阅读说明：本技术 一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法 (Method for improving extraction efficiency of intracellular pullulanase ) 是由 祝冬君 王施岚 德青美朵 杨梦莲 沈微 陈献忠 杨海泉 夏媛媛 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法,属于微生物和酶工程技术领域。本发明采用两种特殊试剂对巴斯德毕赤酵母突变株处理,首先将重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138与10×试剂D反应,随后在冰水中放置,再加入10×试剂E反应。离心收集细胞后用柠檬酸缓冲液悬浮细胞进行超声波破碎。经过两种试剂处理的细胞经超声波处理6 min就将细胞全部破碎,破碎液中酶活保留在85%以上。使用本发明所提供的方法及专用处理液可以大幅度减少细胞破碎所需要消耗的电力等成本,减少设备占用时间。(The invention relates to a method for improving extraction efficiency of intracellular pullulanase, which belongs to the technical field of microorganism and enzyme engineering, and adopts two special reagents to treat a pichia pastoris mutant strain, wherein a recombinant pichia pastoris mutant GS115/pPICK-BdP5 WB138 is firstly reacted with a reagent D10 ×, then placed in ice water, and then a reagent E10 × is added for reaction, after cells are centrifugally collected, the cells are suspended by a citric acid buffer solution for ultrasonic crushing, the cells treated by the two reagents are completely crushed after being treated by ultrasonic for 6min, and the enzyme activity in the crushing solution is kept above 85 percent.)

一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，具体采用两种特殊试剂对巴斯德毕赤酵母突变株处理，属于微生物和酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶（pullulanase）专一性水解淀粉分子的1,6-糖苷键，在淀粉糖生产的糖化工艺中有广泛的应用。本课题组在前期工作中构建了一株高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母，进一步通过诱变育种获得了一株在酸性条件下高产普鲁兰酶的突变株：巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138[详见：王兵波, 沈微, 钱灵紫等. 一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达. 食品与发酵工业，2016, 42(7): 9-15；德青美朵，朱新文，解修兵，毛岸，沈微，陈献忠，樊游等“一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体”，专利申请号：201710825655.6]。

采用上述巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138（以下简称WB138）发酵制取普鲁兰酶时可以在pH4.0的酸性条件进行发酵，不容易发生染菌问题，发酵水平也比较高。但这株菌发酵得到的普鲁兰酶是胞内酶，最后需要通过细胞破碎才能得到可以使用的产品。毕赤酵母具有坚固的细胞壁，细胞破碎有一定的困难，采用超声波方法破碎时一般需要进行30 min左右才能将细胞完全破碎。采用可以裂解酵母细胞壁的酶可以降低细胞壁强度，有利于酵母的破壁。蜗牛酶、酵母溶壁酶（Zymolyase）等经常被用于酵母细胞破壁以提取酵母胞内蛋白，但这些酶价格较高，一般只能用于实验研究难以用于工业酶制剂的生产。

本发明公开一种采用价格低廉的食品工业用酶制剂对巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138细胞进行预处理的方法，经过处理的细胞更容易破碎同时得到的酶液也基本稳定。

发明内容

本发明的目的是，克服上述不足之处，提供一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，处理后的细胞更容易被破碎，提取得到的普鲁兰酶比较稳定。

本发明的技术方案，一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，在重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138发酵终点，离心收集细胞，用水悬浮细胞，先后用两种试剂对细胞进行前处理，再进行细胞破碎。

上述重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138公开于申请号201710825655.6，发明名称：一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体，（德青美朵，朱新文，解修兵，毛岸，沈微，陈献忠，樊游）。

具体步骤如下：

（1）对重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138进行发酵，在发酵终点以5000r/min离心2min收集细胞，所获细胞用水悬浮，悬浮液体积控制为原发酵液体积的0.8倍；

（2）在步骤（1）细胞悬液中加入原发酵液1/10体积的10×试剂D，混合后在45℃下反应15min；随后将细胞悬液放入冰水混合物中使悬液迅速冷却，维持10min，再在4℃放置3h；

（3）在步骤（2）所得反应液中继续加入步骤（1）所得原发酵液1/10体积的10×试剂E，混合，随后在60℃反应20min；

（4）以5000r/min离心2min收集细胞；用20mmol/L、pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液悬浮细胞，控制体积与原发酵液相同；在250 W、1s间隔1s条件下进行超声波破碎，20mL上述细胞悬液完全破碎时间不超过6 min。

进一步地，步骤（2）所述10×试剂D的配方如下：12.5mM Tris-HCl，碱性蛋白酶50U/mL，菠萝蛋白酶 50U/mL，FeSO₄ 2mmol/L，甘油20g/L，乙醇20g/L，pH 7.4-7.6。

步骤（2）所述10×试剂D的配置方法如下：在1L容器中加入800mL去离子水，加入1.51g Tris三羟甲基氨基甲烷，0.1mol/L的盐酸溶液50mL，混合；再加入FeSO₄·H₂O 0.56g，甘油20g，乙醇20g，混合，加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶各50000 U，搅拌混合后加水至1L；最后采用pH调节剂调节pH为7.4-7.6。

