阅读说明：本技术 一种在高水活度介质中催化合成l-抗坏血酸油酸酯的方法 (Method for catalytically synthesizing L-ascorbyl oleate in high-water-activity medium ) 是由 姚冬生 郑少燕 芦根 刘大岭 谢春芳 刘桂祯 黄炯威 劳伟明 于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物工程技术领域,涉及一种在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法。本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法,包括以下步骤：以油酸乙酯和L-抗坏血酸为底物,混合后加入脂肪酶,置于高水活度的水/脂质双相介质中,由重组脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯；所述重组脂肪酶是基于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的重组脂肪酶。本发明首次发现CpLIP2脂肪酶可催化油酸乙酯与L-抗坏血酸合成L-抗坏血酸油酸酯,且催化反应可在高水活度(a<Sub>w</Sub>>0.9)水/脂质双相介质中进行。本发明所述方法能在不含有机溶剂的水性介质中通过脂肪酶生产L-抗坏血酸油酸酯,反应条件简单,提供了一种有效的生物转化生产绿色油脂的方法。(The invention belongs to the technical field of bioengineering, and relates to a method for catalytically synthesizing L-ascorbyl oleate in a high-water-activity medium. The method for catalytically synthesizing the L-ascorbic acid oleate in the high-water-activity medium comprises the following steps of: taking ethyl oleate and L-ascorbic acid as substrates, mixing, adding lipase, placing in a water/lipid two-phase medium with high water activity, and catalyzing and synthesizing L-ascorbic acid oleate by using recombinant lipase; the recombinant lipase is a recombinant lipase based on a lipase with an amino acid sequence shown as SEQ ID No. 1. The invention discovers for the first time that CpLIP2 lipase can catalyze ethyl oleate and L-ascorbic acid to synthesize L-ascorbic acid oleate, and the catalytic reaction can be carried out at high water activity (a) w >0.9) in a water/lipid biphasic medium. The method of the inventionThe method can produce the L-ascorbyl oleate by lipase in an aqueous medium without organic solvent, has simple reaction conditions, and provides an effective method for producing the green grease by biotransformation.)

一种在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法。更具体地，本发明提供一种以油酸乙酯和L-抗坏血酸为原料，在高水活度介质中通过脂肪酶催化油酸乙酯合成L-抗坏血酸油酸酯的方法。

背景技术

油脂是人体所需的重要的营养物质之一，食品中的油脂在加工、储藏和运输过程中，易发生氧化酸败，从而降低其营养价值，甚至对人体的健康产生危害。通常在食品中添加抗氧化剂是解决这一问题的有效途径。L-抗坏血酸脂肪酸酯是L-抗坏血酸的脂溶性衍生物，与L-抗坏血酸饱和脂肪酸酯相比，L-抗坏血酸油酸酯在油脂类物质中的溶解度更高，而且抗氧化效果更好，更适用于油脂的抗氧化。

脂肪酶是一类具有多种催化能力并且能在油水界面发挥活性的水溶性酶，它能够催化脂肪等酯类的水解。在某些条件下，脂肪酶也能够催化产生酯，反应类型有酯化、醇解、酸解以及酯交换。由于水是酯合成反应的产物，通常使用水活度非常低的有机溶剂，并且必须提取反应过程中形成的水，酯转移反应(如醇解)不会产生水，但它们通常也应该在低水活度下进行以阻止酯水解。因此，目前酶法催化L-抗坏血酸油酸酯的合成基本上都是在非水相体系中进行的，如有机溶剂。例如，名称为“脂肪酶催化猪油合成抗坏血酸脂肪酸酯的方法”的发明专利(公开号：CN 101892275 B)公开了以体积比7∶3的异辛烷∶叔戊醇作为反应介质，通过脂肪酶催化猪油和甲醇进行醇解反应制备复合脂肪酸甲酯，然后再催化复合脂肪酸甲酯与L-抗坏血酸进行转酯化反应制备抗坏血酸脂肪酸酯；名称为“酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法”的发明专利(公开号：CN 102212572 B)公开了以四氢呋喃作为反应介质，催化L-抗坏血酸和油酸合成L-抗坏血酸油酸酯。有文献(https://doi.org/10.5650/jos.62.591)报道以丙酮作为反应介质，L-抗坏血酸和油酸作为底物，在脂肪酶的催化下合成L-抗坏血酸油酸酯。

