阅读说明：本技术 血红蛋白类物质的检测方法及其检测设备 (Method and equipment for detecting hemoglobin substances ) 是由 徐岩 刘先成 曾映 胡明龙 胡文雍 张波 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种血红蛋白类物质的检测方法及其检测设备。该血红蛋白类物质的检测方法包括如下步骤：对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测,得到待测样品的检测信号,流动相包括丁二酸盐,流动相的pH值为4~8；对检测信号进行分析,以判断待测样品中是否含有血红蛋白类物质,血红蛋白类物质包括血红蛋白变异体,血红蛋白变异体包括Hb New York。上述血红蛋白类物质的检测方法能够有效地检测Hb New York,有利于避免Hb New York的血红蛋白类物质的检测结果的干扰,解决了人们一直渴望解决但始终未能获得成功的技术难题。(The invention relates to a detection method and detection equipment for hemoglobin substances. The detection method of the hemoglobin substances comprises the following steps: carrying out cation exchange liquid chromatography detection on a sample to be detected to obtain a detection signal of the sample to be detected, wherein a mobile phase comprises succinate, and the pH value of the mobile phase is 4-8; and analyzing the detection signal to judge whether the sample to be detected contains hemoglobin substances, wherein the hemoglobin substances comprise hemoglobin variants, and the hemoglobin variants comprise Hb New York. The method for detecting the hemoglobin substances can effectively detect the Hb New York, is beneficial to avoiding the interference of the detection result of the hemoglobin substances of the Hb New York, and solves the technical problem that people are eagerly to solve but can not succeed all the time.)

血红蛋白类物质的检测方法及其检测设备

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别是涉及一种血红蛋白类物质的检测方法及其检测设备。

背景技术

血红蛋白（Hemoglobin，Hb）是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是使血液呈红色的蛋白，由珠蛋白和血红素组成。血红蛋白由HbA（血红蛋白A）、HbA2（血红蛋白A2）和HbF（血红蛋白F）组成。其中，HbA主要存在于成人体内，其珠蛋白肽链由两个α链和两个β链构成。HbA分为HbA0和HbA1两种，HbA0为未被糖基化HbA，而HbA1为糖基化HbA。HbA2珠蛋白亚基的多肽连由两条α链和两条δ链过程。HbF主要存在于胎儿期，其珠蛋白肽链包括两条α链和两条γ链。

血红蛋白变异体是由血红蛋白中珠蛋白发生基因突变而导致其肽链的单个或多个氨基酸替代或缺失，导致珠蛋白分子结构改变而生成的一种物质。目前，已经发现超过1173种血红蛋白变异体。其中，Hb New York是珠蛋白β链异常血红蛋白，是珠蛋白β链第113位的Val（缬氨酸）被Glu（谷氨酸）替代所形成的异常血红蛋白。

一般地，检测血红蛋白的方法包括毛细管电泳法和液相色谱法。毛细管电泳法具有良好的精密度和正确度，不受常见血红蛋白变异体的干扰。毛细管电泳法的自动化程度地，检测速度慢，不利于快速检测。液相色谱法的自动化程度高，检测速度快，能够用于血红蛋白的快速检测。然而，由于血红蛋白变异体与血红蛋白的等电点较为接近，采用液相色谱法进行检测时容易受到血红蛋白变异体的干扰而影响检测结果的准确性。尤其是Hb NewYork与血红蛋白的等电点和电荷量均较为接近，非常影响液相色谱法的检测结果准确性。然后，现有的液相色谱法因为其分离度还无法达到有效检测Hb New York的水平，因此难以识别出Hb New York，避免其对检测结果的干扰。如何能够通过液相色谱法检测出Hb NewYork以便于避免Hb New York对检测结果的干扰，成为本技术领域内的技术难题，一直未能被攻克。

发明内容

基于此，有必要提供一种分离度较高的血红蛋白类物质的检测方法。该检测方法能够有效检测Hb New York。

一种血红蛋白类物质的检测方法，包括如下步骤：

对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测，得到所述待测样品的检测信号，其中，流动相包括丁二酸盐，所述流动相的pH值为4~8；及

对所述检测信号进行分析，以判断所述待测样品中是否含有血红蛋白类物质，所述血红蛋白类物质包括血红蛋白变异体，所述血红蛋白变异体包括Hb New York。

研究发现，Hb New York与HbA0的等电点和电荷量均非常接近，非常难以检测和分离Hb New York。目前，全球范围内尚无报道通过液相色谱法能够有效检测Hb New York。而本研究经过大量的研究，创造性地发现，以pH值为4~8的含有丁二酸盐的溶液作为流动相，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测，不仅能够提高Hb New York与HbA0的分离度，而且能够有效地检测出Hb New York，有利于避免Hb New York对血红蛋白类物质的检测结果的干扰，解决了人们一直渴望解决但始终未能获得成功的技术难题。经试验验证，采用上述血红蛋白类物质的检测方法对待测样品进行检测，Hb New York与HbA0的分离度大于80%，对Hb New York与HbA0分离度较高，能够有效地检测Hb New York。

