阅读说明：本技术 一种酶催化的（1s,5r）-双环内酯的合成方法 (Method for synthesizing (1S, 5R) -dicyclic lactone by enzyme catalysis ) 是由 陈芬儿 竺科杰 黄则度 程荡 王佳琦 陶媛 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物制药技术领域,具体为酶催化的(1<I>S</I>,5<I>R</I>)-双环内酯的合成方法。本方法包括：制备含拜尔-维立格单氧化酶的工程菌；制备工程菌的静息细胞悬浊液,并经过超声破碎或者加压破碎后得含拜尔-维立格单氧化酶细胞上清液,再与底物消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮、氢供体、辅因子混合,进行不对称拜尔-维立格氧化,制得(1<I>S</I>,5<I>R</I>)-双环内酯；拜尔-维立格单氧化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；该方法可催化外消旋的取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)生成手性的(1<I>S</I>,5<I>R</I>)-双环内酯,所用工程菌方便易得,产物便于分离且对映选择性高。(The invention belongs to the technical field of biological pharmacy, in particular to enzyme catalytic (1) S ，5 R ) -synthesis of bicyclic lactone. The method comprises the following steps: preparing engineering bacteria containing Bayer-Virgo monooxygenase; preparing the suspension of the engineering bacteria, ultrasonic crushing or pressure crushing to obtain the cell supernatant containing Bayer-Virgo monooxygenase, and racemizing with substrate to substitute bicyclo [3.2.0 ]]Mixing the (E) -hept-2-en-6-one, hydrogen donor and cofactor, and performing asymmetric Bayer-Virgiger oxidation to obtain (1) S ，5 R ) -a bicyclic lactone; Bayer-VirgoThe amino acid sequence of the oxidase is shown as SEQ ID NO. 1; the method can catalyze racemic substituted bicyclo [ 3.2.0%]Production of chiral (1) from (II) -hept-2-en-6-one S ，5 R ) The bicyclic lactone has easy-to-obtain engineering bacteria, easy-to-separate product and high enantioselectivity.)

一种酶催化的（1S,5R）-双环内酯的合成方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及酶催化的（1S，5R）-双环内酯（I）的合成方法。

背景技术

已知如式（I）所示的（1S，5R）-双环内酯是合成前列腺素的关键中间体：

式中R为氢，氟、氯、溴、碘等卤素，C₁-C₈烷基或环烷基，苯基，单取代或多取代芳基或芳烷基，噻吩基，呋喃基，萘基、吡啶基等。n为1~10。

其合成最早由Tolstikov, G. A.等（Zhurnal Organicheskoi Khimii, 1989,25, 208）报道，主要从环戊二烯出发，经过三步合成外消旋底物，然后与（R）- (+)- -甲基苄胺进行非对映体结晶拆分，再经内酯化得到所需要的（1S，5R）-双环内酯（I）。该方法存在着单次拆分率低，操作繁琐，成本偏高等拆分法的通病。

Veronique等（Tetrahedron Lett., 1989, 30, 3663）采用微生物促进的对映选择性Baeyer-Villiger氧化，从双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮出发，一步构建（1S，5R）-双环内酯（I）。Furstoss等（J. Org. Chem., 1992, 57, 1306）用微生物促进立体选择性Baeyer-Villiger氧化，以高对映选择性（>95%ee）得到内酯，但非正常内酯产物也以高ee值得到，且极性相近难以分离。

Masami等人描述了一种猪肝酯酶为催化剂对内消旋二酯的立体选择性水解制备（1S,5R）-双环内酯（I）的方法（Organic Reactions, NJ, United States, 37, No pp.given;1989）；Ogasawara等（Synlett,1996,319）报道了采用脂肪酶催化的不对称去对称化反应构建（1S，5R）-双环内酯（I）的方法。但这些方法存在生产规模小，后处理麻烦等缺点。

发明内容

本发明目的在于克服现有微生物催化技术不足而提供一种方便分离、高纯度且操作简单的（1S，5R）-双环内酯（I）合成方法。

本发明提供的酶催化的（1S，5R）-双环内酯的合成方法，具体步骤为：

（1）制备含拜尔-维立格单氧化酶基因的工程菌和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌；

（2）分别制备两种工程菌的静息细胞悬浊液；

（3）分别制备含拜尔-维立格单氧化酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶基因的细胞上清液

（4）将两种细胞上清液混合，然后与外消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)、溶剂、氢供体和辅因子混合，进行不对称拜尔-维立格氧化反应，制得（1S，5R）-双环内酯(I)；

所述拜尔-维立格单氧化酶基因（简称CHMO基因），其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，

或者与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列同源性大于80%的氨基酸序列。

其中，所述的工程菌含有表达载体pET-28a，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

拜尔-维立格单氧化酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，获得拜尔-维立格单氧化酶和葡萄糖脱氢酶。

