一种提高全细胞催化制备糠酸的方法
阅读说明：本技术 一种提高全细胞催化制备糠酸的方法 (Method for improving catalytic preparation of furoic acid by whole cells ) 是由 徐勇 杜根来 周鑫 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高全细胞催化制备糠酸的方法,其中,一种提高全细胞催化制备糠酸的方法,其包括,将糠醛液、能源物质、菌体通风搅拌；调节pH和温度,进行控温反应；加入所述能源物质后搅拌,即可；一种连续化糠酸生产工艺,其中：包括,将糠醛液、能源物质、菌体通风搅拌；调节pH和温度,进行控温反应；加入所述能源物质后搅拌；分离所述氧化葡萄糖酸杆菌,重复前述步骤。该方法获得的全细胞催化制备糠酸液,反应6h产品糠酸最高浓度即可达40g/L以上,糠酸单位产率超过6.5g/L/h,24h后糠酸累积浓度可达120g/L以上。(The invention discloses a method for improving the catalytic preparation of furoic acid by whole cells, wherein the method for improving the catalytic preparation of furoic acid by whole cells comprises the following steps of ventilating and stirring furfural liquid, energy substances and thalli; adjusting the pH and the temperature, and carrying out temperature control reaction; adding the energy substance and then stirring; a continuous furoic acid production process, wherein: comprises ventilating and stirring furfural liquid, energy substances and thalli; adjusting the pH and the temperature, and carrying out temperature control reaction; adding the energy substance and stirring; and (3) separating the gluconobacter oxydans, and repeating the steps. The total cell catalytic prepared furoic acid solution obtained by the method has the advantages that the highest concentration of furoic acid products can reach more than 40g/L after 6 hours of reaction, the unit yield of furoic acid exceeds 6.5g/L/h, and the cumulative concentration of furoic acid can reach more than 120g/L after 24 hours.)
技术领域
本发明属于生物工程和化学工程技术领域，具体涉及一种提高全细胞催化制备糠酸的方法。
背景技术
糠酸，又称α-呋喃羧酸、2-呋喃甲酸或呋喃甲酸，其是一种重要的有机合成原料，可转化生成酯、酰氯、酸酐、酰胺等衍生物。糠酸及其衍生物是合成α-呋喃甲酸酯类香料、药物、农药、增塑剂的重要原料，由糠酸催化加氢得到的四氢糠酸是用途非常广泛的医药中间体，可用于制备头孢类抗生素药物中间体和手性助剂，唑嗪类治疗高血压的药物和治疗***癌的药物合成等等。现有报道的糠酸制取方法主要是以糠醛为原料，采用Cannizzaro反应、金属催化法、电解法或生物法。非生物法存在着糠醛转化不完全、金属催化剂消耗、产品分离或者废水处理困难。目前，生物法的高选择性，温和反应性以及无污染特性愈发受关注，而生物催化法主要问题是糠醛和糠酸的累积会负面影响用于催化反应的生物细胞活性，从而影响糠酸生产效率以及细胞利用效率。因此，为满足工业使用需求仍需对生物催化生产糠酸工艺进行深化研究。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的产品糠酸产量低，菌体利用率低的问题；并针对产品糠酸累积造成的产物抑制问题，提出了一种提高全细胞催化制备糠酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种提高全细胞催化制备糠酸的方法，其包括，将糠醛液、能源物质、菌体通风搅拌；调节pH和温度，进行控温反应；加入所述能源物质后搅拌，即可。
作为本发明所述的提高全细胞催化制备糠酸的方法的优选方案，其中：所述糠醛液为含有糠醛或者包括糠醛的任意组合型反应底物；所述能源物质包括糖类、脂类、醇类、氨基酸中的一种或多种的碳源；所述菌体包括氧化葡萄糖酸杆菌，以及以它为出发菌株的一切遗传诱变或者基因重组菌株；其中，所述糠醛液、所述能源物质和所述菌体的细胞浓度比值为1:(0.1～0.5):(0.03～0.3)。