在其中一个实施例中，所述血红蛋白变异体还包括HbE、HbD、HbS、HbC、HbJ-Bangkok、Hb G-Taipei及Hb Q-Thailand中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述血红蛋白类物质还包括糖化血红蛋白、非糖化血红蛋白及血红蛋白降解物中的至少一种，所述糖化血红蛋白包括HbA1a、HbA1b、HbA1c及LA1c中的至少一种，所述非糖化血红蛋白包括HbA0、HbA2及HbF中的至少一种，所述血红蛋白降解物包括P3及P4中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述流动相中所述丁二酸盐的浓度为30mmol/L~900mmol/L。

在其中一个实施例中，所述丁二酸盐选自丁二酸钠或者丁二酸钾中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，洗脱方式为三相等度洗脱，所述流动相包括第一相、第二相及第三相，所述第一相包括30mmol/L~60mmol/L的所述丁二酸盐，所述第二相包括80mmol/L~120mmol/L的所述丁二酸盐，所述第三相包括150mmol/L~900mmol/L的所述丁二酸盐。

在其中一个实施例中，所述第一相的pH值为5.2~5.5。

在其中一个实施例中，所述第二相的pH值为5.2~5.5。

在其中一个实施例中，所述第三相的pH值为5.2~5.5。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，洗脱的步骤包括：0min~1.5min采用所述第一相进行洗脱，1.5min~3.2min采用所述第二相进行洗脱，3.2min~5.0min采用所述第三相进行洗脱。

在其中一个实施例中，所述洗脱的步骤还包括如下步骤：5min~6min采用所述第一相进行洗脱。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，色谱柱的填料粒径为3μm~6μm。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，色谱柱的柱压在4MPa以上。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，色谱柱包括外壳，所述外壳的材料包括不锈钢或聚醚醚酮中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，所述色谱柱的内径为4.0mm~4.6mm，所述色谱柱的柱长为20mm~50mm。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，流速为0.5mL/min~6.0mL/min。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，柱温为25℃~40℃。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，进样量为1μL~100μL。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，检测波长为200nm~500nm。

在其中一个实施例中，所述对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤之前，还包括如下步骤：采用稀释液对所述待测样品进行稀释。

此外，本研究还提供一种血红蛋白类物质的检测设备，包括：

检测模块，能够以pH为4~8的含有丁二酸盐的溶液为流动相对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测，得到所述待测样品的检测信号；

分析模块，能够对所述检测信号进行分析，以判断所述待测样品中是否含有血红蛋白类物质，所述血红蛋白类物质包括血红蛋白变异体，所述血红蛋白变异体包括Hb NewYork。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。

图1为实施例1的待测样品的液相色谱图；

图2为实施例2的待测样品的液相色谱图；

图3为实施例3的待测样品的液相色谱图；

图4为缩小纵坐标的最大值后绘制得到实施例3的待测样品的的液相色谱图；

图5为实施例4中四个不同待测样品的液相色谱图；

图6为实施例5中待测样品的液相色谱图；

图7为实施例6中待测样品的液相色谱图；

图8为实施例7中待测样品的液相色谱图；

图9为实施例8中待测样品的液相色谱图；

图10为实施例9中待测样品的液相色谱图；

图11为实施例10中待测样品的液相色谱图；

图12为实施例11中待测样品的液相色谱图；

图13为对比例1中待测样品的液相色谱图；

图14为对比例2中待测样品的液相色谱图；

图15为对比例3中待测样品的液相色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。需要说明的是，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

如无特别说明，以下内容中，Hb New York（New York Variant Hemoglobin）是珠蛋白β链异常血红蛋白，是珠蛋白β链第113位的Val（缬氨酸）被Glu（谷氨酸）替代所形成的异常血红蛋白。

HbE（HbE Variant Hemoglobin）是珠蛋白β链第26位的Glu（谷氨酸）被Lys（赖氨酸）替代所形成的异常血红蛋白。HbE是珠蛋白β链异常血红蛋白中最常见的一种。HbE主要分布在东南亚国家。在我国，HbE主要存在于长江以南及沿海地区。

HbS（HbS Variant Hemoglobin）是珠蛋白β链第6位的Glu（谷氨酸）被Val（缬氨酸）替代所形成的异常血红蛋白。纯合子HbS称为镰刀细胞病，HbS最常见于北非及北美。

