阅读说明：本技术 黄花蒿细胞生物转化二氢去氧青蒿素b的方法和用途 (Method for biotransformation of dihydrodeoxyartemisinin B by artemisia annua cells and application of dihydrodeoxyartemisinin B ) 是由 朱建华 于荣敏 陈昌 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明是黄花蒿细胞生物转化二氢去氧青蒿素B的方法和用途。涉及到黄花蒿脱分化细胞的诱导、悬浮培养,利用TLC、HPLC-ELSD和GC-MS法考察并优化二氢去氧青蒿素B最佳转化时间和最佳转化浓度。光照培养条件下,最佳转化条件为60h和90mg/L；暗培养条件下,最佳转化条件为72h和90mg/L。进一步积累转化产物,利用硅胶柱、Sephadex LH-20及半制备液相进行分离纯化后得到三个化合物,通过HR-ESI-MS、NMR进行结构鉴定,确定为3α-hydroxy dihydro-epi-deoxyarteannuin B,9β-hydroxy dihydro-epi-deoxyarteannuin B和14-hydroxy dihydro-epi-deoxyarteannuin B；细胞冻干、乙酸乙酯超声提取以及GC-MS检测青蒿素的含量,光照培养和暗培养条件下,实验组的青蒿素含量分别增加了3.6％和23.9％。利用qRT-PCR法检测最佳转化条件下黄花蒿细胞中HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2和ALDH1的表达水平。(The invention relates to a method for biotransformation of dihydrodeoxyartemisinin B by artemisia annua cells and application thereof. Relates to the induction and suspension culture of the artemisia annua dedifferentiated cells, and utilizes TLC, HPLC-ELSD and GC-MS methods to investigate and optimize the optimal conversion time and the optimal conversion concentration of dihydrodeoxyartemisinin B. Under the illumination culture condition, the optimal transformation condition is 60h and 90 mg/L; under dark culture conditions, the optimal transformation conditions were 72h and 90 mg/L. Further accumulating the transformation products, separating and purifying by utilizing a silica gel column, Sephadex LH-20 and a semi-prepared liquid phase to obtain three compounds, and carrying out structure identification through HR-ESI-MS and NMR to determine the three compounds as 3 alpha-hydroxy dihydro-epi-deoxy-anhydronin B, 9 beta-hydroxy-epi-deoxy-anhydronin B and 14-hydroxy dihydro-epi-anhydronin B; cell freeze-drying, ethyl acetate ultrasonic extraction and GC-MS detection of the artemisinin content, the artemisinin content of the experimental groups was increased by 3.6% and 23.9% respectively under the conditions of light culture and dark culture. And detecting the expression levels of HMGR, FPS, ADS, CYP71AV1, CPR, DBR2 and ALDH1 in the artemisia annua cells under the optimal transformation condition by using a qRT-PCR method.)

黄花蒿细胞生物转化二氢去氧青蒿素B的方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学中的天然活性产物的生物转化领域，具体涉及到黄花蒿脱分化细胞的诱导、固体培养及液体悬浮培养，考察并优化二氢去氧青蒿素B最佳转化时间和最佳转化浓度；转化产物的积累、分离纯化以及通过HR-ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR进行结构鉴定；黄花蒿细胞冻干、乙酸乙酯超声提取及GC-MS检测青蒿素含量；qRT-PCR法检测最佳转化条件下黄花蒿细胞中基因的表达水平。

背景技术

青蒿素是我国科学家于1971年从中药黄花蒿Artemisia annua L.中分离出来的一种具有过氧桥的倍半萜类化合物，它具有抗疟疾等多种生物活性。目前，以青蒿素类药物为主的联合疗法已经成为世界卫生组织推荐的抗疟疾标准疗法。由于青蒿素在植物中含量低 (0.02％～1.07％)，且具有地区差异性，因此其原料药产量远远不能满足患者的需求。目前，青蒿素的获取途径包括直接从黄花蒿提取，化学合成和生物合成。

国内药用青蒿素主要从黄花蒿提取获得，黄花蒿的种植采收以及加工步骤繁琐，而且费时费力，占地面积大等缺点给其商业化生产带来挑战。青蒿素的化学合成在20世纪80年代就已实现。化学合成的成本低廉，并且该反应可以放大到数十克，但合成路线复杂，产率较低，并且生产过程对环境造成较大污染，废液处理成本高。青蒿素的半合成主要采用生物合成青蒿酸，再以青蒿酸为原料化学合成青蒿素。该方法收率高，操作简便，有望实现大规模工业化生产。但半合成依赖于对青蒿素衍生物的获取，工业生产成本较高。迄今为止，通过酵母工程菌发酵生产青蒿酸，再以青蒿酸为原料合成青蒿素被广泛应用。生物全合成因其操作简便，成本低廉而备受青睐，因此具有诱人的前景。青蒿素生物全合成具有巨大的应用价值，但是由于其生物合成终端反应机理不明确，因此目前尚无法实现。

