阅读说明：本技术 一种用于病毒消杀的复合酶制剂及其应用 (Complex enzyme preparation for killing viruses and application thereof ) 是由 沈涛 何勇 何语灵 张若燕 王杰鹏 程伟 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于病毒消杀的复合酶制剂,包括角蛋白酶,氨肽酶,核酸酶和溶菌酶,还包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶；其中,核酸酶和溶菌酶经包囊材料包被；并且公开了复合酶制剂的应用。使用本发明复合酶制剂进行物品、空气、污水、垃圾、粪尿的病毒消杀,消杀效果显著。(The invention discloses a complex enzyme preparation for killing viruses, which comprises keratinase, aminopeptidase, nuclease, lysozyme, acid protease, neutral protease and/or alkaline protease; wherein the nuclease and lysozyme are coated by an encapsulating material; also discloses the application of the compound enzyme preparation. The compound enzyme preparation of the invention is used for killing viruses of articles, air, sewage, garbage and excrement and urine, and has obvious killing effect.)

一种用于病毒消杀的复合酶制剂及其应用

技术领域

本发明属于卫生防护技术领域，更具体的说是涉及一种用于病毒消杀的复合酶制剂及其应用。

背景技术

病毒的传播方式有多种，容易造成感染的传播方式包括接触传播、飞沫传播、气溶胶传播、粪口传播等等。为了减少各种传播风险，通常需要对空气环境、医疗废弃物、患者的生活污水、粪尿等进行病毒消杀处理。

然而，现有的消毒剂或稳定性差、易于分解，或具有较强的刺激性、腐蚀性，或不适于复杂成分背景的病毒消杀处理，或容易造成新的环境污染，应用范围和效果均较为局限。

因此，亟待提供一种能够广泛适用于各种物品及环境病毒消杀的产品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于病毒消杀的复合酶制剂，可应用于物品、空气、污水、垃圾、粪尿等复杂成分背景的病毒消杀处理，其消杀效果好，使用安全环保。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于病毒消杀的复合酶制剂，包括角蛋白酶，氨肽酶，核酸酶和溶菌酶，

还包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶；

其中，核酸酶、溶菌酶经包囊材料包被。

本发明将酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的任意一种与角蛋白酶、氨肽酶、核酸酶、溶菌酶联合使用，可根据不同的酸碱环境选择酸性蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶，使得复合酶制剂的使用更为广泛；也可复合使用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，使消杀作用点更为广谱。蛋白酶先对病毒外层膜蛋白进行有效分解，暴露其核酸；进一步地，核酸酶可将核酸酶解为核苷酸，完全破坏病毒的核酸结构，达到有效消杀病毒的目的；溶菌酶一方面可水解病毒糖蛋白糖链进而破坏病毒蛋白外壳，另一方面可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅酶蛋白形成复盐，使病毒失活。对核酸酶、溶菌酶进行包被可避免储存不当或使用环境复杂造成酶失活；而角蛋白酶、氨肽酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶作为复合酶制剂中的主剂并未进行包被，可保证其对于物品、环境病毒消杀的效率；消杀过程中，核酸酶、溶菌酶逐渐释放，进一步增强消杀效果。

本发明所使用的复合酶制剂无味、无毒，能够适应不同pH环境，对多种病毒均有良好的消杀效果。

优选地，以酶活单位计，(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶)、角蛋白酶、氨肽酶、核酸酶、溶菌酶的用量比为(10-1000)∶(10-1000)∶(0.1-100)∶(0.1-100)∶(0.1-100)。

优选地，以酶活单位计，(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶)、角蛋白酶、氨肽酶、核酸酶、溶菌酶的用量比为(100-500)∶(20-200)∶(0.5-20)∶(0.5-20)∶(0.5-20)。

优选地，包囊材料包括麦芽糊精和壳聚糖。

优选地，麦芽糊精和壳聚糖用量比为(2-3)∶1。

优选地，按照(核酸酶+溶菌酶)∶麦芽糊精∶壳聚糖重量比为(4-5)∶(2-3)∶1称取各材料；

将核酸酶分散于水中，制成溶液A；

将麦芽糊精、壳聚糖分散于水中，制成溶液B；

将溶液B加入溶液A中，搅拌均匀，制得溶液C；

溶液C喷雾干燥制得包囊材料包被的核酸酶、溶菌酶。

上述用于病毒消杀的复合酶制剂在物品、环境病毒消杀中的应用；环境包括室内环境和室外环境。

上述在环境病毒消杀中应用包括垃圾处理、粪尿处理、空气处理或污水处理。

进一步地，环境病毒消杀过程需要使用较大剂量的复合酶制剂，因此，需注意避免人体直接接触复合酶制剂。

上述复合酶制剂可用于制备空气过滤材料。

进一步地，复合酶制剂用于制备空气过滤材料时，应在在复合酶制剂两侧设置一层或多层粉尘过滤层，避免长时间使用时复合酶制剂随过滤空气逸出。

进一步地，上述复合酶制剂在空气处理中的应用，将复合酶制剂溶解成酶液，并使用设备使空气通过酶液，进行病毒消杀。

进一步地，可将用于病毒消杀的复合酶制剂溶解成酶液，利用喷淋塔向下喷淋，并且使空气从下向上对流，进而实现空气中的病毒消杀。

进一步地，还可将复合酶制剂溶解成酶液，置于容器或设备中，向容器或设备中通入空气，空气经过酶液即可实现病毒消杀。

进一步地，应用于物品消杀时，可适当稀释成较低浓度，以满足衣物、医疗器械、生活用品等物品的病毒消杀要求。

由上述技术方案可知，本发明复合酶制剂可直接用于各种物品、环境的病毒消杀，使用安全方便，消杀效果显著。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