HbC（HbC Variant Hemoglobin）是珠蛋白β链第6位的Glu（谷氨酸）被Lys（赖氨酸）替代所形成的异常血红蛋白，主要分布于西非。

HbD（HbD Variant Hemoglobin）分布于印度西北部及南北美洲。其中，印度Panjab地区及印第安人携带HbD的人居多。

HbJ-Bangkok（J-Bangkok Variant Hemoglobin）是珠蛋白β链第56位Gly（甘氨酸）被Asp（天冬氨酸）替代所形成的异常血红蛋白，在我国南方地区高发。

Hb G-Taipei（G-Taipei Variant Hemoglobin）是珠蛋白β链第22位Glu（谷氨酸）被Gly（甘氨酸）取代所形成的异常血红蛋白，在我国北方地区高发。

Hb Q-Thailand（Q-Thailand Variant Hemoglobin）是珠蛋白α链第74位Asp（天冬氨酸）被His（组氨酸）取代所形成的异常血红蛋白，在我国北方地区高发。

HbA1a（Hemoglobin-A1a）是乳糖化血红蛋白。HbA1b（Hemoglobin-A1b）是果糖化血红蛋白。HbA1c（Stable Glycated Hemoglobin）是稳定的糖化血红蛋白，HbA1c的含量能够表征过去2~3个月的平均血糖水平。LA1c（Labile Glycated Hemoglobin）是不稳定的糖化血红蛋白，糖化过程中间产物Schiff碱可降解为葡萄糖和血红蛋白。

HbA0（Non-glycated Hemoglobin）是未糖化的血红蛋白，其含量占正常人的80%以上。HbF（Fetal Hemoglobin）是胎儿血红蛋白。HbA2（A2 Hemoglobin）即血红蛋白HbA2，其含量增多主要见于轻型β珠蛋白生成障碍性贫血，是β地贫因子。

P3（Peak3）和P4（Peak4）是血红蛋白HbA0的降解峰，通常含量小于5%。如果血液样品不新鲜或出现其他变异血红蛋白，P3和P4含量将增加。

一实施方式的血红蛋白类物质的检测方法能够有效检测Hb New York，能够用于对血红蛋白类物质的非疾病的诊断和治疗目的的检测和分析。其中，血红蛋白类物质包括血红蛋白变异体。血红蛋白变异体包括Hb New York。

在其中一个实施例中，血红蛋白变异体还包括HbE、HbD、HbS、HbC、HbJ-Bangkok、HbG-Taipei及Hb Q-Thailand中的至少一种。进一步地，血红蛋白类物质还包括糖化血红蛋白、非糖化血红蛋白及血红蛋白降解物中的至少一种。糖化血红蛋白包括HbA1a、HbA1b、HbA1c及LA1c中的至少一种。非糖化血红蛋白包括HbA0、HbA2及HbF中的至少一种。血红蛋白降解物包括P3及P4中的至少一种。

具体地，血红蛋白类物质的检测方法包括如下步骤S110~S120：

S110、对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测，得到待测样品的检测信号，其中，流动相包括丁二酸盐，流动相的pH值为4~8。

研究发现，Hb New York与HbA0的等电点和电荷量均非常接近，非常难以检测和分离Hb New York。目前，主要采用氯化物作为洗脱液进行洗脱。然而，氯化物无法洗脱和分离Hb New York等血红蛋白变异体。全球范围内尚无报道通过液相色谱法能够有效检测HbNew York。而本研究经过大量的研究，预料不到地发现，以pH值为4~8的含有丁二酸盐的溶液作为流动相，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测，不仅能够提高Hb New York与HbA0的分离度，而且能够有效地检测Hb New York，有利于避免Hb New York的血红蛋白类物质的检测结果的干扰，解决了人们一直渴望解决但始终未能获得成功的技术难题。

在其中一个实施例中，丁二酸盐为丁二酸钠或者丁二酸钾。此两种丁二酸盐的原料易于获得，有利于检测和分离各类血红蛋白类物质，尤其是检测和分离Hb New York。需要说明的是，丁二酸盐不限于上述指出的丁二酸盐，也可以为本领域中其他的丁二酸盐。

在其中一个实施例中，流动相中丁二酸盐的浓度为30mmol/L~900mmol/L。研究发现，丁二酸盐的浓度小于30mmol/L时，无法起到洗脱效果，因而无法将血红蛋白类物质分离；丁二酸盐的浓度超过900mmol/L，则可能存在盐类析出，影响管路的液体流速及洗脱过程。通过将流动相中丁二酸盐的浓度设置为30mmol/L~900mmol/L，有利于检测和分离各类血红蛋白类物质，尤其是检测和分离Hb New York。

