中，所述吸附时间为3-5h。

本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂需先采用纯水、酸性溶液和碱性溶液交替处理；酸性溶液选用无机酸水溶液，碱性溶液选用无机碱水溶液。

本发明的一种实施方式中，所述方法包含以下步骤：

(1)以纯水、酸性溶液、碱性溶液交替处理树脂；

(2)以树脂处理氨基酸样品溶液；

(3)过滤，采用超纯水冲洗树脂，收集滤液。

本发明的一种实施方式中，所述超纯水冲洗体积为100-250mL，优选地，冲洗体积为130-200mL。

本发明的第二个目的是提供一种检测氨基酸原料药中糖分的方法，所述方法包括如下步骤：(1)应用上述预处理方法对氨基酸原料药进行预处理；(2)采用高效液相色谱-蒸发光散射检测氨基酸原料药中糖分。

本发明的一种实施方式中，所述糖分包括果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖中的一种或多种。

本发明的一种实施方式中，高效液相色谱条件为：色谱柱为Lichropher氨基柱，规格为4.6mm×100mm，5μm；采用乙腈和水作为洗脱液，梯度洗脱模式。

本发明的一种实施方式中，梯度洗脱条件为：0-3min，10-15％水和85-90％乙腈；3-23min，12-25％水和75-88％乙腈；23-35min，10-15％水和85-90％乙腈。

本发明的一种实施方式中，选用极性键合相柱，以直接进样的方式进样，以蒸发光散射检测器监测，梯度洗脱模式，进行样品测定。

本发明的一种实施方式中，以惰性气体为载气；漂移管温度为40-50℃；增益值为1-8；进样体积：20μL；进样方式：直接进样。

本发明的一种实施方式中，柱温为20-40℃；漂移管温度为30-35℃；增益值为2～6；载气为氮气。

本发明的一种实施方式中，梯度洗脱模式：梯度范围为55～95％，用时20～30min，起始梯度保持3min，终点梯度保持3min。

本发明第三个目的是提供一种上述检测方法在原料药品质监控方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测能够同时检测果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的含量，回收率在87.6％～107％之间，且果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的检测限分别为75.0、66.6、20.8、25.0和34.6mg/kg(S/N＝3)，定量限分别为238.8、212.3、96.2、123.0和125.0mg/kg(S/N＝10)；果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等5种糖峰面积的RSD分别为0.70％、0.76％、0.62％、0.56％、0.43％；本发明方法灵敏度高，重复性好，精密度高，适合氨基酸原料药中的痕量果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖糖类杂质的检测。

附图说明

图1为实施例2中三种树脂对氨基酸的吸附能力和葡萄糖的回收率；其中，A为氨基酸吸附所需平均时长，B为糖的回收率。

图2为实施例2中树脂冲洗选择。

图3为液相色谱图，其中，A为空白溶液液相色谱图，B为实施例3中所测果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖混合标准品溶液色谱图；1：果糖，2：葡萄糖，3：蔗糖，4：麦芽糖，5：乳糖。

图4为实施例4中不同洗脱条件下的液相色谱图；其中，A：等度条件1；B：等度条件2；C：梯度条件1；D：梯度条件2；E：梯度条件3；F：梯度条件4；1：果糖；2：葡萄糖；3：半乳糖；4：蔗糖；5：麦芽糖；6：乳糖。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

1、试验材料：D113型树脂、D001树脂和732强酸苯乙烯阳离子交换树脂(缩写为732阳离子交换树脂)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2、茚三酮法测定氨基酸：

取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定570nm处吸光度值(生成的颜色在60min内稳定)。

实施例1：一种富集氨基酸原料药中糖分的预处理方法

(1)树脂预处理：精密称取732阳离子交换树脂10.0g，置于250ml锥形瓶中，水洗涤至出水无色，用70mL的5％(v/v)HCl过夜处理，水洗至中性；再用等体积的5％(m/v)NaOH过夜处理，水洗至中性；最后用70mL的5％(v/v)HCl过夜处理，再用水洗至中性，备用。

(2)氨基酸样品预处理：取预处理好的树脂1份于250mL锥形瓶中，精密称取氨基酸样品0.20g溶于100mL水中，将溶液加入锥形瓶中，室温下置于磁力搅拌器低速静态吸附，至氨基酸被完全吸附。将溶液过滤，滤液旋蒸至约30mL，然后在-80℃下冻干，将冻干物质用1mL水复溶，备用。

实施例2：预处理条件的选择

(1)树脂种类的选择：

参照实施例1的方法对精氨酸和葡萄糖的混合溶液(混合溶液中精氨酸浓度为2g/mL，葡萄糖的浓度为1mg/mL)进行处理，区别在于，将732阳离子树脂替换成大孔吸附树脂、D113弱酸型阳离子交换树脂和D001型阳离子交换树脂，其他条件同实施例1，利用茚三酮法考察氨基酸的吸附情况，结果见图1。

采用大孔吸附树脂对氨基酸及糖类杂质的吸附性相近，糖回收率过低。由图1可知，D113型树脂对氨基酸的吸附在4.5h内完成，吸附能力较差。D001型树脂能在3h内对氨基酸完成吸附，吸附能力较好，但葡萄糖在树脂上大量附着，回收率只有57.81％。732树脂能在4h内对氨基酸完成吸附，且葡萄糖回收率较高，回收率达77.59％。因此，优选地，选择732阳离子交换树脂对氨基酸样品进行处理。

(2)树脂冲洗体积的选择：

参照实施例1的方法对浓度为1mg/mL的葡萄糖标准溶液进行处理，区别在于，将超纯水体积替换成50、100、150、200和250mL，其他条件同实施例1，结果见图2。