目前，L-抗坏血酸油酸酯还没有实现商品化生产，L-抗坏血酸油酸酯合成的研究主要是利用脂肪酶在有机溶剂中进行的，但是有机溶剂的使用不仅会产生很多安全的问题，也会增加作为“绿色食品添加剂”的L-抗坏血酸脂肪酸酯的下游处理成本。有机相合成会对环境造成污染，而且样品中残留的有机溶剂可能对人的身体有害。例如已公开的专利：CN 102212572 B(酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法)、CN 102212574 B(酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸亚油酸酯的方法)都是以四氢呋喃有机溶剂作为反应介质合成L-抗坏血酸油酸酯/亚油酸酯。新型的反应介质如离子液体、超临界流体等虽然更加环保，但是使用成本较高，操作条件苛刻，这些因素限制了它们的大规模应用。

有研究报道在水/脂质双相介质中高产率的生产甘油或甲醇的脂肪酸酯是可行的。Candida deformans来源的脂肪酶(CdLIP1)(https://doi.org/10.1002/yea.958)能够在水溶液中存在甲醇以及油酸或三油酸甘油酯的条件下，酯化合成油酸甲酯。Candidaparapsilosis来源的脂肪酶(CpLIP2)在水溶液中催化甲醇和菜籽油的醇解。Rodrigues(https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.07.090)等将该酶固定在两种合成树脂Accurel MP 1000和Lewatit VP OC 1600上，在脂质/水体系(aw～0.96)中催化麻风树油和甲醇(2M)酯交换合成生物柴油。尽管这些研究提示某些特定的脂肪酶在水介质中直接生物转化合成油酸甲酯和生物柴油的可能性，但未有报道用脂肪酶在水介质中催化油酸乙酯和L-抗坏血酸合成L-抗坏血酸油酸酯。

因此，在不含有机溶剂的水性介质中开发有效的生物转化对于绿色油脂化学是特别具有挑战性的，也是未来绿色油脂化学的重要发展方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法，该方法能在不含有机溶剂的水性介质中通过脂肪酶生产L-抗坏血酸油酸酯，反应条件简单，为绿色健康的油脂生产提供了新途径。

本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法，包括以下步骤：以油酸乙酯和L-抗坏血酸为底物，混合后加入脂肪酶，置于高水活度的水/脂质双相介质中，由重组脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯；所述重组脂肪酶是基于Candidaparapsilosis来源的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的重组脂肪酶。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述水/脂质双相介质的水活度a_w>0.9。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述水/脂质双相介质为50mM、pH6.5磷酸缓冲液和油酸乙酯乳化液。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述由重组脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯的过程是：40℃、180rpm搅拌反应体系，反应2.5小时后，从反应体系中分离纯化制得L-抗坏血酸油酸酯。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述分离纯化方法为：每2.2mL的反应体系加入2mL乙酸乙酯，再加入0.792g氯化钠，涡旋混匀3min，萃取L-抗坏血酸油酸酯，然后5000rpm，离心5min。取上清，将上清液加热至77℃挥干乙酸乙酯，得到L-抗坏血酸油酸酯。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所加入的反应底物L-抗坏血酸的浓度在反应体系中的终浓度为0.2-2.2mol/L,油酸乙酯的终浓度为15-250mmol/L。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述重组脂肪酶是通过酵母分泌表达的重组脂肪酶。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述重组脂肪酶在反应体系中的终浓度为0.05-2mg/mL。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述重组脂肪酶是通过酵母展示的重组脂肪酶。