进一步地，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，洗脱方式为三相等度洗脱。流动相包括第一相、第二相及第三相。第一相包括30mmol/L~60mmol/L的丁二酸盐。第二相包括80mmol/L~120mmol/L的丁二酸盐。第三相包括150mmol/L~900mmol/L的丁二酸盐。

其中，第一相的pH值为5.2~5.5。此种设置使得各类血红蛋白类物质之间具有较高的分离度，峰型较好，检测结果准确性高。

第二相的pH值为5.2~5.5。此种设置使得各类血红蛋白类物质之间具有较高的分离度，峰型较好，检测结果准确性高。

第三相的pH值为5.2~5.5。此种设置使得各类血红蛋白类物质之间具有较高的分离度，峰型较好，检测结果准确性高。

进一步地，第一相为pH值为5.2~5.5、30mmol/L~60mmol/L的丁二酸盐的水溶液。第二相为pH值为5.2~5.5、80mmol/L~120mmol/L的丁二酸盐的水溶液。第三相为pH值为5.2~5.5、150mmol/L~900mmol/L的丁二酸盐的水溶液。此种设置能够提高对各类血红蛋白类物质的分离度，尤其是提高Hb New York与HbA0的分离度，有利于分离和检测各类血红蛋白类物质。

在其中一个实施例中，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，洗脱的步骤包括：0min~1.5min采用第一相进行洗脱，1.5min~3.2min采用第二相进行洗脱，3.2min~5.0min采用第三相进行洗脱。此种设置有利于检测和分离Hb New York、HbA1c、HbJ-Bangkok、Hb E、Hb G-Taipei等各类血红蛋白类物质。需要说明的是，“0min~1.5min采用第一相进行洗脱”表示从洗脱开始（即0min）到洗脱至1.5min的过程中以第一相为流动相进行洗脱。以此类推。

进一步地，洗脱的步骤还包括如下步骤：5min~6min采用第一相进行洗脱。此种设置有利于分离Hb Q-Thailand等各类血红蛋白类物质。

上述洗脱步骤的时间控制有利于洗脱和分离各类变异血红蛋白，提高检测的分辨率及抗干扰性，尤其能够使Hb New York变异血红蛋白较为彻底地洗脱。

需要说明的是，洗脱方式不限于为三相等度洗脱，也可以为其他洗脱方式，例如可以为两相梯度洗脱、四相等度洗脱或者四相梯度洗脱等。

在一个具体示例中，Hb E的出峰时间为230.7秒±0.30秒。Hb New York的出峰时间为118.8秒±0.30秒。Hb G-Taipei的出峰时间为226.8秒±0.50秒。Hb J-Bangkok的出峰时间为105.0秒±0.30秒。Hb Q-Thailand的出峰时间为300.1秒±0.30秒。

其中，色谱柱的填料粒径为3μm~6μm。研究发现，填料粒径低于3μm时，色谱柱的压力可能大于20MPa，普通的管路容易出现漏液情况。填料粒径大于6μm时，可能导致色谱柱的柱效和分辨率下降，血红蛋白类物质分离不彻底，部分关键性的变异血红蛋白例如Hb NewYork将无法分离。上述将色谱柱的填料粒径设置为3μm~6μm，有利于分离各类血红蛋白类物质。需要说明的是，上述填料粒径均至填料的平均粒径。

进一步地，填料上键合有阳离子交换基团。阳离子交换基团用于血红蛋白类物质的吸附和分离。更进一步地，阳离子交换基团包括磺酸基及羧基中的至少一种。

色谱柱的柱压在4MPa以上。此种设置有利于提高色谱柱的柱效、分离度及分辨力，有利于分离和检测各类血红蛋白类物质，尤其是有利于Hb New York的分离和检测。进一步地，色谱柱的柱压为4MPa~20MPa。此种设置不仅有利于各类血红蛋白类物质的分离和检测，还能够降低检测管路的漏液几率。

色谱柱包括外壳。外壳的材料包括不锈钢或聚醚醚酮中的至少一种。上述两种材料具有较高的绝缘稳定性、耐水解、抗压、耐腐蚀等特性，并且均不会与血红蛋白及微球进行反应，有利于保证各类血红蛋白类物质的分离和检测。进一步地，外壳包括柱管和末端接头。柱管和末端接头的材料均包括不锈钢或聚醚醚酮中的至少一种。

色谱柱的内径为4.0mm~4.6mm。色谱柱的柱长为20mm~50mm。

色谱柱为深圳普门科技股份有限公司自主生产的SX型阳离子交换色谱柱。

在其中一个实施例中，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，流速为0.5mL/min~6.0mL/min。当流速低于0.5mL/min时，测试总时间将会远远大于6分钟，难以满足市场的需求；当流速高于6.0mL/min时，压力将会超过20MPa，管路极易出现漏液情况。进一步地，流速为1.5mL/min~3.0mL/min。

