一种用于核磁氟谱检测的探针及其在检测巯基类化合物中的应用
阅读说明：本技术 一种用于核磁氟谱检测的探针及其在检测巯基类化合物中的应用 (Probe for nuclear magnetic fluorine spectrum detection and application of probe in detection of sulfhydryl compounds ) 是由 李从刚 柴兆斐 吴琼 成凯 刘晓黎 姜凌 刘买利 于 2020-04-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于磁共振检测领域,具体涉及一种用于核磁氟谱检测的探针及其在检测巯基类化合物中的应用,针对复杂体系,如含有脂溶性待测物,可以利用探针A或者B在有机溶剂和水的混合体系中检测,其中有机溶剂可以为乙腈或二甲亚砜,体积占比在25-70%之间；对于水溶性待测物或生物材料,可以利用探针B在水相中检测；利用本发明的探针,可实现药物中的硫醇含量的检测,或者是活细胞内硫醇的识别及代谢观测,本发明提供的探针还可以与γ-谷氨酸-半胱氨酸混合后检测γ-谷氨酰转肽酶的活性。(The invention belongs to the field of magnetic resonance detection, and particularly relates to a probe for nuclear magnetic fluorine spectrum detection and application thereof in detecting mercapto compounds, wherein the probe A or B can be used for detecting in a mixed system of an organic solvent and water aiming at a complex system, such as a complex system containing a fat-soluble substance to be detected, wherein the organic solvent can be acetonitrile or dimethyl sulfoxide, and the volume ratio of the organic solvent to the dimethyl sulfoxide is 25-70%; for a water-soluble object to be detected or a biological material, the probe B can be used for detection in a water phase; the probe provided by the invention can be used for realizing the detection of the content of mercaptan in a medicament or the recognition and metabolism observation of mercaptan in living cells, and can also be mixed with gamma-glutamic acid-cysteine to detect the activity of gamma-glutamyl transpeptidase.)
技术领域
本发明属于磁共振检测领域，具体涉及一种用于核磁氟谱检测的探针及其在检测巯基类化合物中的应用，本发明的探针可以用于复杂体系中硫醇识别和定量检测。
技术背景
硫醇是一类广泛存在于生物体系、制药工程和合成领域的化合物，可以简写为RSH。在生物体系中，生物硫醇涉及到信号传递，氧化应激，代谢调控等，异常的硫醇水平往往伴随着疾病的发生。硫醇类药物如青霉胺、硫普罗宁和甲巯咪唑等也因不同的结构而发挥不同的疗效。但是一些硫醇污染也会使人身体不适，甚至引起严重的病症。因此开发硫醇检测方法对于临床诊断、药物代谢过程监测和污染评估都有十分重要的意义。但是由于这类化合物的化学性质相似，很多技术很难同时对多种硫醇做出特征性的响应。
核磁共振技术可以提供原子水平的结构和动力学信息，是一种潜在的非侵入性的检测方法。其中19F的核磁共振技术(19F NMR)由于磁旋比与1H相近(83.4％)、谱峰范围宽(～400ppm)，天然丰度高(100％)、无生物背景干扰等特点被用于生物过程的研究。但是目前应用在复杂体系中的19F NMR探针仍然十分稀少，还未能实现对生物体系中的内源硫醇识别。
发明内容
针对现有的技术不足，本发明的第一个目的在于提供了一种用于核磁氟谱检测的探针，其结构式如下：
本发明的另一个目的在于提供了用于核磁氟谱检测的探针的制备方法。
