一种鞣花单宁类化合物castacrenin D的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种鞣花单宁类化合物castacrenin D的制备方法及应用 (Preparation method and application of ellagitannin compound castacrenin D ) 是由 王亚凤 黄永林 何瑞杰 阳丙媛 刘章彬 于 2021-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鞣花单宁类化合物castacrenin D的制备方法及应用,属于中药成分的提取、分离纯化技术领域。其制备方法,包括如下步骤：步骤1：制备瓦山锥粗提物；步骤2：制备富含鞣花单宁类化合物的提取物；步骤3：制备鞣花单宁类化合物castacrenin D。本发明首次以瓦山锥叶子为原料提取分离得到castacrenin D,可以得到高含量(含量>2.3％)、高纯度(纯度>90％)的单体化合物,为瓦山锥植物资源的全面开发和深度利用提供新途径。(The invention discloses a preparation method and application of a ellagitannin compound castacrenin D, and belongs to the technical field of extraction, separation and purification of traditional Chinese medicine components. The preparation method comprises the following steps: step 1: preparing a crude extract of the warrior cone; step 2: preparing an extract rich in ellagitannins; and step 3: preparing the ellagitannin compound castacrenin D. According to the invention, castacrenin D is obtained by extracting and separating the leaves of the warrior cone serving as a raw material for the first time, so that a high-content (content is more than 2.3%) and high-purity (purity is more than 90%) monomer compound can be obtained, and a new way is provided for the comprehensive development and deep utilization of warrior cone plant resources.)
技术领域
本发明涉及一种鞣花单宁类化合物castacrenin D的制备方法及应用，属于中药成分的提取、分离纯化技术领域。
背景技术
鞣花单宁为多酚的一种，含有至少一个六羟基二苯甲酰基(简称HHDP)基团，比类黄酮酚更容易氧化，结构复杂极性较大，很多柱层析材料不吸附，在分离纯化方面存在较大难度。目前已知的鞣花单宁类化合物较少，多发现于壳斗科锥属植物的叶子中，该类化合物结构特殊，生物活性广泛，许多结构新颖的鞣花单宁类化合物具有抗肿瘤、抗炎生理活性，是一类具有较大开发应用前景的化合物。
瓦山锥为壳斗科锥属植物，本人发现瓦山锥叶子中含有大量的鞣花单宁类化合物，其中以水溶性鞣花单宁类化合物castacrenin D、栗木鞣花素、栎木鞣花素为主，此类混合物结构相近，极性较大，多种柱材料不吸附，在传统的提取分离过程中经常被忽略，较难得到有效分离。
castacrenin D，化学分子式为C48H34O30，分子量为1090，化学结构式如下：
目前，尚未有从瓦山锥中有制备castacrenin D的报道。鉴于此，有必要提供一种高含量的鞣花单宁类化合物castacrenin D的制备方法及应用，以克服现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种鞣花单宁类化合物castacreninD的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鞣花单宁类化合物castacreninD的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备瓦山锥粗提物
取瓦山锥树叶原料，清洗，干燥后粉碎，进行提取，过滤去掉残渣，滤液减压中低温浓缩，得到瓦山锥粗提物；
步骤2：制备富含鞣花单宁类化合物的提取物
将步骤1得到的瓦山锥粗提物经凝胶或者树脂吸附，收集水洗液，减压中低温浓缩后，得到富含鞣花单宁类化合物的提取物；
步骤3：制备鞣花单宁类化合物castacrenin D
将步骤2得到的提取物经中低压半制备液相纯化，收集保留时间为9.8min的信号峰，减压中低温浓缩，干燥后，即得到鞣花单宁类化合物castacrenin D。
其中，鞣花单宁类化合物castacrenin D的化学结构式如下：
本发明的鞣花单宁类化合物castacrenin D的制备方法的原理是：
本申请的发明人在实验研究中，偶然发现castacrenin D在瓦山锥树叶中的含量明显高于该植物其它部位或者在其它植物中的含量。于是，本申请的发明人不断改进提取方法和纯化手段，直至得到高含量、高纯度的castacrenin D单体化合物。具体如下：
本发明的步骤1中，利用相似相容的原理，采用极性较大的低浓度甲醇或者乙醇溶液能够更好的将瓦山锥树叶中的鞣花单宁类化合物提取出来，同时中小极性的化合物较少提取出，减少杂质的比例，有利于后续步骤的纯化。其中，瓦山锥树叶为新鲜树叶和/或干燥树叶。