在其中一个实施例中，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，柱温为25℃~40℃。研究发现，当柱温低于25℃时，仪器在高温高湿环境可能出现较严重的冷凝水，影响比色模组的正常测试；当柱温高于40℃时，仪器在低温环境（低于10℃）下可能出现开机后需要等待较长时间（大于半小时）才能恢复的情况。通过将柱温控制在25℃~40℃，能够保证检测设备的正常运行，有利于保证血红蛋白类物质的分离和检测。

在其中一个实施例中，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，进样量为1μL~100μL。当进样量低于1uL时，出峰总面积将远远低于仪器的灵敏度低限，系统难以识别出各种血红蛋白类物质的峰，同时重复性也会变得非常差；当进样量大于100uL时，出峰总面积将大于仪器的最高限制，分离度变差，色谱柱残留严重，寿命变短。进一步地，进样量为1μL~10μL。

在其中一个实施例中，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤中，检测波长为200nm~500nm。血红蛋白类物质在检测波长为200nm~500nm处有吸收光谱。进一步地，检测波长为415nm。

在其中一个实施例中，待测样品为血液样品。需要说明的是，待测样品不限于为血液样品，也可以为需要检测血红蛋白类物质的实验用样品或者含有血红蛋白类物质的实验用样品。

进一步地，在对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测的步骤之前，还包括如下步骤：采用稀释液对待测样品进行稀释。其中，稀释液例如可以为去离子水或者溶血剂。更进一步地，待测样品为血液样品，采用稀释液对待测样品进行稀释的步骤包括：采用1500μL的稀释液对5μL~10μL的待测样品进行稀释。

需要说明的是，若待测样品的浓度能够满足实际需求，则采用稀释液对待测样品进行稀释的步骤省略。

在其中一个实施例中，检测信号为待测物质的响应信号。检测信号例如可以为待测物质中各组分的电信号。

S120、对检测信号进行分析，以判断待测样品中是否含有血红蛋白类物质，其中，血红蛋白类物质包括血红蛋白变异体，血红蛋白变异体包括Hb New York。

在其中一个实施例中，血红蛋白变异体还包括HbE、HbD、HbS、HbC、HbJ-Bangkok、HbG-Taipei及Hb Q-Thailand中的至少一种。上述血红蛋白类物质的检测方法不仅能够分离和检测Hb New York，还能够检测HbE、HbD、HbS、HbC、HbJ-Bangkok、Hb G-Taipei及Hb Q-Thailand中的至少一种。

进一步地，血红蛋白类物质还包括糖化血红蛋白、非糖化血红蛋白及血红蛋白降解物中的至少一种。糖化血红蛋白包括HbA1a、HbA1b、HbA1c及LA1c中的至少一种。非糖化血红蛋白包括HbA0、HbA2及HbF中的至少一种。血红蛋白降解物包括P3及P4中的至少一种。上述血红蛋白类物质的检测方法不仅能够分离和检测血红蛋白变异体，还能够检测糖化血红蛋白、非糖化血红蛋白及血红蛋白降解物中的至少一种。

在其中一个实施例中，对检测信号进行分析，以判断待测样品中是否含有血红蛋白类物质的步骤包括，采用数据分析软件对检测信号进行分析，以获得待测物质的各种组分吸光度与出峰时间的色谱图。通过吸光度和出峰时间判断待测样品中是否含有血红蛋白类物质以及含有的血红蛋白类物质的种类。

一些研究通过高效液相色谱对血红蛋白变异体进行分析检测，其主要集中在HbE、HbD、HbS和HbC四种常见的血红蛋白变异体。而Hb New York与HbA0的等电点和电荷量均非常接近，非常难以检测和分离Hb New York。目前，全球范围内尚无报道通过液相色谱法能够有效检测Hb New York。而本研究经过大量的研究，预料不到地发现，以pH值为4~8的含有丁二酸盐的溶液作为流动相，对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测，能够提高Hb NewYork与HbA0的分离度，能够有效地检测Hb New York，有利于避免Hb New York的血红蛋白类物质的检测结果的干扰，解决了人们一直渴望解决但始终未能获得成功的技术难题。经试验验证，采用上述血红蛋白类物质的检测方法对待测样品进行检测，Hb New York与HbA0的分离度大于80%，Hb New York与HbA0的分离度较高，能够有效地检测Hb New York。