本发明的最后一个目的在于提供了用于核磁氟谱检测的探针在检测巯基类化合物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明利用含氟探针与硫醇快速特异性结合及氟对周围化学环境灵敏性，使每个待测硫醇产生唯一可分辨的19F NMR谱图，并建立相应的谱图库。
在接近中性或者碱性条件下(pH：6.0～9.0)，利用含氟砜基化合物与巯基特异性反应，得到相应的含氟硫酯，并采集相应的氟谱。针对复杂体系，如含有脂溶性待测物，可以利用探针A或者B在有机溶剂和水的混合体系中检测，其中有机溶剂可以为乙腈或二甲亚砜，体积占比在25-70％之间；对于水溶性待测物或生物材料，可以利用探针B在水相中检测。其中含氟探针结构为：
用于核磁氟谱检测的探针的制备方法：
(1)探针A的制备方法：
包括：将五氟吡啶、苯亚磺酸钠分散在N,N-二甲基乙酰胺(或者N,N-二甲基甲酰胺)中，并加入相转移催化剂四丁基溴化铵(或者四丁基氯化铵)提高亚磺酸盐的溶解性，在90-120℃中反应6-24小时，冷却到室温，加水，过滤得到白色固体探针A；
(2)探针B的制备方法
步骤1：将五氟吡啶、4-甲基苯亚磺酸钠分散在N,N-二甲基乙酰胺(或者N,N-二甲基甲酰胺)中，并加入相转移催化剂四丁基溴化铵(或者四丁基氯化铵)提高亚磺酸盐的溶解性，在90-120℃中反应6-24小时，冷却到室温，加水，过滤得到白色固体C，结构为
步骤2：将步骤1所得固体C与N-溴代丁二酰亚胺和过氧化二苯甲酰溶解在四氯化碳中，在50-80℃中反应6-24小时，冷却到室温，蒸走溶剂，纯化，得到白色固体化合物D，结构为
步骤3：将步骤2所得固体D与吡啶溶解在乙腈中，在60-90℃中反应2-24小时，冷却到室温，过滤，纯化得到淡黄色固体探针B。
核磁氟谱检测的探针在检测巯基类化合物中的应用，所述的应用过程包括：利用含氟探针与硫醇快速特异性结合及氟对周围化学环境灵敏性，使每个待测硫醇产生唯一可分辨的19F NMR谱图，并建立相应的谱图库。针对复杂体系，如含有脂溶性待测物，可以利用探针A或者B在有机溶剂和水的混合体系中检测，其中有机溶剂可以为乙腈或二甲亚砜，体积占比在25-70％之间；对于水溶性待测物或生物材料，可以利用探针B在水相中检测。包括药物中的硫醇含量的检测，或者是活细胞内硫醇的识别及代谢观测，本发明提供的探针还可以与γ-谷氨酸-半胱氨酸混合后检测γ-谷氨酰转肽酶的活性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次提供了用于用于核磁氟谱检测巯基类化合物的探针，该探针可用于脂溶性和水溶性巯基类化合物的检测，同时可实现复杂体系中的硫醇基检测，可完成对生物体系中的内源硫醇识别及代谢观测。
附图说明
图1探针A对脂溶性硫醇识别示例。
图2探针B对水溶性硫醇识别示例。
图3探针B对N-乙酰半胱氨酸泡腾片的含量检测示意图。
图4探针B对HeLa细胞内小分子硫醇的实时检测示意图。
图5探针B硫醇反应后对不同环境下的γ-谷氨酰转肽酶的检测示意图；
其中：A为修饰后的探针B在稀溶液中对不同活性γ-谷氨酰转肽酶的检测示意图；
B为修饰后的探针B在Hela和A2780细胞中对γ-谷氨酰转肽酶的检测示意图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例对本发明的内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
本发明实施例中所用的原料可以由市场购得，或可用本领域已知的方法合成得到。
实施例1：
探针A的合成
合成路线如下：
在氮气保护下，将苯亚磺酸钠(1.94g,11.83mmol),五氟吡啶(2.00g,11.83mmol)和四丁基溴化铵(1.14g,3.54mmol)溶于10mL N,N-二甲基乙酰胺，并在100℃的条件下搅拌(600转/分钟)20小时。反应液冷却至室温后缓慢加入去离子水30mL，抽滤，并用水洗涤3次得到产品。产品进一步用硅胶色谱柱分离纯化，真空干燥，得到探针A(2.70g,78.37％)。表征数据如下：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ(ppm):8.13(d,2H,J＝8.0Hz),7.78(t,1H,J＝7.5Hz),7.65(t,2H,J＝7.5Hz).13C NMR(CDCl3,126MHz)δ(ppm):145.24(dm,JCF＝250.6Hz),139.33,138.95(dm,JCF＝272.9Hz),135.84,133.26(t,JCF＝13.0Hz),130.07,128.64.19F NMR(CDCl3,471MHz)δ(ppm):-85.76(m,2F),-137.01(m,2F).HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcdforC11H6F4NO2S:292.0055；Found,256.0220.