将外源性的有机化合物添加到处于生长状态的生物体系或酶体系中，底物在生物系统中酶的催化作用下发生化学结构的变化，该过程称为生物转化。生物转化反应具有选择性强、条件温和以及环境友好等优点。一般用于转化研究的生物体系主要有细菌、真菌、藻类、植物悬浮细胞和组织等，其中应用最多的是植物悬浮细胞。这些转化产物一般很难通过化学反应实现。

悬浮细胞的生物转化一般用于天然产物和有机合成产物的结构修饰，进而获得先导化合物。利用生物转化法获得到其衍生物再进一步研究，有望解决这些问题。利用植物悬浮培养细胞进行生物转化反应与化学反应等方式具有显著的差别及优势。该方法操作简单，环境友好，适合大规模生产。但是植物细胞在培养过程中生长缓慢，容易受到环境如温度等的影响，并且需要在无菌环境下操作，这些缺点限制了植物悬浮细胞的利用。

前期研究表明，二氢去氧青蒿素B可能是青蒿素的前体，因此可以促进青蒿素及其转化产物含量的提高。本研究通过向黄花蒿悬浮细胞中饲喂二氢去氧青蒿素B来实现。

发明内容

本发明的目的在于研究向黄花蒿悬浮细胞饲喂二氢去氧青蒿素B来提高转化产物和青蒿素含量的方法。

本发明基于细胞培养，考察并优化二氢去氧青蒿素B的最佳转化时间和最佳转化浓度，产物的积累、分离纯化及结构鉴定，以及细胞中青蒿素含量的检测，qRT-PCR法检测最佳生物转化条件下黄花蒿细胞中基因的表达水平。包括以下方法和步骤：

(1)黄花蒿脱分化细胞的诱导、固体培养及液体悬浮培养；

(2)光照培养和暗培养条件下二氢去氧青蒿素B生物转化条件的优化；

(3)转化产物的积累、分离纯化以及利用HR-ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR进行结构鉴定；

(4)黄花蒿细胞冻干、乙酸乙酯超声提取以及GC-MS检测青蒿素含量；

(5)qRT-PCR法检测黄花蒿细胞中HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2和 ALDH1的表达水平。

本发明利用黄花蒿悬浮细胞生物转化法得到三个化合物：3α-hydroxy dihydro-epi-deoxyarteannuin B，9β-hydroxy dihydro-epi-deoxyarteannuin B，14-hydroxydihydro-epi-deoxyarteannuin B。