作为本发明所述的提高全细胞催化制备糠酸的方法的优选方案，其中：所述加入所述能源物质后搅拌，其为采用半连续或连续添料的操作方式。
作为本发明所述的提高全细胞催化制备糠酸的方法的优选方案，其中：所述通风搅拌，其为搅拌转速300～500r/min和通氧量0.1～3vvm，所述调节pH和温度，其为调节pH至5.0～6.5，调节温度至25～35℃。
作为本发明所述的提高全细胞催化制备糠酸的方法的优选方案，其中：所述菌体为氧化葡萄糖酸杆菌，所述能源物质为葡萄糖、山梨醇、甘油、甘露醇中的一种或几种。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种连续化糠酸生产工艺，其中：包括，将糠醛液、能源物质、菌体通风搅拌；调节pH和温度，进行控温反应；加入所述能源物质后搅拌；分离所述氧化葡萄糖酸杆菌，重复前述步骤。
作为本发明所述的连续化糠酸生产工艺的优选方案，其中：所述糠醛液为含有糠醛或者包括糠醛的任意组合型反应底物；所述能源物质包括糖类、脂类、醇类、氨基酸中的一种或多种的碳源；所述菌体包括氧化葡萄糖酸杆菌，以及以它为出发菌株的一切遗传诱变或者基因重组菌株；其中，所述糠醛液、所述能源物质和所述菌体的细胞浓度比值为1:(0.1～0.5):(0.03～0.3)。
作为本发明所述的连续化糠酸生产工艺的优选方案，其中：所述菌体为氧化葡萄糖酸杆菌，所述能源物质为葡萄糖、山梨醇、甘油、甘露醇中的一种或几种。
作为本发明所述的连续化糠酸生产工艺的优选方案，其中：所述加入所述能源物质后搅拌，其为采用半连续或连续添料的操作方式，所述分离，其为离心分离；所述通风搅拌，其为搅拌转速200～500r/min和通氧量0.1～3vvm，所述调节pH和温度，其为调节pH至5.0～6.5，调节温度至25～35℃。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种全细胞催化制备糠酸液，其为：糠醛液经菌体发酵24h后获得，糠酸累积浓度可达120g/L以上。
本发明的有益效果：
本发明利用氧化葡萄糖酸杆菌生物转化糠醛制备糠酸，与化学法相比，底物转化率高，糠酸产品纯度高并且废水处理简单；在辅助碳源的作用下有效的提高了糠醛的产量及产率，反应6h产品糠酸最高浓度即可达40g/L以上，糠酸单位产率超过6.5g/L/h；此外，催化菌体细胞可多次回收利用进行新一轮的糠酸制备反应，在24h内通过三次细胞回收再催化，糠酸累积浓度可超过120g/L；该方法具有很好的实用性和工业化前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例1中全细胞催化氧化糠醛制备糠酸的反应历程图；
图2为实施例2中全细胞催化氧化糠醛制备糠酸的反应历程图；
图3为实施例4中全细胞催化氧化糠醛制备糠酸的反应历程图；
图4为实施例10中全细胞催化氧化糠醛制备糠酸的反应历程图；
图5为实施例11中全细胞催化氧化糠醛制备糠酸的反应历程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其中糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。其催化反应历程如图1所示，图中，横座标表示反应时间(h)，主纵座标表示糠醛添加量(g/L)，次纵座标表示糠酸产量(g/L)。催化反应6h，累积糠酸浓度约为27g/L；催化反应24h，其糠酸终浓度约为40g/L。
实施例2：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。其催化反应历程如图2所示，图中，横座标表示反应时间(h)，主纵座标表示糠醛添加量(g/L)，次纵座标表示糠酸产量(g/L)。催化反应每6h后采用离心(在5000g条件下，离心10min)分离菌体与糠酸液，将菌体接入新的糠醛液，在相同条件下培养，共回收三次，完成总计四次催化反应，反应时间总计24h，其糠酸累积浓度约为38g/L。
实施例3：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L并同时添加1g/L葡萄糖，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛以及1g/L葡萄糖(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。其催化反应历程如图3所示，图中，横座标表示反应时间(h)，主纵座标表示糠醛添加量(g/L)，次纵座标表示糠酸产量(g/L)。催化反应6h，累积糠酸浓度约为33g/L；催化反应24h，其糠酸终浓度约为48g/L。
实施例4：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L并同时添加5g/L葡萄糖，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛以及5g/L葡萄糖(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。其催化反应历程如图3所示，图中，横座标表示反应时间(h)，主纵座标表示糠醛添加量(g/L)，次纵座标表示糠酸产量(g/L)。催化反应6h，糠酸累积浓度即可达到40g/L；催化反应24h，其糠酸终浓度约为58g/L。