实施例2：
探针B的合成
合成路线如下：
化合物C:在氮气保护下，将4-甲基苯亚磺酸钠(1.11g,6.21mmol),五氟吡啶(1.00g,5.92mmol)和四丁基溴化铵(0.57g,1.78mmol)溶于10mL N,N-二甲基乙酰胺，并在100℃的条件下搅拌(600转/分钟)20小时。反应液冷却至室温后缓慢加入去离子水15mL，抽滤，并用水洗涤3次得到产品。产品进一步用硅胶色谱柱分离纯化，真空干燥，得到化合物C(1.55g,85.8％)。表征数据如下：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ(ppm):7.99(d,2H,J＝7.5Hz),7.43(d,2H,J＝8.5Hz).13C NMR(CDCl3,126MHz)δ(ppm):147.50,144.41(dm,JCF＝250.5Hz),138.75(dm,JCF＝273.7Hz),136.839,133.60(t,JCF＝13.0Hz),130.68,128.69.19F NMR(CDCl3,471MHz)δ(ppm):-86.01(m,2F),-137.18(m,2F).HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcdforC12H8F4NO2S:306.0212；Found,306.0475.
化合物D：在氮气保护下，将化合物C(500mg,1.64mmol)，N-溴代丁二酰亚胺(306mg,1.72)和过氧化二苯甲酰(20mg,0.082mmol)溶解在15mL四氯化碳中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜，反应结束后，向反应液中加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥。将产品用硅胶色谱柱层析，分离纯化，真空干燥，得到化合物D(240mg,38.1％)。表征数据如下：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ(ppm):8.09(d,2H,J＝8.0Hz),7.66(d,2H,J＝8.0Hz),4.51(s,2H).13C NMR(CDCl3,126MHz)δ(ppm):146.15,144.30(dm,JCF＝241.9Hz),138.96,138.81(dm,JCF＝268.4Hz),133.01(t,JCF＝12.6Hz),130.59,129.23,30.87.19F NMR(CDCl3,471MHz)δ(ppm):85.46(m,2F),136.87(m,2F).HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcd for C12H7BrF4NO2S:383.9317；Found,383.9592.
探针B：在氮气保护下，将化合物D(105mg,0.27mmol)和无水吡啶(26mg,0.33mmol)溶解在3mL乙腈中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，冷却到室温，抽滤，并用二氯甲烷洗涤数次，得到淡黄色产品B(100mg,78.8％)。表征数据如下：1H NMR(MeOD-d4,600MHz)δ(ppm):9.12(d,2H,J＝6.0Hz),8.67(t,1H,J＝7.8Hz),8.20(m,4H),7.81(d,2H,J＝8.4Hz),6.03(s,2H).13C NMR(MeOD-d4,126MHz)δ(ppm):147.83,146.52,145.52(dm,JCF＝248.1Hz),142.47,141.91,140.38(dm,JCF＝271.2Hz),133.31(t,JCF＝12.6Hz),131.40,130.65,130.01,64.49.19F NMR(MeOD-d4,564MHz)δ(ppm):89.62(m,2F),139.61(m,2F).HRMS(ESI,m/z):[M-Br]+calcd for C17H11F4N2O2S:383.0472；Found,383.0619.
