阅读说明：本技术 一种提高普鲁兰酶终浓度的发酵液处理方法 (Fermentation liquor treatment method for improving final concentration of pullulanase ) 是由 祝冬君 德青美朵 王施岚 孙娟娟 沈微 陈献忠 杨海泉 夏媛媛 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：一种提高普鲁兰酶终浓度的发酵液处理方法,属于酶工程和发酵工程技术领域。本发明将处理溶液C与普鲁兰酶发酵上清液混合后保温,超滤浓缩,即得高酶活的普鲁兰酶发酵液。采用本发明方法,在以重组菌解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980-<I>BdP</I>发酵制备普鲁兰酶的后提取阶段,可以改善普鲁兰酶发酵液的超滤性能。经本发明处理的发酵液上清液经超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活是未经溶液C处理的发酵液经同样超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活的1.75倍以上。(A fermentation liquor treatment method for improving the final concentration of pullulanase belongs to the technical field of enzyme engineering and fermentation engineering. The treated solution C and the pullulanase fermentation supernatant are mixed, then the mixture is subjected to heat preservation and ultrafiltration concentration, and the high-enzyme-activity pullulanase fermentation liquor is obtained. By adopting the method of the invention, the recombinant bacillus amyloliquefaciens BF7658/pUC980- BdP The post-extraction stage of the pullulanase prepared by fermentation can improve the ultrafiltration performance of the pullulanase fermentation liquor. The enzyme activity of the concentrated solution obtained by ultrafiltration and concentration of the supernatant of the fermentation liquor treated by the method is more than 1.75 times of that of the concentrated solution obtained by ultrafiltration and concentration of the fermentation liquor which is not treated by the solution C.)

一种提高普鲁兰酶终浓度的发酵液处理方法

技术领域

本发明涉及一种提高普鲁兰酶终浓度的发酵液处理方法，属于酶工程和发酵工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)，具有水解淀粉中α-1,6糖苷键的功能，在葡萄糖生产中，与糖化酶协同作用可以提高葡萄糖得率。重组解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP [孙娟娟 沈微 石贵阳 王正祥. 普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达. 工业微生物, 2011, 41(6): 18-22]，具有较好的产普鲁兰酶的能力。

在工业酶制剂的生产中，为了获得酶浓度较高的产品，常常需要对发酵液进行超滤浓缩，以去掉一部分水分，减小酶液体积，实现酶的浓缩。用重组菌解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP制备的普鲁兰酶发酵液的粘度比较大，在发酵液经过固液分离操作后，采用超滤法浓缩时，一般在最终酶液浓缩到原有体积的1/5之后，如果继续超滤操作则无法继续缩小发酵液体积，酶浓度无法进一步提高。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种提高普鲁兰酶终浓度的发酵液处理方法，在经过固液分离后，上清液经过处理再继续超滤浓缩，最终得到的浓缩液酶活比未经处理时有明显提高。

本发明的技术方案，一种提高普鲁兰酶终浓度的发酵液处理方法，将处理溶液C与普鲁兰酶发酵上清液混合后保温，超滤浓缩，即得高酶活的普鲁兰酶发酵液的浓缩液。

进一步地，取处理溶液C与9倍体积的普鲁兰酶发酵上清液混合；混合液在60℃保温30min；经过处理的发酵液上清液在20℃、0.09-0.11MPa下，采用超滤方法进行浓缩至超滤终点，得到高酶活的普鲁兰酶发酵浓缩液。

所述处理溶液C的配制方法：含有200mM柠檬酸-柠檬酸钠，100mM CaCl₂，50mmol/LKCl，20mmol/L NaCl和1mmol/L FeSO₄的水溶液，pH为5.4-5.6。

配置方法为：在1L容量瓶中加入800mL去离子水，加入一水合柠檬酸（（C₆H₈O₇）·H₂O) 12. 6 g，一水合柠檬酸钠（（Na₃C₆H₅O₇）·H₂O) 41.2g，无水氯化钙 11.1g，氯化钾3.7g，氯化钠 1.17g，七水合硫酸亚铁278.2mg，如果pH偏离则用NaOH或 HCl调整pH至5.5±0.1，加水至1 L。

所述普鲁兰酶发酵上清液为解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP发酵制备普鲁兰酶的后提取过程中所得的发酵上清液。

进一步地，所述重组普鲁兰酶发酵上清液的制备方法：将-70℃甘油管保藏的重组菌解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP在含20mg/L卡那霉素的LB平板上划线，挑取单菌落；接种含20mg/L卡那霉素的LB液体培养基；在500mL三角瓶中装液量为100mL，一般同时做10瓶，34℃、200 r/min摇瓶发酵24 h，按10 %接种量接种预先装有已经灭菌的2.7 L发酵液的5 L发酵罐中。发酵过程用氨水控制pH在6.8-7.5。发酵24 hr后间隔4h取样检测酶活，一般酶活达到25 U/mL左右时结束发酵。发酵结束后取发酵液于离心管中，4000rpm离心10min，上清液普鲁兰酶酶活一般在20-30U/mL。实际工作中一般同时做2~3罐发酵，发酵液离心去沉淀、上清液混合后进行后续实验。离心操作使用湘仪CL5R大容量冷冻离心机。