上述血红蛋白类物质的检测方法中，洗脱方式为三相等度洗脱，流动相包括第一相、第二相及第三相，第一相包括30mmol/L~60mmol/L的丁二酸盐，第二相包括80mmol/L~120mmol/L的丁二酸盐，第三相包括150mmol/L~900mmol/L的丁二酸盐，有利于对Hb NewYork、HbE、HbD、HbS、HbC、HbJ-Bangkok、Hb G-Taipei及Hb Q-Thailand中的至少一种血红蛋白变异体的分离和检测，且能够对HbA1a、HbA1b、HbA1c及LA1c中的至少一种糖化血红蛋白的分离和检测，也能够对HbA0、HbA2及HbF中的至少一种非糖化血红蛋白的分离和检测，还能够对P3及P4中的至少一种血红蛋白降解物的分离和检测，能够提高对各类血红蛋白类物质的分离度，尤其是提高Hb New York与HbA0的分离度，有利于分离和检测各类血红蛋白类物质，检测结果准确性较高。

上述血红蛋白类物质的检测方法中，洗脱的步骤包括：0min~1.5min采用第一相进行洗脱，1.5min~3.2min采用第二相进行洗脱，3.2min~5.0min采用第三相进行洗脱，5min~6min采用第一相进行洗脱，不仅有利于Hb New York、HbE、HbD、HbS、HbC、HbJ-Bangkok、HbG-Taipei、Hb Q-Thailand、HbA1a、HbA1b、HbA1c、LA1c、HbA0、HbA2、HbF、P3及P4中的至少一种的分离检测，还能够同时分离和检测Hb New York、HbE、HbD、HbS、HbC、HbJ-Bangkok、HbG-Taipei、Hb Q-Thailand、HbA1a、HbA1b、HbA1c、LA1c、HbA0、HbA2、HbF、P3及P4中的至少两种，有利于洗脱和分离各类变异血红蛋白，提高检测的分辨率及抗干扰性，尤其能够使HbNew York变异血红蛋白较为彻底地洗脱，检测结果准确性较高。

现有的检测血红蛋白类物质的检测方法主要有毛细管电泳法、离子交换高效液相色谱法和基因诊断。毛细管电泳技术主要被外国公司所垄断，价格昂贵，单台仪器价格是HPLC仪器的几倍以上，无法批量应用；需成批进行样本分析，速度比较慢，无法进行实时检测；自动化程度低，急诊插入、自动维护等功能比较欠缺；多通道毛细管存在通道差，校准程序较为复杂，仪器之间差异较大。而基因诊断的价格昂贵，操作复杂，不适合大规模的筛查等。而上述血红蛋白类物质的检测方法中，在离子交换高效液相色谱法基础上，通过优化流动相及洗脱时序，在已经成功分离和检测HbA1a、HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2以及全球常见的四大变异体HbE、HbD、HbS和HbC基础上，还能够分离和检测出中国常见的HbNew York、HbJ-Bangkok、Hb G-Taipei和Hb Q-Thailand等血红蛋白变异体，色谱图中血红蛋白变异体的峰与正常血红蛋白的峰差异明显，各峰的峰型良好，分辨率高，经大量实验验证及临床反馈，采用本研究的血红蛋白类物质的检测方法和毛细管电泳方法的性能相当。再者，本研究的血红蛋白类物质的检测方法的成本低、能够用于批量检测、自动化程度高、操作及维护方便、重复性及准确度高等优点，有利于在地中海贫血的筛查过程中自动筛选和识别出各类血红蛋白变异体，提前发现可能存在血红蛋白变异体的干扰，降低人为判断误差和风险，避免报告不准确的结果。

此外，本研究还提供一实施方式的血红蛋白类物质的检测设备，能够有效检测HbNew York，能够用于对血红蛋白类物质的非疾病的诊断和治疗目的的检测和分析。

进一步地，血红蛋白类物质的检测设备根据上述血红蛋白类物质的检测方法对待测样品进行检测。

具体地，血红蛋白类物质的检测设备包括检测模块和分析模块。检测模块能够以pH为4~8的含有丁二酸盐的溶液为流动相对待测样品进行阳离子交换液相色谱检测，得到待测样品的检测信号。分析模块能够对检测信号进行分析，以判断待测样品中是否含有血红蛋白类物质，血红蛋白类物质包括血红蛋白变异体，血红蛋白变异体包括Hb New York。

其中，检测模块为高效液相色谱装置或者血红蛋白分析仪。分析模块包括数据分析软件。血红蛋白类物质的检测设备为自带分析模块的高效液相色谱装置或自带分析模块的血红蛋白仪。具体地，检测模块包括自动进样器、用于输送洗脱液的高压泵、用于检测血红蛋白类物质的检测器等装置。分析模块包括血红蛋白分析系统软件。需要说明的是，高效液相色谱装置为本领域中常见的高效液相色谱装置，血红蛋白分析仪为本领域中常见的血红蛋白分析仪，分析模块为本领域中常见的数据分析软件，此处不再赘述。