本发明的步骤2中，步骤1中得到的瓦山锥粗提物除了目标化合物之外其他成分主要为黄酮和小分子酚酸类化合物，凝胶和树脂对此类化合物有较好的吸附作用，通过不同比例的醇水溶液洗脱可以使目标化合物与杂质实现较好的分离。
本发明的步骤3中，步骤2中得到的鞣花单宁类混合物其中几种主要成分结构相近、极性较大，柱层析方法较难得到有效分离，采用中低压半制备液相的方法，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：CH3CN-H2O，0min-40min，5-30％的CH3CN，经检测9.7-9.8min的信号峰为目标化合物，收集此时间段信号峰流份即得到高纯度的castacrenin D。
综上，本发明经过上述操作，可以得到高含量(含量>2.3％)、高纯度(纯度>90％)的单体化合物，为瓦山锥植物资源的全面开发和深度利用提供新途径。
本发明的高含量的鞣花单宁类化合物castacrenin D的制备方法的有益效果是：
1、本发明首次以瓦山锥叶子为原料提取分离得到castacrenin D，可以得到高含量(含量>2.3％)、高纯度(纯度>90％)的单体化合物，为瓦山锥植物资源的全面开发和深度利用提供新途径。
2、本发明的制备方法，操作快捷高效，对环境污染较小，原料廉价易得，易于大量生产，具有广阔的应用前景。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述粉碎的粒径20-60目。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述粒径，更有利于后续鞣花单宁类化合物castacrenin D的提取。
进一步，步骤1中，所述提取采用浸提、加热提取和超声提取中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，更有利于化合物castacreninD的提取，避免结构被破坏。
更进一步，所述浸提的具体方法是：在粉碎后的原料中，加入原料8-20倍重量的体积浓度为30％-50％的甲醇水溶液或者体积浓度为30％-50％的乙醇水溶液，于室温提取，每次1d，共2-4次。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，更有利于化合物castacreninD的提取，并保持原有生物活性。
更进一步，所述加热提取的具体方法是：在粉碎后的原料中，加入原料8-15倍重量的体积浓度为30％-50％的甲醇水溶液或者体积浓度为30％-50％的乙醇水溶液，于25℃-40℃提取，每次3h-7h，共2-4次。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，更有利于鞣花单宁类化合物castacrenin D的提取，低温避免castacrenin D结构被破坏。
更进一步，所述超声提取的具体方法是：在粉碎后的原料中，加入原料10-20倍重量的体积浓度为30％-50％的甲醇水溶液或者体积浓度为30％-50％的乙醇水溶液，采用功率为100W，频率为30kHz-80kHz超声提取，每次30-45min，共3次。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，更有利于鞣花单宁类化合物castacrenin D快速有效的提取。
进一步，步骤1、步骤2和步骤3中，所述减压中低温浓缩的压力均为40KPa-90KPa，温度均为≤45℃。
采用上述进一步的有益效果是：castacrenin D水溶液高温易水解，长时间接触空气易氧化，采用上述参数的减压中低温浓缩，可以大大降低castacrenin D被水解和氧化的可能。
进一步，步骤2中，所述凝胶为Sephadex LH-20，所述树脂为小孔树脂Diaion HP20ss。
采用上述进一步的有益效果是：这两种层析柱材料能够较好的使鞣花单宁类化合物与其他化合物分离，有利于后续步骤的纯化。
更进一步，所述Sephadex LH-20的规格为6cm×80cm，填料粒径为100μm-163μm。
采用上述更进一步的有益效果是：上述Sephadex LH-20的规格和填料粒径较适合瓦山锥中鞣花单宁类与黄酮小分子酚酸类化合物的分离。
上述Sephadex LH-20可以市售购买，如可以购自美国GE公司。
更进一步，所述小孔径树脂Diaion HP20ss的规格为5cm×80cm，填料粒径为75μm-150μm。
采用上述更进一步的有益效果是：Diaion HP20ss的规格和填料粒径较适合瓦山锥中鞣花单宁类与黄酮小分子酚酸类化合物的分离。
上述小孔径树脂Diaion HP20ss可以市售购买，如可以购自日本三菱化学。
进一步，步骤2中，所述水洗液为收集到的2-3倍柱体积的纯水洗脱剂。
采用上述进一步的有益效果是：能够较大程度的使鞣花单宁类化合物得到富集。
进一步，步骤3中，所述中低压半制备液相纯化的方法为：色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：CH3CN-H2O，0min-40min，5-30％的CH3CN；流速：2.0mL/min；检测波长：254nm。
采用上述进一步的有益效果是：可以得到纯度较高的castacrenin D。
进一步，步骤3中，所述干燥的方法真空干燥或者冷冻干燥，其中，所述真空干燥的温度≤45℃，时间为10h-15h，真空度为0-30KPa；所述冷冻干燥的温度为-50℃，时间为6h-12h。
采用上述进一步的有益效果是：干燥的castacrenin D有利于储存，防止水解、氧化，生物活性改变。