普鲁兰酶酶活测定：按文献[Bibel M, Brett C, Gosslar U, et al. Isolationand analysis of amylolytic enzyme of the hyperthermophilic bacteriumThermotoga maritime. FEMS Microbiol Lett, 1998, 158:9-15]方法进行。

发酵上清液的超滤浓缩方法：在UF101超滤机进行酶液超滤性能的实验，超滤膜为PES30-1512，一般取1 L发酵上清液于超滤机储罐中，按仪器说明书进行超滤操作；其中超滤压力控制在0.1±0.01 MPa。

上述超滤膜的截留分子量为30kDa，小于这个分子量的水、盐及其它相对较小的分子以废液形式从废液管流出。超滤过程中，随着水等小分子的流出，储罐中的酶液体积缩小，同时普鲁兰酶等大分子被浓缩，过滤阻力增大，主要表现为废液流出速度下降。超滤终点的控制标准：当废液流出速度小于1mL/min时定为超滤终点。到达终点后测量储罐中和超滤膜柱子中残留的酶液，合计记为浓缩液体积并计算超滤时间，检测浓缩液酶活。

超滤机型号为UF101，超滤膜为PES30-1512，均为上海福立特实业有限公司产品。

培养基：LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。发酵培养基：乳糖50g/L，豆饼粉30g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，无水氯化钙0.5g/L。发酵培养基及发酵方法可以参考文献[沈微, 肖亚朋, 韩冰, 李婷霖, 朱金寸, 陈献忠, 樊游. 一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法. 中国发明发明, ZL201610601731.0 ]。

所述普鲁兰酶由重组菌解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP制备，具体可参考文献[孙娟娟 沈微 石贵阳 王正祥. 普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达. 工业微生物, 2011, 41(6): 18-22]。

经溶液C处理的普鲁兰酶发酵液上清液经超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活是未经溶液C处理的发酵液经同样超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活的1.75 倍以上。

在采用解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP制备普鲁兰酶，采用本发明方法有利于提高普鲁兰酶终产品的浓度，减少产品储存空间。

本发明的有益效果：采用本发明方法，在以重组菌解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP发酵制备普鲁兰酶的后提取阶段，可以改善发酵液的过滤性能；经溶液C处理的普鲁兰酶发酵液上清液经超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活是未经溶液C处理的发酵液经同样超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活的1.75 倍以上。

具体实施方式

通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：普鲁兰酶发酵液不同处理方法对超滤浓缩的影响

取5 L发酵罐发酵制取的普鲁兰酶发酵液上清液，四份各900 mL，分别标记为A1、A2、B、C。其中A1和A2中加入双蒸水100 mL，其中B中加入10×柠檬酸缓冲液100mL，C中加入10×发酵液处理溶液C 100 mL。

B中加入的10×柠檬酸缓冲液含有200mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH为5.4-5.6。配置方法为：在1 L容量瓶中加入800mL去离子水，加入一水合柠檬酸（（C₆H₈O₇）·H₂O) 12. 6 g，一水合柠檬酸钠（（Na₃C₆H₅O₇）·H₂O) 41.2g，如果pH偏离则用NaOH或 HCl调整pH至5.5±0.1，加水至1 L。

混合后四种混合液如下处理：

A1在常温下放置30min；A2在60℃保温30 min；B和C在60℃保温30min；处理结束后在室温放置20 min；在20℃采用超滤方式进行浓缩，达到超滤终点后检测酶活。检测结果如表1所示。

表1 不同发酵液达到超滤终点所需时间及浓缩液酶活

注：超滤前发酵上清液体积均为1 L（含100 mL处理液或水），离心上清液酶活是加入1/10体积的水或柠檬酸缓冲液或处理液C之前的上清液的酶活。

由表1可见，重组普鲁兰酶的发酵上清液用本发明的方法处理后得到的处理液在超滤浓缩大约16 min时酶活达到终点，终点时的酶活为212 U/mL，酶活比出发时提高了约8倍。而未经处理的酶液需要超滤38分钟才能达到超滤终点，达到的最终酶活只有112 U/mL。采用本发明方法处理后的酶液达到的最终浓缩液的酶活相比未经处理发酵上清液达到的最终酶活提高了约80%。采用本发明方法处理的发酵液浓缩后得到的浓缩液的酶活和发酵上清液用其他处理方法处理后得到的浓缩液相比，本发明方法达到的最终酶活要高出大约60%。采用不同批次的发酵液进行重复试验，结果显示，采用本发明方法处理的发酵液浓缩后得到的浓缩液的酶活相比未经处理的发酵液得到的浓缩液均高出75%以上，而相对采用其他方法得到的浓缩液酶活也高出55%以上。可见采用本发明方法可以更有效的改善发酵液上清液的超滤性能，有利于得到更高浓度的酶液。