血红蛋白类物质的检测设备还包括用于存储流动相的存储池。存储池与检测模块连通。存储池能够给检测模块输送pH为4~8的含有丁二酸盐的溶液，以作为检测用的流动相。

上述血红蛋白类物质的检测设备能够有效地检测Hb New York，有利于避免HbNew York的血红蛋白类物质的检测结果的干扰，解决了人们一直渴望解决但始终未能获得成功的技术难题。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

如无特别说明，以下实施例中的待测样品均为血液样品，取自于北京大学深圳医院。血红蛋白类物质的检测设备为市售高效液相色谱仪。色谱柱为深圳普门科技股份有限公司的自主生产的SX型阳离子交换色谱柱（货号：04-I02B000-00035）。稀释液为去离子水。

实施例1~实施例3

实施例1~实施例3中对血红蛋白类物质的检测过程如下：

采用V1μL的稀释液对V2μL的待测样品进行稀释。对稀释后的待测样品进行阳离子交换高效液相色谱检测，得到待测样品的检测信号。对检测信号进行分析，得到检测样品的色谱图。其中，液相色谱的控制参数为：洗脱方式为三相等度洗脱，流动相包括第一相、第二相及第三相，第一相为浓度为C1的丁二酸盐的水溶液，第二相为浓度为C2的丁二酸盐的水溶液，第三相为浓度为C3的丁二酸盐的水溶液。第一相的pH值为pH1。第二相的pH值为pH2。第三相的pH值为pH3。洗脱的步骤包括：0min~T1min采用第一相进行洗脱，T1min~T2min采用第二相进行洗脱，T2min~T3min采用第三相进行洗脱，T3min~T4min采用第一相进行洗脱。流速为v1。柱压为f1MPa。柱温为T℃。进样量为V3μL。检测波长为λnm。具体控制参数详见表1。表1中mM表示mmol/L。实施例1~实施例3的待测样品均为临床上确定含有HbA1a、HbA1b、HbF、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2及Hb New York的血液样品。测定结果详见图1~图3。图1为实施例1的待测样品的液相色谱图。图2为实施例2的待测样品的液相色谱图。图3为实施例3的待测样品的液相色谱图。图4为缩小纵坐标的最大值后绘制得到实施例3的待测样品的的液相色谱图。由于图4中缩小了纵坐标的最大值，故HbA0的峰与Hb New York的峰的分叉未显示出。图4中黑色填充部分是对其对应的峰的填充，例如：HbF处的填充是其对应的HbF的峰的填充。以此类推，后文中其他图（例如图6~图9）中的黑色填充均是类似的含义，后续不再赘述。

表1 实施例1~实施例3中对血红蛋白类物质检测的控制参数

从图1~图3可以看出，Hb New York变异血红蛋白的出峰位置在HbA0之前。经计算图1~图3中Hb New York与HbA0的分离度为分离度大于80%，说明上述血红蛋白类物质的检测方法对Hb New York与HbA0的分离度较高，能够有效地检测和分离Hb New York，有利于避免Hb New York对HbA0检测的干扰。

从图3和图4可以看出，上述血红蛋白类物质的检测方法能够同时检测和分离HbA1a、HbA1b、HbF、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、Hb New York，各峰之间的分离度较高。

实施例4

实施例4的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例3的大致相同，不同之处在于，实施例4分别对四个不同的待测样品进行检测。四个不同的待测样品分别编号为样品1~样品4。

其中，样品1为临床上确定含有HbA1a、HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbE的血液样品。

样品2为临床上确定含有HbA1a、HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbD的血液样品。

样品3为临床上确定含有HbA1a、HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbS的血液样品。

样品4为临床上确定含有HbA1a、HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbC的血液样品。

检测结果详见图5。图5为实施例4中四个不同待测样品的液相色谱图。箭头（4-1）、箭头（4-2）、箭头（4-3）、箭头（4-4）分别表示样品1、样品2、样品3、样品4。a表示HbA1a，b表示HbA1b，f表示HbF，A0表示HbA0，A2表示HbA2，E表示HbE，D表示HbD，S表示HbS，C表示HbC。

从图5可以看出，上述血红蛋白类物质的检测方法能够同时检测和分离HbA1a、HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS和HbC，各峰之间的分离度较高，能够避免HbE、HbD、HbS和HbC等变异血红蛋白对其他血红蛋白类物质（尤其是正常血红蛋白）检测的干扰，保证检测结果的准确性。

实施例5

实施例5的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例3的大致相同，不同之处在于，实施例5的待测样品为临床上确定含有HbA1a、HbF、HbA1c、P4、HbA0、HbA2、HbE的血液样品。检测结果详见图6。图6为实施例5中待测样品的液相色谱图。