本发明的目的之二，是提供上述鞣花单宁类化合物castacrenin D在制备抗氧化产品、美白药物或者化妆品中的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述制备得到的鞣花单宁类化合物castacrenin D在制备抗氧化产品、美白药物或者化妆品中的应用。
本发明进行了鞣花单宁类化合物castacrenin D体外酶活实验的研究，结果显示，castacrenin D抑制酪氨酸酶的IC50为0.17mg/mL，与阳性对照品曲酸抑制酪氨酸酶的IC50值0.14mg/mL相当，castacrenin D清除DPPH自由基IC50为0.039mg/mL，与Vc清除DPPH自由基IC50值0.012mg/mL相当。当样品浓度大于等于0.08mg/mL时，castacrenin D的DPPH自由基清除率明显高于Vc。因此本发明的castacrenin D可用于制备抗氧化产品、美白药物或者化妆品。
本发明的鞣花单宁类化合物castacrenin D在制备抗氧化产品、美白药物或者化妆品中的应用的有益效果是：
本发明的castacrenin D可用于制备抗氧化产品、美白药物或者化妆品，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的步骤2得到的鞣花单宁类化合物的HPLC谱图。
图2为本发明实施例1的步骤3制备castacrenin D的HPLC谱图。
图3为本发明实施例1制备得到的castacrenin D的1H-NMR谱。
图4为本发明实施例1制备得到的castacrenin D的13C-NMR谱。
图5为本发明对比例1的步骤2得到的鞣花单宁类化合物的HPLC谱图。
图6为本发明对比例1的步骤3制备castacrenin D的HPLC谱图。
图7为本发明对比例2的步骤2得到的鞣花单宁类化合物的HPLC谱图。
图8为本发明对比例2的步骤3制备castacrenin D的HPLC谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的castacrenin D的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备瓦山锥粗提物
取1kg干燥的瓦山锥树叶原料，清洗，干燥打粉过40目筛子，加入原料15倍重量的体积百分数为30％的甲醇水溶液，超声提取30min，功率为100W，频率为40kHz，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为30％的甲醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为30％的甲醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第三次过滤，得第三次滤液。合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于50KPa，温度为45℃减压中低温浓缩至浸膏，得到瓦山锥粗提物。
步骤2：制备富含鞣花单宁类化合物的提取物
取小孔径树脂Diaion HP20ss加压装柱，其层析柱规格为5cm×80cm，填料粒径为75μm-150μm。先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉。
将步骤1得到的瓦山锥粗提物加水溶解成溶液，溶液缓慢滴加上样，上样完毕用3倍柱体积的去离子水进行洗脱，洗脱速度为5mL/min。收集3倍柱体积的纯水洗脱剂作为水洗液，于80KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，得到富含鞣花单宁类化合物的提取物。HPLC谱图如图1所示。
步骤3：制备鞣花单宁类化合物castacrenin D
将步骤2得到的提取物经中低压半制备液相纯化，所述中低压半制备液相的方法为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：CH3CN-H2O，0min-40min，5-30％的CH3CN；流速：2.0mL/min；检测波长：254nm。收集保留时间为9.8min的信号峰。HPLC谱图如图2所示。
于80KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，于-50℃冷冻干燥6h，即得到鞣花单宁类化合物castacrenin D。
结构鉴定：
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ：7.33，6.73，6.67，6.57(each 1H，s，arom.-H)，5.63(1H，d，J＝7.9Hz，H-5)，5.32(1H，s，H-1)，5.30(1H，d，J＝7.9Hz，H-4)，5.26(1H，br s，H-2)，5.01(1H，d，J＝7.9Hz，H-3)，4.73(1H，dd，J＝12.5，1.8Hz，H-6a)，3.98(1H，d，J＝12.5Hz，H-6b)。1HNMR谱如图3所示。
13C NMR(125MHz，CD3OD)δ：41.2(C-1)，66.0(C-6)，69.8(C-4)，71.2(C-5)，72.7(C-3)，78.4(C-2)，107.1，108.7，110.1，110.1，111.7，112.8，113.6，114.2，114.4，115.0，116.5，117.0(HHDP，TP-C-2，6)，121.1，125.2，125.8，126.2，127.6，128.4(HHDP，TP-C-1)，135.4，135.6，136.4，136.8，136.8，137.6(HHDP，TP-C-4)，143.2，143.3，144.1，144.2，144.3，144.6，144.7，144.8，145.1，145.4，145.6，147.2(HHDP，TP-C-3，5)，165.7，166.5，166.7，166.9，169.1，170.1(HHDP，TP-C-7)。13C NMR谱如图4所示。