所述细胞上清液的制备方法，包括：将所述的工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大至OD₆₀₀值达到0.8 ~ 1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，超声破碎，离心，获得所述的细胞上清液。

作为优选，所述诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.05mM ~ 0.8mM。

作为优选，加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为：15 ~ 25℃，培养时间为8 ~24h。所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠；所述缓冲液浓度为30 ~ 300mM。

本发明不对称氧化反应的反应式，如下：

在整个不对称氧化反应过程中，一方面拜尔-维立格单氧化酶CHMO催化消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)区域选择性的不对称氧化生成立体异构纯的（1S，5R）-双环内酯(I)，同时伴随着还原型辅因子FADH₂转化成为氧化型辅因子FAD的过程；另一方面，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡萄糖内酯，同时消耗了氧化型辅酶因子NADP⁺，再生了还原型辅酶因子NADPH，还原型辅酶因子NADPH将氧化型辅酶因子FAD还原为还原型辅酶因子FADH₂，自身又被氧化成氧化型辅酶因子NADP⁺，形成了一个辅酶因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。

不对称氧化反应中，葡萄糖作为氢供体，所涉及的辅因子为NADP⁺/NADPH，FADH₂/FAD。

反应过程中，拜尔-维立格单氧化酶与葡萄糖脱氢酶的浓度对最终产物的收率有影响。作为优选，两种细胞上清液的混合液中，含拜尔-维立格单氧化酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶的细胞上清液的体积比为20:1 ~ 1:2，更优选，含拜尔-维立格单氧化酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶的细胞上清液的体积比为10:1 ~ 8:1。

具体地，不对称氧化反应中，所述底物浓度为1.0 ~100g/L，制备含拜尔-维立格单氧化酶的细胞上清液的细胞浓度为0.1g_干重/L ~ 25g_干重/L，制备含葡萄糖脱氢酶基因的细胞上清液浓度为0.1g_干重/L ~ 25g_干重/L，氢供体的浓度为5-750g/L，辅因子浓度为0~0.5mM。

作为优选，所述不对称氧化反应的温度为20~40℃，反应缓冲液pH为6.0~8.0。更优选，反应温度为20-25℃，反应缓冲液pH为6.5~7.5，缓冲浓度为100~250mM。

所述不对称氧化反应，所用溶剂为二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺等高介电常数的溶剂；苯、甲苯、乙苯、氯苯、溴苯等芳香族溶剂；正己烷、环己烷等非极性溶剂；乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇等极性溶剂以及磷酸缓冲溶液中的一种或多种。优选的溶剂为甲苯、1，2-二氯乙烷、磷酸缓冲液的混合溶剂，混合比为3:2:95。

在整个反应过程中，待反应至GC检测底物完全耗尽后，用等体积的乙酸乙酯萃取3~4次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠洗涤2次，水洗1次，饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标产物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明构建含拜尔-维立格单氧化酶CHMO和含葡萄糖脱氢酶GDH的工程菌应用于催化外消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)，为（1S，5R）-双环内酯(I)的生产提供了一种新的生物制备途径；

（2）本发明采用拜尔-维立格单氧化酶CHMO和葡萄糖脱氢酶GDH进行组合，使反应过程中消耗和再生的活力相匹配，并利用区域异构体在体系中的自身异构效应，使得最终产物极性差别巨大，从而获得了最佳的制备（1S，5R）-双环内酯(I)的方法，改善了产物的分离条件；

（3）采用方便易得的拜尔-维立格单氧化酶作为催化剂，避免了催化过程中昂贵的化学催化试剂的使用。

附图说明

图1为基因工程菌诱导表达的CHMO-Rhodo1细胞上清液蛋白质SDS-PAGE电泳图。其中，

M:核酸Marker，1：基因工程菌诱导表达的CHMO-Rhodo1细胞上清液。

图2为Racemic-7，7-二氯双环内酯(I)的HPLC分析图谱。

图3为（1S，5R）-7，7-二氯双环内酯(I)测ee值的HPLC分析图谱。

图4为（1S，5R）-7，7-二氯双环内酯(I)XRD单晶衍射图（CCDC:1978566）。

图5为反应底物7，7-二氯双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)的¹HNMR谱图。

图6为反应产物（1S，5R）-7，7-二氯双环内酯(I)的¹HNMR谱图。

图7为反应产物（1R，2S）-邻二羧酸环戊烯（IV）的¹H NMR谱图。

具体实施方式

实施例1、基因工程菌的构建及诱导表达

用质粒CHMO-Rhodo1转化表达宿主BL21(DE3).将BL21(DE3)-CHMO-Rhodo1接种到含卡纳霉素抗性的5mL液体LB试管培养基种，置于37℃的摇床活化8小时，将活化后的培养物按1%转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温振荡培养3小时，培养温度为37℃，200rpm.待菌体浓度长到OD₆₀₀ = 1.2时，加入0.1mM IPTG(终浓度)，18℃诱导18h，8500rpm离心10min收集细胞，用pH7.5，250mM的磷酸钠缓冲液重悬，45%的超声功率破碎30分钟，离心即得含CHMO-Rhodo1的细胞上清，置于4度冰箱存放。