附图说明

图1为光照条件下培养基中产物的HPLC-ELSD检测图谱。

图2为暗培养条件下培养基中产物的HPLC-ELSD检测图谱。

图3为光照条件下培养基中产物的GC-MS检测图谱。

图4为暗培养条件下培养基中产物的GC-MS检测图谱。

图5为光照培养体系中DHEDB转化产物含量随转化时间变化曲线图。

图6为暗培养体系中DHEDB转化产物含量随转化时间变化曲线图。

图7为光照培养体系中DHEDB转化产物含量随底物浓度变化曲线图。

图8为暗培养体系中DHEDB转化产物含量随底物浓度变化曲线图。

图9为化合物1的HR-ESI-MS图谱。

图10为化合物1的¹H-NMR图谱。

图11为化合物1的¹³C-NMR图谱。

图12为化合物2的HR-ESI-MS图谱。

图13为化合物2的¹H-NMR图谱。

图14为化合物2的¹³C-NMR图谱。

图15为化合物3的HR-ESI-MS图谱。

图16为化合物3的¹H-NMR图谱。

图17为化合物3的¹³C-NMR图谱。

图18为化合物3的DEPT 135图谱。

图19为化合物3的¹H-¹H COSY图谱。

图20为化合物3的HSQC图谱。

图21为化合物3的HMBC图谱。

图22为化合物3的NOESY图谱。

图23为黄花蒿悬浮细胞生物转化DHEDB路线图。

图24为光照培养下细胞中产物的GC-MS图谱。

图25为暗培养下细胞中产物的GC-MS图谱。

图26为细胞中青蒿素的含量。

图27为反转录的反应体系。

图28为黄花蒿关键酶基因的引物序列。

图29为qRT-PCR的反应体系。

图30为qRT-PCR的反应程序。

图31为光照培养条件下底物对关键酶基因的影响。

图32为暗培养条件下底物对关键酶基因的影响。

具体实施方式

实施例一：黄花蒿脱分化细胞的诱导、固体培养及液体悬浮培养

脱分化细胞的诱导：取黄花蒿无菌苗用剪刀将其嫩枝切成1cm长条段，叶片剪去叶边成 1cm²方块，用镊子夹取到MS培养基上，使其创伤处和培养基充分接触。将培养基置于25℃恒温箱中，分为12h光照培养和持续暗培养。

脱分化细胞的固体培养：将两种脱分化细胞继代培养至含30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、维生素C 50.0mg/L、0.5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的MS培养基，其pH 5.70～5.72。每14d继代培养一次，

悬浮细胞的培养：烧杯中加入4.43g/L MS基本培养基，30g/L蔗糖、0.5mg/L NAA和0.5mg/L 6-BA，把溶液转移至量筒中，加蒸馏水定容，pH调节至5.70～5.72，121℃下灭菌20min。继代细胞量为50g/L，置于摇床上悬浮培养，转速为120rpm，培养温度为25℃，光照培养组和暗培养组分别进行持续光照和避光培养。

实施例二：二氢去氧青蒿素B生物转化条件的优化

黄花蒿悬浮培养细胞在预培养10d后，投入DHEDB，底物浓度分别为0、10、30、50、70、90mg/L，每组3瓶，分别培养12、24、36、48、60、72、84h后停止转化。将悬浮细胞抽滤以分离细胞和培养基，细胞置于真空冷冻干燥机中除水。将干燥后的细胞在研钵中粉碎，用适量乙酸乙酯超声提取3次，合并提取液并在45℃下浓缩至干；以等体积乙酸乙酯萃取培养基3次，将有机层合并后在45℃下减压浓缩至干。用色谱级甲醇：氯仿(体积比1:1)2 mL溶解样品，0.45μm有机微孔滤膜过滤后保存在液相小瓶中，进行HPLC-ELSD和GC-MS 检测。

如图1，2所示：HPLC-ELSD检测发现，实验组(Ⅰ)和对照组(Ⅱ)相比，在光照培养和暗培养条件下，均在9.5-10.5min内出现三个产物峰1，2和3。

如图3，4所示：GC-MS检测发现，实验组(Ⅰ)和对照组(Ⅱ)相比，在光照培养和暗培养条件下，均出现三个产物峰1，2和3。

如图5所示：在光照培养条件下，确定最佳转化时间为60h。

如图6所示：在暗培养条件下，确定最佳转化时间为72h。

如图7所示：在光照培养条件下，确定最佳转化浓度为90mg/L。

如图8所示：在暗培养条件下，确定最佳转化浓度为90mg/L。

实施例三：转化产物的积累、分离纯化以及结构鉴定

为了分离黄花蒿悬浮细胞生物转化DHEDB的产物，并通过分析方法鉴定其结构，需要增加黄花蒿细胞的培养量。继代100瓶100mL黄花蒿悬浮细胞，光照培养10d后，加入90mg/L DHEDB，继续光照培养60h后停止转化，抽滤，培养基萃取3次，合并乙酸乙酯层， 45℃下减压浓缩至干。

用200-300目硅胶分离样品，石油醚、乙酸乙酯作为洗脱剂梯度洗脱，TLC不断检测并合并相同流分，香草醛-浓硫酸显色。进一步经Sephadex LH-20，高效液相色谱分离，得到三个化合物。利用HR-ESI-MS、NMR等方法对转化产物进行结构鉴定。

图9-11，图12-14，图15-22分别为化合物1，2，3的质谱和核磁共振数据。如图23所示，光照培养和暗培养两种条件下的转化产物相同，均得到了三个化合物：3α-hydroxydihydro-epi-deoxyarteannuin B(1)，9β-hydroxy dihydro-epi-deoxyarteannuin B(2)和14-hydroxy dihydro-epi-deoxyarteannuin B(3)，其中化合物3为新倍半萜类化合物。