从图6可以看出，上述血红蛋白类物质的检测方法能够同时检测和分离HbA1a、HbF、HbA1c、P4、HbA0、HbA2、HbE，各峰之间的分离度较高，尤其是糖化血红蛋白HbA1c和β-地中海贫血因子HbA2，有利于对糖化血红蛋白HbA1c和β-地中海贫血因子HbF和HbA2进行非疾病的诊断和治疗目的的分析。

实施例6

实施例6的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例3的大致相同，不同之处在于，实施例6的待测样品为临床上确定含有HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbJ-Bangkok的血液样品。检测结果详见图7。图7为实施例6中待测样品的液相色谱图。

从图7可以看出，上述血红蛋白类物质的检测方法能够同时检测和分离HbA1b、HbF、LA1c、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、Hb J-Bangkok，各峰之间的分离度较高，有利于对HbJ-Bangkok的进行非疾病的诊断和治疗目的的分析。

实施例7

实施例7的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例3的大致相同，不同之处在于，实施例7的待测样品为临床上确定含有HbA1a、HbF、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbE、HbG-Taipei的血液样品。检测结果详见图8。图8为实施例7中待测样品的液相色谱图。

从图8可以看出，上述血红蛋白类物质的检测方法能够同时检测和分离HbA1a、HbF、HbA1c、P3、P4、HbA0、HbA2、HbE、Hb G-Taipei，各峰之间的分离度较高，有利于对Hb G-Taipei的进行非疾病的诊断和治疗目的的分析。

实施例8

实施例8的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例3的大致相同，不同之处在于，实施例8的待测样品为临床上确定含有HbA1a、HbA1b、HbF、HbA1c、P3、HbA0、HbA2、HbD、HbC、Hb Q-Thailand的血液样品。检测结果详见图9。图9为实施例8中待测样品的液相色谱图。

从图9可以看出，上述血红蛋白类物质的检测方法能够同时检测和分离HbA1a、HbA1b、HbF、HbA1c、P3、HbA0、HbA2、HbD、HbC、Hb Q-Thailand，各峰之间的分离度较高，有利于对Hb Q-Thailand的进行非疾病的诊断和治疗目的的分析。

实施例9

实施例9的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例3的大致相同，不同之处在于，T1为1，T2为2.5，T3为4，T4为5。检测结果详见图10。图10为实施例9中待测样品的液相色谱图。

从图10可以看，实施例9的各峰之间的分离度明显低于实施例3的，例如HbF与HbA2的分离度，说明缩短时间会降低血红蛋白类物质的峰的分离度，尤其HbF与HbA2等主要血红蛋白类物质的分离度。

实施例10

实施例10的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例1的大致相同，不同之处在于，C1为20。检测结果详见图11。图11为实施例10中待测样品的液相色谱图。

从图11可以看，实施例10的各峰之间的分离度明显低于实施例1，并且实施例10的色谱图中还出现了明显的干扰峰。

实施例11

实施例11的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例2的大致相同，不同之处在于，C3为1000。检测结果详见图12。图12为实施例11中待测样品的液相色谱图。

从图12可以看，由于实施例11中C3较大，导致出峰靠前，峰态不明显。

对比例1

对比例1的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例1的大致相同，不同之处在于，pH1为3，pH2为3，pH3为3。检测结果详见图13。图13为对比例1中待测样品的液相色谱图。

从图13可以看，由于pH1、pH2、pH3均低于4，导致对比例1的出峰变矮变趴，柱效明显变差，无法彻底分离血红蛋白HbF和HbA2。

对比例2

对比例2的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例2的大致相同，不同之处在于，pH1为10，pH2为10，pH3为10。检测结果详见图14。图14为对比例2中待测样品的液相色谱图。

从图14可以看，由于pH1、pH2、pH3均高于8，导致对比例2的色谱图中所有血红蛋白类物质提前出峰，而且无法区分血红蛋白类物质的类型。

对比例3

对比例3的对血红蛋白类物质的检测过程及控制参数与实施例3的大致相同，不同之处在于，第一相为浓度为C1的磷酸盐的水溶液，第二相为浓度为C2的磷酸盐的水溶液，第三相为浓度为C3的磷酸盐的水溶液。检测结果详见图15。图15为对比例3中待测样品的液相色谱图。

从图15可以看，对比例3的色谱图中的HbA2分离度下降，同时出现干扰峰。

综上所述，上述血红蛋白类物质的检测方法能够高效检测待测样品中的变异血红蛋白，变异血红蛋白与正常血红蛋白的分离度较大，峰型良好，分辨率高，能够用于对血红蛋白类物质的非疾病的诊断和治疗目的的检测和分析。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。