实施例2、反应过程监测

采用GC检测方法测定外消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)到（1S，5R）-双环内酯(I)的转化情况。取不同反应时间点的反应液100L，加入等体积乙酸乙酯溶液，混匀后离心取上层乙酸乙酯层，用0.3M滤膜过滤待检测。色谱条件：色谱柱DB-624(0.32mm × 30m)，检测器：DAD检测器，进样量：1 L，升温程序：初始温度：80℃，80-130℃：升温速率10℃/min，130-230℃：升温速率20℃/min，保留2min。外消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)的保留时间是7.8min，其结构鉴定的¹H NMR如图5所示，（1S，5R）-双环内酯(I)的保留时间为11.02min，其结构鉴定的¹H NMR如图6所示。绝对构型经XRD鉴定，如图4所示。

实施例3、产物ee值的测定

目标产物（1S，5R）-双环内酯(I)的ee值测定采用手性SFC的方法来测定。样品处理：取后处理后的产物用色谱级的无水甲醇溶解后，待SFC检测。

SFC分析条件：色谱柱：Chiralpak IF（4.6mm × 250mm），流动相：CO₂/MeOH= 95:5，流速：3mL/min，进样量：5 L，检测波长：220nM，消旋的产物HPLC图谱如图2所示，（1R，5S）-7，7-二氯双环内酯的保留时间为2.82min，（1S，5R）-7，7-二氯双环内酯(I)的保留时间为3.029min。

实施例4、（1S，5R）-7，7-二氯双环内酯(I)的制备

取实施例1中的CHMO细胞上清液42mL，GDH细胞上清液12mL，加入1.0M外消旋7，7-二氯双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)的DMSO溶液0.6 mL（终浓度10mM），终浓度为60 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP⁺和终浓度为0.05mM的FAD，用pH=7.5、250mM的磷酸钠缓冲液调节体积至60mL，然后置于25℃的恒温水浴搅拌反应1-2小时，GC跟踪反应至反应完全。反应结束后用乙酸乙酯萃取，GC分析产物的收率为32%；SFC分析，ee值为99%。

实施例5、（1S，5R）-7，7-二氯双环内酯(I)的制备

取实施例1中的CHMO细胞上清液25mL，GDH细胞上清液0.9mL，加入0.5M外消旋7，7-二氯双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)的DCE溶液0.6 mL（终浓度10mM），加入1mL甲苯，终浓度为60 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP⁺和终浓度为0.05mM的FAD，用pH=7.5、250mM的磷酸钠缓冲液调节体积至30mL，然后置于25℃的恒温水浴搅拌反应5-7小时，GC跟踪反应至反应完全。反应结束后用乙酸乙酯萃取，GC分析产物的收率为34%；SFC分析，ee值为99%。

实施例6、（1S，5R）-7，7-二氯双环内酯(I)的制备

取实施例1中的CHMO细胞上清液87mL，GDH细胞上清液3mL，加入0.5M外消旋7，7-二氯双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)的DCE溶液2 mL（终浓度10mM），加入3.3 mL甲苯，终浓度为20mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP⁺和终浓度为0.05mM的FAD，用pH=7.5、250mM的磷酸钠缓冲液调节体积至100mL，然后置于25℃的恒温水浴搅拌反应5-7小时，GC跟踪反应至反应完全。反应结束后用乙酸乙酯萃取，GC分析产物的收率为30%；SFC分析，ee值为99%。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种酶催化的（1S,5R）-双环内酯的合成方法

<130> 001

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln

20 25 30

Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr

35 40 45

Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His

50 55 60

Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp

65 70 75 80

Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser

85 90 95

Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu

100 105 110

Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser

115 120 125

Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val

130 135 140

Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr

145 150 155 160

Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn

165 170 175

Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln

180 185 190

Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe

195 200 205

Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr

210 215 220

Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp

225 230 235 240

Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu

245 250 255

Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu

260 265 270

Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly

275 280 285

Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile

290 295 300

Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys

305 310 315 320

Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly

325 330 335

Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys

340 345 350

Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp

355 360 365

Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp

370 375 380

Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly

385 390 395 400

Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly

405 410 415

Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn

420 425 430

Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp

435 440 445

Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile

450 455 460

Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp

465 470 475 480

Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly

485 490 495

Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gly

500 505 510

Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr

515 520 525

Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala

530 535 540