所述pH调节剂具体为HCl或NaOH溶液。

步骤（3）所述10×试剂E具体为： 200mM柠檬酸-柠檬酸钠，80mmol/L Na₂SO₄，70mmol/L KCl，10mmol/L Na₂SO₃，5mmol/L KH₂PO₄，pH3.4-3.6。

步骤（3）所述10×试剂E的配置方法如下：在1L容器中加入800mL去离子水，加入一水合柠檬酸33.6g，二水合柠檬酸三钠11.8g，混合溶解；再加入无水硫酸钠11.4g，氯化钾5.2g，七水合亚硫酸钠2.5g，磷酸二氢钾0.7g，搅拌溶解；最后采用pH调节剂调节pH为3.4-3.6。

所述pH调节剂具体为柠檬酸或柠檬酸钠。

本发明的有益效果：在巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138发酵制备重组普鲁兰酶时，使用本发明提供的方法及专用处理液处理发酵液中的细胞，可以大幅度缩短超声破碎时间，减少设备占用时间，节约细胞破碎所需要消耗的电力等成本。

经过本发明处理的细胞所需超声波处理时间缩短为6min以内，酶活损失在15%以内，而未经本方法处理的细胞破碎需要30min以上。

具体实施方式

以下实施例中碱性蛋白酶为杜邦杰能科 P100 洗涤剂专用液体碱性蛋白酶。菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶均为南宁庞博生物工程有限公司产品。实施例中涉及到的其它酶：葡聚糖酶为山东苏柯汉生物工程有限公司产品，几丁质酶购自江苏锐阳生物技术有限公司。其余试剂均为国产分析纯试剂。

所使用发酵罐为上海百伦生物科技有限公司产品BLBIO-5GJ。

所使用菌种及普鲁兰酶酶活检测等方法同文献（德青美朵，朱新文，解修兵，毛岸，沈微，陈献忠，樊游. 一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体. 申请号：201710825655.6）

超声波破碎方法如下：取细胞悬液20mL，将超声波细胞破碎仪的金属头没入上述酵母细胞悬液中，开启细胞破碎仪，控制功率为250W，开始破碎，破碎条件为1秒间隔1秒破碎至细胞悬液澄清。超声波破碎仪为Scientiz-II D型超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司。经过超声破碎处理的细胞悬液用普通可见光分光光度计，在波长600 nm下检测OD，即OD₆₀₀。本发明所述细胞完全破碎（或者称为细胞悬液澄清）的标准：当破碎液OD₆₀₀达到超声破碎前的1/10时，认定为细胞被完全破碎。

通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

按文献（德青美朵，朱新文，解修兵，毛岸，沈微，陈献忠，樊游. 一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体. 申请号：201710825655.6）所述方法5进行发酵。发酵终点，5,000 r/min离心2 min收集细胞，所获细胞用自来水悬浮，悬浮液体积控制为原发酵液体积的0.8倍。再按原发酵液1/10体积在上述细胞悬液中加入一种10×试剂D，混合后在45℃下反应15 min。随后将细胞悬液放入冰水混合物中使悬液迅速冷却，维持10 min。在4℃放置3 h。再按原发酵液1/10体积，加入10×试剂E混合后在60 ℃反应20 min。离心收集细胞后用20 mmol/L、pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液悬浮细胞，控制体积与原发酵液相同，进行超声波破碎。破碎液进行酶活检测。经过两种试剂处理的细胞超声波处理6 min就可以将细胞全部破碎，破碎液中酶活保留在85%以上。

上述10×试剂D的配方如下：12.5 mM Tris-HCl，碱性蛋白酶 50 U/mL，菠萝蛋白酶 50 U/mL，FeSO₄ 2 mmol/L，甘油 20 g/L，乙醇20 g/L，pH 7.5±0.1。

上述10×试剂E具体为： 200 mM柠檬酸-柠檬酸钠，80 mmol/L Na₂SO₄，70 mmol/LKCl，10 mmol/L Na₂SO₃，5 mmol/L KH₂PO₄ ，pH3.5±0.1。

上述10×试剂D的配制方法如下：在1 L容器中加入800 mL去离子水，加入1.51 gTris（三羟甲基氨基甲烷），0.1 mol/L的盐酸溶液50 mL，混合。再加入FeSO₄.H₂O 0.56 g，甘油（丙三醇）20 g，乙醇20 g，混合，加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶各50000 U，搅拌混合后加水至1 L，如果pH有偏差则用HCl或NaOH调整pH至7.5±0.1。配置完成后一般分装成20 mL一份冷冻保藏。

上述10×试剂E配置方法如下：在1 L容器中加入800 mL去离子水，加入一水合柠檬酸 33.6 g，二水合柠檬酸三钠 11.8 g，混合溶解。再加入：无水硫酸钠 11.4 g，氯化钾5.2 g，七水合亚硫酸钠：2.5 g， 磷酸二氢钾 0.7 g，搅拌溶解。如果pH偏离则添加柠檬酸或柠檬酸钠调整pH至3.5±0.1。