实施例3：
探针A和探针B在检测巯基类化合物中的应用：
本例包含探针A用于脂溶性硫醇分子的检测、探针B用于水溶性硫醇分子的检测、探针B用于硫醇药物的检测、探针B用于细胞内硫醇分子的动态变化监测，以及探针B与硫醇反应产物用于γ-谷氨酰转移酶活性的检测。
1.探针A作为脂溶性硫醇分子的检测探针：
脂溶性硫醇以4-甲基苯硫酚，叔丁硫醇，2-巯基丁烷，1-巯基丁烷，2-巯基丙烷，1-巯基丙烷，1,2-乙二硫醇，乙硫醇作为示例；溶剂选用磷酸缓冲液(100mM,pH＝7.40,30％乙腈，5％重水)。
将每种硫醇(10mM)与探针A(100μM)混合于核磁管后置于室温下1h，采集其核磁氟谱(564MHz)，并以三氟乙酸钠(-75.46ppm)作为内标，测定结果如图1所示。化合物A与脂溶性硫醇反应之后，出现明显的化学位移变化(化合物A与叔丁硫醇未完全反应)，并且不同的硫醇之间也表现出差异，说明化合物A在混合溶剂体系中具有良好的硫醇识别能力，可进一步用于复杂体系检测。
2.探针B作为水溶性硫醇分子的检测探针：
硫醇以6-巯基嘌呤，甲巯咪唑，青酶胺，硫普罗宁，N-乙酰半胱氨酸，1,2-乙二硫醇，2-巯基丙烷，1-巯基丙烷，乙硫醇，3-巯基丙酸，2-巯基乙醇，甲硫醇钠，二硫苏糖醇，谷胱甘肽，高半胱氨酸，半胱氨酸作为示例；溶剂选用磷酸缓冲液(100mM,pH＝7.40,5％重水)。
其中微溶于水的乙硫醇，1-巯基丙烷，2-巯基丙烷，1,2-乙二硫醇中含2％DMSO。
将每种硫醇(10mM)与探针B(100μM)混合于核磁管，除巯基活性较低的6-巯基嘌呤(溶解度低，为饱和溶液)和甲巯咪唑在室温下放置72h外，其它均放置于室温下1h，采集其核磁氟谱(564MHz)，并以三氟乙酸钠(-75.46ppm)作为内标，测定结果如图2所示。化合物B与硫醇反应之后，出现明显的化学位移变化(化合物A与甲巯咪唑和6-巯基嘌呤未完全反应)，并且不同的硫醇之间也表现出差异，说明探针B具有良好的硫醇识别能力，且水溶性良好，可进一步用于生物材料的检测。
3.探针B用于硫醇药物的检测
以N-乙酰半胱氨酸泡腾片(600mg/Tablet)中巯基药物含量测定为例。准确配置1mM的标准品N-乙酰半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸泡腾片的磷酸缓冲液(100mM,pH＝7.40)。稀释后将待测品(100μM)与探针B(400μM)的混合溶液(100mM,pH＝7.40,5％重水)在室温放置20分钟，测定标准品与药物的核磁氟谱。根据标准品与待测药物的氟信号积分强度比较，最终确定药品中巯基药物的含量。测试结果如图3和表1所示。利用该法所得结果与HPLC的测试结果相差很小，说明该法可以用于硫醇类药物含量的测定。
表1探针B对N-乙酰半胱氨酸泡腾片的含量检测结果与高效液相色谱(HPLC)结果对比
4.探针B用于Hela细胞内硫醇分子的动态变化检测
将经过胰酶/EDTA(0.25％/0.02％)分离，离心(200ⅹg)收集的细胞(数目约为4ⅹ107)再次分散在0.3mL的DEME培养液(90mM glucose，5mM HEPES，5％重水)，加入2mM探针B，在室温下连续采集其核磁氟谱，测试结果如图4所示。在24h小时检测的过程中，探针B逐渐消失初始；初始阶段出现了半胱氨酸，甘氨酸-半胱氨酸和谷胱甘肽的特征峰，随着时间的延长，最终甘氨酸-半胱氨酸和谷胱甘肽全部转化为半胱氨酸。显示出探针B可以用于细胞内硫醇的实时动态监测。
5.探针B与生物硫醇甘氨酸-半胱氨酸反应，用于检测细胞内γ-谷氨酰转移酶活性
含有巯基的γ-谷氨酸-半胱氨酸(3.0mM)与探针B(2.0mM)在磷酸缓冲溶液中磷酸缓冲液(100mM,pH＝7.40)反应，得到了化合物γ-Glu-Cys-Py4F，结构为该化合物在γ-谷氨酰转肽酶的作用下降解为Cys-Py4F，结构为两个化合物中的F信号表现出不同的化学位移，可用于检测细胞中的γ-谷氨酰转肽酶活性。
室温下，在γ-Glu-Cys-Py4F(100μM)的溶液中，分别加入25，50，100，200，500U/L的γ-谷氨酰转移酶，持续测试其核磁氟谱，结果如图5中A显示，探针γ-Glu-Cys-Py4F降解速率随着γ-谷氨酰转移酶活性升高而加快，说明该探针可以反映出γ-谷氨酰转移酶的不同活性；在不同的细胞系Hela和A2780中(细胞处理方法同4)，加入探针γ-Glu-Cys-Py4F(170μM)，室温下持续测试其核磁氟谱，结果如图5中B所示，探针γ-Glu-Cys-Py4F在Hela细胞中的降解速率明显较快，说明该法可以反映不同细胞中γ-谷氨酰转移酶活性。