根据本发明所述的在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法的进一步特征，所述重组脂肪酶在反应体系中的终浓度为0.01-0.5g/mL。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α-凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，或者利用细胞壁α-凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对L-抗坏血酸和油酸乙酯作为底物合成L-抗坏血酸油酸酯的反应进行催化。本发明所述的反应体系是在高水活度(a_w>0.9)的水/脂质双相介质中进行的，本发明使用的脂肪酶也可以用固定化酶的形式在反应介质中催化L-抗坏血酸和油酸乙酯合成L-抗坏血酸油酸酯。因此，本发明提供了一种有效的生物转化生产绿色油脂的方法。

本发明首次发现CpLIP2脂肪酶可催化油酸乙酯与L-抗坏血酸合成L-抗坏血酸油酸酯，且催化反应可在高水活度(a_w>0.9)水/脂质双相介质中进行，细胞展示的CpLIP2脂肪酶有很高的操作稳定性，转化率(以L-抗坏血酸计)在70.3％以上，产率达65.8％以上。

附图说明

图1为以本发明所述的脂肪酶催化合成的L-抗坏血酸油酸酯的质谱鉴定图。

图2为pPCPA-GS115的荧光显微镜检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合所附的附图对本发明作进一步的详细说明，这里的实施例是以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于这些实施例。

实施例一：毕赤酵母分泌表达的脂肪酶在水/脂质双相介质(a_w>0.9)中催化L-抗坏血酸油酸酯的合成

本实验采用的毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商品化产品，可从Invitrogen公司购得。细胞壁α-凝集素基因序列来源于酿酒酵母，载体pPIC3.5K为商品化产品。

本发明所述的脂肪酶是基于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的脂肪酶(GenBank:CAC86400.1)，是Candida parapsilosis来源的脂肪酶，命名为CpLIP2，其基因序列命名为Lip2。

根据所用的表达宿主菌Pichia pastoris GS115，对Lip2的序列进行密码子优化，使用α-factor信号肽替换Lip2基因的天然信号肽，并且加上三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)，以实现其在毕赤酵母GS115中的组成型分泌表达。所述的重组质粒由原始载体pPIC3.5K和依次***原始载体pPIC3.5K中的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)、α-factor信号肽下游的脂肪酶基因组成。新的序列命名为rLip2交由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。

本实施例所述的酵母分泌表达的脂肪酶通过如下方法制备：将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母GS115，将所得转化子接种于YPD培养基中，发酵培养72～120小时后离心收集蛋白上清液得脂肪酶发酵酶液。

具体实验操作如下：在T4连接酶的作用下，rLip2序列的基因与pPIC3.5K质粒过夜连接形成pPIC3.5K-rLip质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC3.5K-rLip2质粒进行酶切线性化处理。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。将酶切线性化处理好的目的基因约15μL加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴30min，然后在1500V、400Ω、25uF条件下电击5ms，并加入约800μL预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μL涂于MD平板上，然后将MD平板上长出的转化子点接到三丁酸甘油酯平板上，28℃倒置培养3-5天，根据阳性转化子周围透明圈的出现，以及透明圈的大小挑取阳性重组菌株，即产有活性脂肪酶的重组毕赤酵母菌。

三丁酸甘油酯平板法是利用脂肪酶或酯酶能够分解三丁酸甘油酯产生脂肪酸的原理，通过在培养基中加入三丁酸甘油酯乳化液，其被分解后可以产生透明圈，可以通过观察是否形成透明圈以及透明圈的大小来判断菌株是否产脂肪酶以及所产脂肪酶的活性大小。

将重组毕赤酵母接种在YPD培养基中发酵培养96h，7000rpm、4℃离心收集得到含CpLIP2脂肪酶的上清液。

CpLIP2脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯：

(1)CpLIP2脂肪酶催化油酸乙酯和L-抗坏血酸反应，反应体系见下表1：

表1：

组分	体积
		油酸乙酯乳化液(50g/L)	200μL(终浓度15mM)
L-抗坏血酸	适量
		酶液	1mL(终浓度0.039mg/mL)
50mM，pH6.5磷酸缓冲液	补至2.2mL