实施例5：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L并同时添加5g/L葡萄糖，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为4g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛以及5g/L葡萄糖(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。催化反应6h，糠酸累积浓度约为25g/L；催化反应24h，其糠酸终浓度约为50g/L。
实施例6：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L并同时添加5g/L葡萄糖，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为12g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛以及5g/L葡萄糖(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。催化反应6h，糠酸累积浓度约为43g/L；催化反应24h，其糠酸终浓度约为60g/L。
实施例7：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L并同时添加5g/L山梨醇，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛以及5g/L山梨醇(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。催化反应6h，糠酸累积浓度约为35g/L；催化反应24h，其糠酸终浓度约为55g/L。
实施例8：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L并同时添加5g/L甘油，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛以及5g/L甘油(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-RadHPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。催化反应6h，糠酸累积浓度约为27g/L；催化反应24h，其糠酸浓度约为34g/L。
实施例9：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为10g/L并同时添加5g/L甘露醇，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加10g/L糠醛以及5g/L甘露醇(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。催化反应6h，糠酸累积浓度约为39g/L；催化反应24h，其糠酸终浓度约为62g/L。
实施例10：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为8g/L，并同时添加5g/L葡萄糖，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用半连续添料操作方式，每次添加8g/L糠醛与5g/L葡萄糖(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。其催化反应历程如图4所示，图中，横座标表示反应时间(h)，主纵座标表示糠醛添加量(g/L)，次纵座标表示糠酸产量(g/L)。催化反应每6h后采用离心(在5000g条件下，离心10min)分离菌体与糠酸液，将菌体接入新的糠醛液，在相同条件下培养，共回收三次，完成总计四次催化反应，反应时间总计24h，其糠酸累积浓度约为125g/L。
实施例11：
在3L的生物反应罐中，加入1L糠醛液，初始糠醛浓度为8g/L，并同时添加5g/L葡萄糖，使用30％的氢氧化钠调节反应体系pH 5.5，维持反应体系温度30℃、搅拌转速500r/min和通氧量1.0vvm，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度为8g/L进行细胞催化。采用连续添料操作方式，从1小时后开始每小时泵入(采用恒速蠕动泵)8g/L糠醛与5g/L葡萄糖(基于反应液体积)，并控制反应体系糠醛浓度不超过15g/L。反应过程中每小时从发酵罐取样1mL，所取样品通过高效液相色谱分析其糠醛及糠酸的含量，色谱条件：美国安捷伦1260型液相色谱，配置Bio-Rad HPX-87H色谱柱，示差检测器，柱温55℃，进样体积10μL；以5mmol/L的稀硫酸为流动相，流速0.6mL/min。其催化反应历程如图5所示，图中，横座标表示反应时间(h)，主纵座标表示糠醛添加量(g/L)，次纵座标表示糠酸产量(g/L)。催化反应每6h后采用离心(在5000g条件下，离心10min)分离菌体与糠酸液，将菌体接入新的糠醛液，在相同条件下培养，共回收三次，完成总计四次催化反应，反应时间总计24h，其糠酸累积浓度约为130g/L。
本发明采用氧化葡萄酸杆菌为催化菌种，在温和条件下实现糠醛的高效快速定向生物氧化为糠酸产品；通过添加辅助碳源可有效提高糠酸的产量及产率，此外，通过联合细胞回收技术可有效提高细胞利用率及糠酸总产量，实现24h内糠酸累积浓度达到120g/L以上。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。