1H NMR和13C NMR波普数据与参考文献一致，故鉴定此化合物为castacrenin D。
纯度检测：采用HPLC分析法检测化合物纯度。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：CH3CN-H2O，0min-40min，5-30％的CH3CN；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm。采用面积归一法测得本实施制备的castacrenin D的纯度为92.4％。
实验例：castacrenin D抑制酪氨酸酶抑制活性研究。
以1mg/mL的L-多巴为底物，现配现用，将购买的蘑菇酪氨酸酶配制成酶活力为100U/mL的酶溶液备用，以曲酸为阳性对照。在酶反应组和空白组分别加入25μL浓度为0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.031mg/mL实施例1制备得到的castacrenin D溶液和磷酸缓冲液，再各自加入25μL酪氨酸酶，37℃孵育5min后，再各自加入100μL 1mg/mL的L-多巴溶液，37℃保温箱反应5min后，在波长475nm下测定吸光度，反应组对照和空白对照以失活酶代替活性酶。重复上述实验3次。按照下述公式计算酶活抑制率，
酪氨酸酶抑制率(％)＝[1-(A反应组-A反应对照)/(A空白组-A空白对照)]，其中，A反应组为加入样品和酪氨酸酶组在475nm波长下测定的吸光值，A反应对照为加入样品和酪氨酸失活酶组在475nm波长下测定的吸光值，A空白组为加入缓冲液和酪氨酸酶组在475nm波长下测定的吸光值，A空白对照为加入缓冲液和酪氨酸失活酶组在475nm波长下测定的吸光值，所有反应管中均有L-多巴。
经IC50计算软件可得castacrenin D抑制酪氨酸酶活性的IC50值为0.17mg/mL，阳性对照品曲酸的IC50值为0.14mg/mL。根据实验结果可知本实施例制备的castacrenin D具有较好的抑制酪氨酸酶活性，在美白产品的开发和应用上具有较大前景。
实施例2
步骤1：制备瓦山锥粗提物
取1.5kg干燥的瓦山锥树叶原料，清洗，干燥打粉过20目筛子，加入原料20倍重量的体积百分数为40％的甲醇水溶液，于室温浸泡提取1天，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为40％的甲醇水溶液，室温浸泡提取1天，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为40％的甲醇水溶液，于室温浸泡提取1天，第三次过滤，得第三次滤液。合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于50KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，得到瓦山锥粗提物。
步骤2：制备富含鞣花单宁类化合物的提取物
取Sephadex LH-20加压装柱，其层析柱规格为6cm×80cm，填料粒径为100μm-163μm。先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉。
将步骤1得到的瓦山锥粗提物加水溶解成溶液，溶液缓慢滴加上样，上样完毕用3倍柱体积的去离子水进行洗脱，洗脱速度为5mL/min。收集3倍柱体积的纯水洗脱剂作为水洗液，于80KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，得到富含鞣花单宁类化合物的提取物。
步骤3：制备鞣花单宁类化合物castacrenin D
将步骤2得到的提取物经中低压半制备液相纯化，所述中低压半制备液相的方法为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：CH3CN-H2O，0min-40min，5-30％的CH3CN；流速：2.0mL/min；检测波长：254nm。收集保留时间为9.8min的信号峰。于80KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，于45℃真空干燥10h，即得到鞣花单宁类化合物castacrenin D。
结构鉴定同实施例1。
纯度鉴定同实施例1，检测纯度为90.5％。
本实施例还提供上述制备得到的castacrenin D在美白产品中的应用。
实施例3
本实施例的castacrenin D的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备瓦山锥粗提物
取1kg干燥的瓦山锥树叶原料，清洗，干燥打粉过40目筛子，加入原料10倍重量的体积百分数为30％的乙醇水溶液，超声提取30min，功率为100W，频率为40kHz，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料10倍重量的体积百分数为30％的乙醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料10倍重量的体积百分数为30％的乙醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第三次过滤，得第三次滤液。合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于50KPa，温度为45℃减压中低温浓缩至浸膏，得到瓦山锥粗提物。
步骤2：制备富含鞣花单宁类化合物的提取物
取小孔径树脂Diaion HP20ss加压装柱，其层析柱规格为5cm×80cm，填料粒径为75μm-150μm。先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉。