实施例四：黄花蒿细胞冻干、乙酸乙酯超声提取及GC-MS检测青蒿素含量

黄花蒿悬浮细胞预培养10d后，投入DHEDB(90mg/L)，每组3瓶。光照培养转化60 h后停止培养，暗培养转化72h后停止培养。将悬浮细胞抽滤以分离细胞和培养基，细胞置于真空冷冻干燥机中除水。将干燥后的细胞在研钵中粉碎，用适量乙酸乙酯超声提取3次，合并提取液并在45℃下浓缩至干，分别用色谱纯甲醇：氯仿(体积比1:1)2mL和色谱纯乙酸乙酯1mL溶解样品，0.22μm有机微孔滤膜过滤后保存在液相小瓶中待测。样品分别进行 HPLC-ELSD和GC-MS检测。

如图24所示：利用GC-MS检测发现，光照培养条件下的实验组(Ⅰ)和对照组(Ⅱ)相比，在18.10min处出现青蒿素峰，对照组的青蒿素含量为167.74μg/L，实验组中青蒿素含量为173.85μg/L，实验组比对照组青蒿素含量增加3.6％。

如图25所示：利用GC-MS检测发现，暗培养条件下的实验组(Ⅰ)和对照组(Ⅱ)相比，对照组的青蒿素含量为133.96μg/L，实验组中青蒿素含量为165.99μg/L，实验组比对照组青蒿素含量增加23.9％。

图26为在光照培养和暗培养条件下，实验组和对照组的青蒿素含量。

实施例五：qRT-PCR法检测黄花蒿细胞中基因的表达水平

黄花蒿悬浮细胞预培养10d后，设置3瓶投入浓度为90mg/L DHEDB的实验组，光照培养60h(Light-cultured DHEDB group；LB)；3瓶加入100μL DMSO的光照培养对照组，培养60h(Light-cultured DMSO group；LD)；3瓶投入浓度为90mg/L DHEDB的实验组，暗培养72h(Dark-cultured DHEDB group；DB)3瓶加入100μL DMSO的暗培养对照组，培养72h(Dark-cultured control group；DD)。抽滤分离细胞后，锡箔纸包裹细胞放入-80℃冰箱备用。

总RNA提取操作步骤如下：

(1)将试剂和用品放入超净工作台中，打开紫外灯灭菌30min后通风；同时将药勺、镊子和提前准备好的细胞样品放入液氮瓶中冷却。

(2)用移液枪分别向1.5mL EP管中依次加入1mL Trizol、200mL三氯甲烷、500mL异丙醇以及1mL 75％乙醇，并盖上EP管盖。

(3)用无水乙醇灼烧研钵后，倒入液氮冷却。在研钵中倒入液氮，加入待研磨的细胞并研磨至成均匀的粉末状。研磨过程中需不断加入液氮，以保证液氮完全浸没样品。

(4)取约2勺研磨好的样品，加入到1mL Trizol中，并涡旋15s，然后在4℃、12000rpm下离心10min。

(5)将离心完的样品取出，用移液枪吸取约900mL上清液加入到含有200mL三氯甲烷的EP管中，涡旋15s，在4℃、12000rpm下离心15min。。

(6)将离心完的样品取出，用移液枪吸取约500mL上清液，加入到含有500mL异丙醇的EP管中，置于室温下10min后，在4℃、12000rpm下离心10min后弃上清。

(7)向EP管中加入1mL 75％乙醇，用移液枪轻轻吹打至管中沉淀完全溶解。

(8)在4℃、7500rpm下离心5min，小心吸去上清，将EP管置于超净台中晾干。

(9)用20mL RNase-Free H₂O溶解EP管中的RNA样品。

(10)取2mL RNA样品进行电泳检测。

(11)用超微量紫外分光光度计检测样品的浓度及OD260/OD280值。

使用Goldenstar^TM RT6 cDNA Synthesis Mix试剂盒进行反转录。按照图27在RNase free PCR管中配制好反应体系，用枪头轻轻混匀，短暂离心后50℃下反应15min。反应结束后得DNA模版，降温至4℃，进行后续qRT-PCR实验。

所用引物如图28所示。参考基因为UBC，目的基因为ADS、CPR、CYP71AV1、FPS、HMGR、ALDH1和DBR2。利用2×T5 Fast qPCR Mix(SYBRGreenI)试剂盒进行qRT-PCR检测。在qPCR管中按照图29配制反应体系，按照图30设定480实时荧光定量 PCR系统的反应程序，记录各个基因的Ct值。

目的基因的表达水平如图31，图32所示。在光照培养条件下，LB组中HMGR、FPS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1的表达水平分别为LD组的1.76、3.16、1.65、2.03和2.06倍。 DB组中的ADS和ALDH1的表达水平分别是DD组的4.17倍和2.30倍。