应用实施例1 本发明与一般超声波细胞破碎方法的比较

采用一般超声波细胞破碎方法处理细胞，并与本发明实施例1进行比较，所得结果如表1所示。

表1

注：未经处理的细胞是指发酵液离心收集细胞后用自来水悬浮细胞，再次离心收集细胞后用20mmol/L、pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液悬浮的细胞，控制细胞悬浮液体积与原发酵液相同，然后用于超声破碎实验。

由表1可见，未经处理的细胞，采用超声波方法破碎，大约需要34 min才能达到细胞悬液OD下降至1/10的目标。而采用本发明方法处理的细胞，只需要经过5 min就可以实现细胞的破碎。当然采用本发明方法也有不足的地方，主要是酶活有一定的损失，大约损失13%。

实施例2 本发明方法与其它方法的比较

本发明实施例1所得酶活和酶液保存率与单一酶处理方法的比较如表2所示。

不同pH条件的实验方法如下：发酵液离心收集细胞，用自来水悬浮细胞，按1/10体积，添加不同pH的10×缓冲液。所有的固体酶均用自来水溶解，酶液均配置成所使用酶活的100倍，并按1/100体积添加。其中几丁质酶和葡聚糖酶的最终浓度为15 U/mL，菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶均为5 U/mL。pH9.0采用0.04 mol/L 巴比妥缓冲液，pH6.5、pH5.5、pH3.5采用0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液，配置方法参考文献[诸葛健 王正祥. 工业微生物实验技术手册. 北京: 轻工业出版社，1994：683-688.]。pH 7.5为12.5 mM Tris-HCl缓冲液，配置方法同本发明10×试剂D，但只添加Tris和盐酸，不添加金属盐等其它成分。

表2

由表2可见，几丁质酶、葡聚糖酶、碱性蛋白酶或几丁质酶与葡聚糖酶合用，都不能有效降低酵母WB138细胞壁的强度，经过酶处理的细胞破碎需要的时间与未经处理的细胞差异不大。菠萝蛋白酶可以有效破坏WB138细胞壁的强度，经过这种酶处理的细胞破碎所需要的时间由30 min减少为5~6 min，本发明研究过程中实验了多种工业酶制剂，结果显示在价格低廉的工业酶制剂中只有菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶可以有效破坏WB138的细胞壁强度，达到大幅度减少超声破碎时间的目的。

菠萝蛋白酶用于WB138破碎时最大的问题是破碎液中普鲁兰酶的损失很大，损失率接近90%，显然很难有实用价值。在同样条件下，木瓜蛋白酶的破壁效果比菠萝蛋白酶更好但所获细胞破碎液中普鲁兰酶酶活损失更大。本发明进一步在20~60℃范围内改变温度进行上述实验，结果与表2基本一致，即只有pH在7.5以下，使用菠萝蛋白酶时，细胞破碎时间有大幅度下降，但同时所获破碎液中普鲁兰酶酶活大幅度下降，酶活保持率均在20%以下，基本没有工业应用的价值。采用木瓜蛋白酶替代菠萝蛋白酶获得的结果基本类似，只是获得的酶液的酶活更低。采用本发明方法时如果用木瓜蛋白酶替代菠萝蛋白酶，处理后的细胞超声破细胞所需时间一般缩短到3 min以内，但所获酶液的酶活保存率均不到30%，增加或减少木瓜蛋白酶用量不能明显减少酶活的损失。可见虽然木瓜蛋白酶的价格低于菠萝蛋白酶但采用本发明方法时选用菠萝蛋白酶是必须的。

实施例3 菠萝蛋白酶与其它酶的联合使用

将菠萝蛋白酶与其它酶的联合使用，按照本发明实施例1方法进行处理，并测试所得破碎液酶活和酶活保存率，结果如表3所示。

表3

由表3可见，凡是没有使用菠萝蛋白酶的样品，细胞处理后采用超声波破碎，所需时间均在25 min以上，所需时间下降幅度不大。当pH在7.5以下时，用含有菠萝蛋白酶的溶液处理酵母细胞后，细胞破碎所需时间均下降至7 min或更低，可见其对减弱细胞壁强度有很明显的作用。但凡是使用菠萝蛋白酶的样品，所获破碎液中普鲁兰酶酶活均有大幅度下降，酶活保持均在15%以下。我们进一步在20~60℃范围内改变温度进行上述实验，结果与表3基本一致，即只有pH在7.5以下，使用菠萝蛋白酶时，细胞破碎时间有大幅度下降，但同时所获破碎液中普鲁兰酶酶活大幅度下降，酶活保持率均在20%以下，基本没有工业应用的价值。采用木瓜蛋白酶替代菠萝蛋白酶获得的结果基本类似，只是获得的酶液的酶活更低，增加或减少木瓜蛋白酶用量不能改善酶活严重下降的情况。

可见从本发明的研究过程看，只有将菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶联合使用并采用本发明特有的方法进行处理时才能在有效提高细胞破碎效率的同时保持较高的普鲁兰酶酶活的得率。