由图2可知，随着冲洗体积的增大，葡萄糖的回收率呈现先增大后减小的趋势，当冲洗体积为150mL时，葡萄糖的回收率达到峰值，因此，优选地，树脂冲洗体积为150mL。

实施例3：一种检测氨基酸原料药中糖分的方法

应用实施例1的预处理方法萃取吸附鸡蛋中的色素，再结合HPLC-ELSD和外标法对鸡蛋中的色素含量进行定量分析，具体步骤如下：

1、建立标准曲线：

(1)配制混合对照品溶液：分别精确称取果糖2.0mg、葡萄糖3.0mg、蔗糖2.3mg、麦芽糖3.0mg、乳糖3.0mg，置于10mL容量瓶中，以水溶解并定容至刻度线，即得混合对照品溶液；

(2)HPLC-ELSD测定：

取混合对照品溶液和空白溶剂水20μL，按照下述色谱条件下进行测定：

色谱柱：选用Lichropher NH2柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温为30℃；流动相为乙腈-水＝75:25(v/v)，洗脱条件见表1；流速为1.0mL/min；漂移管温度为40℃；载气为氮气(压力为350kPa)；增益值为2；进样量为20μL，进样方式：直接进样。

按照上述方法得到的色谱图见图3，由图可知，溶剂对各组分的测定均无影响，专属性良好；且各组分可以得到较好的分离，各峰的理论塔板数均大于50000，各相邻峰均实现完全分离，出峰顺序依次为：果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。

表1梯度洗脱条件

(3)线性试验

配制一系列浓度的混合对照品溶液，精密吸取20μL，在上述色谱条件下进行测定，以各组分的峰面积为纵坐标(y)，以相应质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。回归方程及相关系数结果见表2。

表2五种糖的线性回归方程及相关系数(n＝5)

(4)定量限和检测限测定

采用逐步稀释法稀释对照品储备液，进样20μL，以信噪比S/N＝3计算检测限，以信噪比S/N＝10计算定量限。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的检测限分别为75.0、66.6、20.8、25.0和34.6mg/kg(S/N＝3)，定量限分别为238.8、212.3、96.2、123.0和125.0mg/kg(S/N＝10)。

(5)精密度试验

吸取混合对照品溶液20μL，在上述色谱条件下进行测定，连续测定6次，计算各组分峰面积的RSD值。结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等5种糖峰面积的RSD分别为0.70％、0.76％、0.62％、0.56％、0.43％，表明仪器精密度良好。

2、一种检测氨基酸原料药中糖分的方法

应用实施例1的预处理方法萃取吸附鸡蛋中的色素，再结合HPLC-ELSD和外标法对鸡蛋中的色素含量进行定量分析，具体步骤如下：

(1)配制供试品溶液：称取氨基酸样品0.20g于250mL锥形瓶中，加100mL水溶解后，加入732阳离子交换树脂，室温下静态吸附4h。将溶液过滤，150mL超纯水冲洗树脂，合并滤液。滤液旋蒸至原体积的25％，在-80℃下冻干。将冻干后残留物用1mL水复溶，即得供试品溶液；

(2)HPLC-ELSD测定：取供试品溶液和空白溶剂水20μL，按照下述色谱条件下进行测定：色谱柱：选用Lichropher NH2柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温为30℃；流动相为乙腈-水＝75:25(v/v)，洗脱条件见表1；流速为1.0mL/min；漂移管温度为40℃；载气为氮气(压力为350kPa)；增益值为2；进样量为20μL，进样方式：直接进样。

参照上述标准曲线即可获得待测氨基酸样品中5种糖类杂质的含量。

实施例4：洗脱条件的选择

参照实施例3的方法，区别仅在于，改变洗脱条件，按表3中的几种洗脱条件进行检测优化，其他条件同实施例1，各洗脱条件的分离情况见图4。

表3洗脱条件

液相色谱图如图4所示，当在等度条件1下，即25％水相等度洗脱，5种糖类化合物未达到基线分离。当在等度条件2下，即20％水相等度洗脱，5种糖类化合物的分离情况虽有改善，但色谱峰形及信噪比较差，且二糖组分(化合物4、5、6)响应较低。

基于以上结果，改用梯度洗脱方式进行分离，当以梯度条件1进行洗脱，即25％～15％的水相递减的方式进行梯度洗脱时，单糖组分(化合物1、2)未达到有效分离，且二糖组分响应较低。当分别以梯度条件2、3、4进行洗脱时，5种糖类化合物达到基线分离，峰形较好，且二糖组分响应较高。在三种梯度条件中，梯度条件2下的背景噪音最小，总峰面积最大，且理论塔板数均大于10000。

实施例5：方法的准确性和重复性

(1)加标回收率

取9份已知各残糖杂质含量的原料药精氨酸，加入低、中、高质量混合标准溶液，每个浓度平行3次，进样20μL，记录色谱峰峰面积，依据上述的标准曲线，计算各种糖类化合物的加样回收率。结果见表4。

表4氨基酸中5种残糖加样回收率(n＝9)

(2)重复性试验

制备混合对照品溶液6份，分别精密吸取20μL，在上述色谱条件下进行测定，记录峰面积，计算各组分峰面积的RSD值。结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的峰面积的RSD分别为1.1％、1.4％、2.1％、2.0％、1.3％，表明方法重现性良好。

实施例6：应用上述方法检测氨基酸原料药

取市售的精氨酸样品和醋酸赖氨酸样品，分别按照实施例3的检测方法和条件进行测定，按外标法计算样品中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量。结果表明，两种氨基酸样品中均未检测到果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等5种糖类杂质。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。