将步骤1得到的瓦山锥粗提物加水溶解成溶液，溶液缓慢滴加上样，上样完毕用3倍柱体积的去离子水进行洗脱，洗脱速度为5mL/min。收集3倍柱体积的纯水洗脱剂作为水洗液，于80KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，得到富含鞣花单宁类化合物的提取物。HPLC谱图如图1所示。
步骤3：制备鞣花单宁类化合物castacrenin D
将步骤2得到的提取物经中低压半制备液相纯化，所述中低压半制备液相的方法为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：CH3CN-H2O，0min-40min，5-30％的CH3CN；流速：2.0mL/min；检测波长：254nm。收集保留时间为9.8min的信号峰。于80KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，于-50℃冷冻干燥12h，即得到鞣花单宁类化合物castacrenin D。
纯度鉴定同实施例1，检测纯度为90.9％。
本实施例还提供上述制备得到的castacrenin D在美白产品中的应用。
对比例1
与实施例1区别的是，步骤1中的提取溶剂更换为体积分数为70％的丙酮水溶液，其余均相同。对比例1的具体实施步骤为：
步骤1：制备瓦山锥粗提物
取1kg干燥的瓦山锥树叶原料，清洗，干燥打粉过40目筛子，加入原料15倍重量的体积百分数为70％的丙酮水溶液，超声提取30min，功率为100W，频率为40kHz，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为70％的丙酮水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为70％的丙酮水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第三次过滤，得第三次滤液。合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于50KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，得到瓦山锥粗提物。
步骤2：制备富含鞣花单宁类化合物的提取物
同实施例1，得到富含鞣花单宁类化合物的提取物。HPLC谱图如图5所示。
步骤3：制备目标化合物
与实施例1相同中低压半制备液相条件。9.8min无明显色谱峰，HPLC谱图如图6所示。
由图5和图6可知，采用高浓度的丙酮水溶液提取，得到的粗提物总体极性偏小，瓦山锥叶子中鞣花单宁类化合物并不能得到有效的提取，经过树脂的纯化除去了其它类型的化合物，但是经过中低压半制备液相castacrenin D保留时间区域没有明显的色谱峰，很难经过半制备液相纯化得到单体化合物。
对比例2
与实施例2区别的是，将步骤2中的Sephadex LH-20更换为MCI gel CHP 20P其余均相同。对比例2的具体实施步骤为：
步骤1：制备瓦山锥粗提物
同实施例1。
步骤2：提取物的初步纯化
取MCI gel CHP 20P加压装柱，其层析柱规格为5cm×100cm，填料粒径为75μm-150μm。先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉。
将步骤1得到的瓦山锥粗提物加水溶解成溶液，溶液缓慢滴加上样，上样完毕用3倍柱体积的去离子水进行洗脱，洗脱速度为5mL/min。收集3倍柱体积的纯水洗脱剂作为水洗液，于80KPa，温度为45℃减压浓缩至浸膏，得到纯化后的提取物。HPLC谱图如图7所示。
步骤3：制备目标化合物
与实施例1相同中低压半制备液相条件。9.8min无明显色谱峰，HPLC谱图如图8所示。
由图7和图8可知，瓦山锥叶子中成分复杂，经过MCI gel CHP 20P的纯化只能除去小极性化合物，并不能很好除去中等极性化合物，经过中低压半制备液相色谱可知，杂质较多，castacrenin D保留时间区域没有明显的色谱峰，很难经过半制备液相纯化得到单体化合物。
对比例3
与实施例1区别的是，将步骤1中的瓦山锥树叶原料更换为瓦山锥树皮，其余均相同。对比例3的具体实施步骤为：
步骤1：制备瓦山锥粗提物
取1kg干燥的瓦山锥树皮原料，清洗，干燥打粉过40目筛子，加入原料15倍重量的体积百分数为30％的甲醇水溶液，超声提取30min，功率为100W，频率为40kHz，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为30％的甲醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料15倍重量的体积百分数为30％的甲醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz，超声提取30min，第三次过滤，得第三次滤液。合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于50KPa，温度为45℃减压中低温浓缩至浸膏，得到瓦山锥树皮粗提物。
步骤2：制备富含鞣花单宁类化合物的提取物
同实施例1。
步骤3：制备鞣花单宁类化合物castacrenin D
同实施例1，得到鞣花单宁类化合物castacrenin D。
经检测，本对比例得到的castacrenin D纯度为81.5％，含量仅为0.37％。由实验结果可知瓦山锥树叶与树皮中的主要化学成分不同，各个化合物的含量也不同，树皮中虽然也含有castacrenin D，但是含量明显低于树叶，相同方法得到的castacrenin D纯度较低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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