(2)反应置于40℃恒温培养箱，180rpm，反应2.5h后。

(3)向反应液中加入2mL的乙酸乙酯，再加入0.792g氯化钠(消除乳化层)，涡旋混匀3min，萃取油酸甲酯，然后5000rpm，离心5min。

(4)取上清，将上清液加热至77℃挥干乙酸乙酯，再加入500μL甲醇重新溶解。

(5)将200μL的反应产物进行液质联用检测：

(a)液相色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(100mm*2.1mm，Particle Sz.1.9μm)，柱温：40℃，流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：甲醇；流速：300μL/min；流动相梯度见下表2。

表2：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0.00	95	5
0.50	95	5
			6.00	0	100
10.00	0	100
			10.10	95	5
12.00	95	5

(b)质谱检测条件：

电离方式：ESI；喷雾电压：±3.0kV；毛细管温度：300℃；源加热温度：350℃；鞘气压力：45arb；辅助气压力：8arb；扫描模式：全扫+二级；碰撞能：30V结果得到L-抗坏血酸油酸酯，附图1质谱图中439.1分子量的物质为[C₂₄H₃₉O₇]^-，即为L-抗坏血酸油酸酯的质谱峰。

转化产率和转化率的测定：

取1mL上述反应产物，用100％甲醇准确定容至10mL，然后经0.22μm有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。HPLC检测条件：UltiMate 3000高效液相色谱仪(Thermo scientific)，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(100mm*2.1mm，Particle Sz.5μm)，上样量60μL，流动相为甲醇/水＝90/10，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm。

产率计算公式如下：

产率＝L-抗坏血酸油酸酯的浓度/(L-抗坏血酸的浓度+L-抗坏血酸油酸酯的浓度)，

酯化反应效率：转化率＝L-抗坏血酸的浓度(反应后)/L-抗坏血酸的浓度(反应前)×100％。

通过上述方法检测计算，合成L-抗坏血酸油酸酯的产率和反应效率，产率和反应效率经初步估算，分别达到65.8％以上和70.3％以上。

实施例二：酵母展示的脂肪酶在水/脂质双相介质(a_w>0.9)中催化L-抗坏血酸油酸酯的合成

在实施例一中所述的rLip序列的5’端和α-factor信号肽之间，设计加入FLAG标签的基因序列，新的序列命名为fLip，交由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。同时对α-凝集素(AGα1)的C端320个氨基酸的基因序列(AGα1)，根据所用的表达宿主菌Pichiapastoris GS115进行密码子优化，并人工合成。所述的重组质粒由原始载体pPIC3.5K和依次***原始载体pPIC3.5K中的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)，α-factor信号肽，FLAG标签的基因序列下游的脂肪酶基因和酿酒酵母的细胞壁α-凝集素基因组成。

本实施例所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母GS115，将所得转化子接种于YPD培养基中，培养72～120小时后离心收集菌体得酵母展示脂肪酶。

具体的实验操作如下：在T4连接酶的作用下AGα1、fLip与pPIC3.5K质粒过夜连接形成pPIC3.5K-AGα1-fLip质粒(pPCPA)，通过电泳检验并回收质粒。用Sal I对pPCPA质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μL加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴30min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击5ms，并加入约800μL预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μL涂于MD平板上，然后将MD平板上长出的转化子点接到三丁酸甘油酯平板上，根据阳性转化子周围透明圈的出现，以及透明圈的大小挑取阳性重组菌株。从三丁酸甘油酯平板上挑取周围透明圈比较大的菌落，接种到5mL的YPG液体培养基中，200rpm，活化培养24h。取50μL培养好的菌液，转移到新的50mL YPD培养液中，200rpm，培养72h。取培养好的菌液，置于50mL离心管中，5000g，4℃离心5min，弃上清。用10mL 1×PBS漂洗菌体，5000g，4℃离心5min，弃上清。重复3次。取含有1％BSA的1×PBS悬浮菌体，菌体的浓度稀释到约10OD。取400μL的菌液，加入0.5μL的一抗(DYKDDDDK Tag(9A3)Mouse mAb)，室温孵育两小时，每隔20min混匀一次，避免菌体沉淀。5000g，室温离心5min，弃上清。取800μL的1×PBS洗涤菌体，5000g，室温离心5min，弃上清。重复三次。取400μL含有1％BSA的1×PBS悬浮菌体，加入0.5μL的二抗(Anti-Mouse IgG)，室温避光孵育45min，每隔15min混匀一次，避免菌体沉淀。5000g，室温离心5min，弃上清。取1mL的1×PBS洗涤菌体，5000g，室温离心5min，弃上清。重复三次。取1mL的1×PBS悬浮菌体，移取2μL的菌液到载玻片上，在荧光显微镜下观察并记录结果。在488nm光激发下，pPCPA-GS115有绿色荧光出现，说明用α-凝集素连接的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的脂肪酶成功展示到了酵母表面(结果如图2所示)。

酵母展示CpLIP2脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯：

(1)酵母展示CpLIP2脂肪酶催化油酸乙酯和L-抗坏血酸反应，反应体系见下表3。

表3：

组分	体积
		油酸乙酯乳化液(50g/L)	200μL(终浓度15mM)
L-抗坏血酸	适量
		脂肪酶	1×PBS悬浮菌体(终浓度0.08g/mL)
50mM，pH6.5磷酸缓冲液	补至2.2mL

(2)反应置于40℃恒温培养箱，180rpm，反应2.5h后。

(3)向反应液中加入2mL的乙酸乙酯，再加入0.792g氯化钠(消除乳化层)，涡旋混匀3min，萃取油酸甲酯，然后5000rpm，离心5min。

(4)取上清，将上清液加热至77℃挥干乙酸乙酯，再加入500μL甲醇重新溶解。

(5)将200μL的反应产物进行液质联用仪(TSQ Quantum Ultra Thermoscientific)进行检测：

(a)液相色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(100mm*2.1mm，Particle Sz.1.9μm)，柱温：40℃，流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：甲醇；流速：300μL/min；流动相梯度见下表4。

表4：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0.00	95	5
0.50	95	5
			6.00	0	100
10.00	0	100
			10.10	95	5
12.00	95	5

(b)质谱检测条件：

电离方式：ESI；喷雾电压：±3.0kV；毛细管温度：300℃；源加热温度：350℃；鞘气压力：45arb；辅助气压力：8arb；扫描模式：全扫+二级；碰撞能：30V。

结果得到L-抗坏血酸油酸酯，附图1质谱图中439.1分子量的物质为[C₂₄H₃₉O₇]^-，即为L-抗坏血酸油酸酯的质谱峰。

转化产率和转化率的测定：

上述反应产物离心去细胞后取1mL上清液，用100％甲醇准确定容至10mL，然后经0.22μm有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。HPLC检测条件：UltiMate 3000高效液相色谱仪(Thermo scientific)，色谱柱：Thermo Hypersil GOLDC18柱(100mm*2.1mm，Particle Sz.5μm)，上样量60μL，流动相为甲醇/水＝90/10，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm。

产率计算公式如下：

产率＝L-抗坏血酸油酸酯的浓度/(L-抗坏血酸的浓度+L-抗坏血酸油酸酯的浓度)。

酯化反应效率：转化率＝L-抗坏血酸的浓度(反应后)/L-抗坏血酸的浓度(反应前)×100％。

通过上述方法检测计算，合成L-抗坏血酸油酸酯的产率和反应效率，产率和反应效率经初步估算，分别达到65.8％以上和70.3％以上。

实施例三：两种脂肪酶催化生成L-抗坏血酸油酸酯的实验探讨

文献报道Candida deformans来源的脂肪酶(CdLIP1)和Candida parapsilosis来源的脂肪酶(CpLIP2，即本发明所采用的脂肪酶)在高水活度的条件下，生物转化合成油酸甲酯和脂肪酸甲酯，但未报道催化L-抗坏血酸与油酸或油酸乙酯反应生成L-抗坏血酸油酸酯。

本实验利用毕赤酵母异源表达Candida deformans(CdLIP1)和Candidaparapsilosis脂肪酶(CpLIP2)，探讨两种不同酯合成类型的脂肪酶，在高水活度(a_w>0.9)的水/脂质双相介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的可行性。

将来源于Candida deformans(CdLIP1)的脂肪酶基因序列Lip1(GENBANKAJ428393.1)，按实施例一所述方法，将基因序列Lip1替代基因序列Lip2，其它操作方法相同，表达和纯化获得CdLIP1脂肪酶；然后按以下操作进行反应，检测由实施例一所得的CdLIP2脂肪酶和本例所得的CpLIP1脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯的活性。

1.CdLIP1脂肪酶和CpLIP2脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯的活性检测

(1)CdLIP1脂肪酶催化油酸和L-抗坏血酸反应，反应体系见下表5。

表5：

组分	体积
		油酸乳化液(50g/L)	200μL(终浓度16mM)
L-抗坏血酸	适量
		酶液	1mL
50mM，pH6.5磷酸缓冲液	补至2.2mL

(2)CpLIP2脂肪酶催化油酸乙酯和L-抗坏血酸反应，反应体系见下表6。

表6：

组分	体积
		油酸乙酯乳化液(50g/l)	200μL(终浓度15mM)
L-抗坏血酸	适量
		酶液	1mL
50mM，pH6.5磷酸缓冲液	补至2.2mL

(3)反应置于40℃恒温培养箱，180rpm，反应2.5小时后。

(4)向反应液中加入2mL的乙酸乙酯，再加入0.792g氯化钠(消除乳化层)，涡旋混匀3min，萃取油酸甲酯，然后5000rpm，离心5min。

(5)取上清，将上清液加热至77℃挥干乙酸乙酯，再加入500μL甲醇重新溶解。

(6)取产物进行HPLC检测，上样量60μL。HPLC检测条件：流动相为甲醇/水＝90/10，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm。

2.L-抗坏血酸油酸酯的质谱(LC-MS/MS)鉴定

将上述200μL的反应产物进行液质联用仪(TSQ Quantum Ultra Thermoscientific)分析。(1)液相色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(100mm*2.1mm，Particle Sz.1.9μm)，柱温：40℃，流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：甲醇；流速：300μL/min；流动相梯度见下表7。

表7：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0.00	95	5
0.50	95	5
			6.00	0	100
10.00	0	100
			10.10	95	5
12.00	95	5

(2)质谱检测条件：电离方式：ESI；喷雾电压：±3.0kV；毛细管温度：300℃；源加热温度：350℃；鞘气压力：45arb；辅助气压力：8arb；扫描模式：全扫+二级；碰撞能：30V。

3、实验结果：

(1)在毕赤酵母GS115中成功的组成型分泌表达了CdLIP1脂肪酶和CpLIP2脂肪酶，并且CpLIP2和CdLIP1均具有脂肪酶的活性。

(2)在高水活度(a_w>0.9)水/脂质双相介质中，CdLIP1脂肪酶催化L-抗坏血酸和油酸反应中，未检测到L-抗坏血酸油酸酯；而CpLIP2脂肪酶催化L-抗坏血酸和油酸乙酯反应，在产物中检测到了L-抗坏血酸油酸酯(如图1所示)。

(3)在高水活度(a_w>0.9)水/脂质双相介质中，CpLIP2脂肪酶催化合成L-抗坏血酸油酸酯，油酸乙酯浓度对L-抗坏血酸油酸酯的合成影响较大，提高油酸乙酯的浓度，可以增加L-抗坏血酸的转化率。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学、开平牵牛生化制药有限公司

<120> 一种在高水活度介质中催化合成L-抗坏血酸油酸酯的方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 465

<212> PRT

<213> Candida parapsilosis

<400> 1

Met Arg Tyr Phe Ala Ile Ala Phe Leu Leu Ile Asn Thr Ile Ser Ala

1 5 10 15

Phe Val Leu Ala Pro Lys Lys Pro Ser Gln Asp Asp Phe Tyr Thr Pro

20 25 30

Pro Gln Gly Tyr Glu Ala Gln Pro Leu Gly Ser Ile Leu Lys Thr Arg

35 40 45

Asn Val Pro Asn Pro Leu Thr Asn Val Phe Thr Pro Val Lys Val Gln

50 55 60

Asn Ala Trp Gln Leu Leu Val Arg Ser Glu Asp Thr Phe Gly Asn Pro

65 70 75 80

Asn Ala Ile Val Thr Thr Ile Ile Gln Pro Phe Asn Ala Lys Lys Asp

85 90 95

Lys Leu Val Ser Tyr Gln Thr Phe Glu Asp Ser Gly Lys Leu Asp Cys

100 105 110

Ala Pro Ser Tyr Ala Ile Gln Tyr Gly Ser Asp Ile Ser Thr Leu Thr

115 120 125

Thr Gln Gly Glu Met Tyr Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Asp Gln Gly Tyr

130 135 140

Tyr Val Val Thr Pro Asp Tyr Glu Gly Pro Lys Ser Thr Phe Thr Val

145 150 155 160

Gly Leu Gln Ser Gly Arg Ala Thr Leu Asn Ser Leu Arg Ala Thr Leu

165 170 175

Lys Ser Gly Asn Leu Thr Gly Val Ser Ser Asp Ala Glu Thr Leu Leu

180 185 190

Trp Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ser Gly Trp Ala Ala Ala Ile

195 200 205

Gln Lys Glu Tyr Ala Pro Glu Leu Ser Lys Asn Leu Leu Gly Ala Ala

210 215 220

Leu Gly Gly Phe Val Thr Asn Ile Thr Ala Thr Ala Glu Ala Val Asp

225 230 235 240

Ser Gly Pro Phe Ala Gly Ile Ile Ser Asn Ala Leu Ala Gly Ile Gly

245 250 255

Asn Glu Tyr Pro Asp Phe Lys Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Val Ser Pro

260 265 270

Leu Leu Ser Ile Thr Tyr Arg Leu Gly Asn Thr His Cys Leu Leu Asp

275 280 285

Gly Gly Ile Ala Tyr Phe Gly Lys Ser Phe Phe Ser Arg Ile Ile Arg

290 295 300

Tyr Phe Pro Asp Gly Trp Asp Leu Val Asn Gln Glu Pro Ile Lys Thr

305 310 315 320

Ile Leu Gln Asp Asn Gly Leu Val Tyr Gln Pro Lys Asp Leu Thr Pro

325 330 335

Gln Ile Pro Leu Phe Ile Tyr His Gly Thr Leu Asp Ala Ile Val Pro

340 345 350

Ile Val Asn Ser Arg Lys Thr Phe Gln Gln Trp Cys Asp Trp Gly Leu

355 360 365

Lys Ser Gly Glu Tyr Asn Glu Asp Leu Thr Asn Gly His Ile Thr Glu

370 375 380

Ser Ile Val Gly Ala Pro Ala Ala Leu Thr Trp Ile Ile Asn Arg Phe

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Pro Val Asp Gly Cys Gln His Asn Val Arg Ala Ser

405 410 415

Asn Leu Glu Tyr Pro Gly Thr Pro Gln Ser Ile Lys Asn Tyr Phe Glu

420 425 430

Ala Ala Leu His Ala Ile Leu Gly Phe Asp Leu Gly Pro Asp Val Lys

435 440 445

Arg Asp Lys Val Thr Leu Gly Gly Leu Leu Lys Leu Glu Arg Phe Ala

450 455 460

Phe

465