实施例1

一种用于病毒消杀的复合酶制剂，原料包含酸性蛋白酶30g、角蛋白酶20g、氨肽酶10g、核酸酶20g、溶菌酶20g。

其中，

酸性蛋白酶为酸性蛋白酶，酶活80万U/g；

角蛋白酶为角蛋白酶，酶活20万U/g；

氨肽酶为氨肽酶，酶活5000U/g；

核酸酶为核酸酶，酶活10万U/g；

溶菌酶为溶菌酶，酶活2万U/g。

核酸酶、溶菌酶经包囊材料包被，包被方法如下：

将20g核酸酶、20g溶菌酶分散于1L水中，制得溶液A；

取25g麦芽糊精，10g壳聚糖分散于1L水中，制得溶液B；

将溶液缓慢加入溶液A中，边添加边搅拌均匀，制得溶液C；

溶液C喷雾干燥制得包囊材料包被的核酸酶、溶菌酶。

包囊材料包被的核酸酶、溶菌酶与酸性蛋白酶、角蛋白酶、氨肽酶混合均匀即得复合酶制剂，可直接将复合酶制剂加入垃圾、污水、粪尿中进行处理，也可溶于制成病毒消杀液进行喷洒处理。

进一步地，对上述复合酶制剂的病毒消杀能力进行验证；供试病毒包括流感病毒H5N3(MDCK细胞为载体)、甲型肝炎病毒(HepG2.2.15细胞为载体)。

分别培养各组载体细胞，细胞长满单层时接种病毒，待3/4细胞出现病变时，收集载体细胞，超声破碎后离心取上清，分别使用无菌水或经过高温灭菌的粪尿液进行稀释处理，制成约1×10⁴pfu/mL病毒液，调节病毒液pH为6.0。

取上述复合酶制剂分别溶于无菌水中，制成酸性蛋白酶酶活约800U/mL的酶液，将酶液与病毒液按1∶10体积比混合，于25±2℃处理40min后，10倍系列梯度稀释，接种细胞。37℃培养48h后甲醇固定、结晶紫染色，清洗后进行蚀斑计数(圆形不着色的透明区为一个蚀斑)。每毫升处理液中病毒含量(pfu/mL)＝平均蚀斑数×稀释倍数。

同时设置空白对照组，使用无菌水或经过高温灭菌的粪尿液与病毒液混合；根据空白对照组计算复合酶制剂的病毒消杀率，试验结果如表1所示：

表1

实施例2

一种用于病毒消杀的复合酶制剂，原料包含中性蛋白酶50g、角蛋白酶10g、氨肽酶10g、核酸酶10g、溶菌酶20g。

其中，

中性蛋白酶为中性蛋白酶1398，酶活15万U/g；

角蛋白酶为角蛋白酶，酶活20万U/g；

氨肽酶为氨肽酶，酶活5000U/g；

核酸酶为核酸酶，酶活10万U/g；

溶菌酶为溶菌酶，酶活2万U/g。

核酸酶、溶菌酶经包囊材料包被，包被方法如下：

将10g核酸酶、20g溶菌酶分散于500mL水中，制得溶液A；

取15g麦芽糊精，6g壳聚糖分散于500mL水中，制得溶液B；

将溶液缓慢加入溶液A中，边添加边搅拌均匀，制得溶液C；

溶液C喷雾干燥制得包囊材料包被的核酸酶、溶菌酶。

包囊材料包被的核酸酶、溶菌酶与中性蛋白酶、角蛋白酶混合均匀即得复合酶制剂。

本实施例复合酶制剂适用于空气环境的病毒消杀，例如，将复合酶制剂作为填料使用过滤材料包覆制成过滤芯，设置在新风系统中，在对环境内的空气进行换气时完成病毒消杀。

另外，可直接将复合酶制剂加入垃圾、污水、粪尿中进行处理，也可溶于制成病毒消杀液进行喷洒处理。

进一步地，可将复合酶制剂溶解成酶液，利用喷淋塔向下喷淋，并且使空气从下向上对流，进而实现空气中的病毒消杀。

进一步地，还可将复合酶制剂溶解成酶液，置于容器或设备中，向容器或设备中通入空气，空气经过酶液即可实现病毒消杀。

进一步地，还可将复合酶制剂溶解成酶液，用于擦拭、清洗待消毒物品。

对上述复合酶制剂进行如下试验：

1.皮肤刺激试验：

选择4只皮肤完好的健康家兔，试验前24h将其脊柱两侧的毛剪去，左右各为3×3cm；将复合酶制剂用无菌水制成中性蛋白酶酶活约140U/mL酶液，取0.5mL滴于4层纱布(2×2cm)上，敷于一侧去毛皮肤表面，使用塑料膜覆盖，并用无刺激胶布固定；另一侧纱布上滴加无菌生理盐水。敷贴4h后除去纱布，温水清洗敷贴部位，并于去除纱布后1h、24h、48h分别观察皮肤局部反应变化。

实验结果显示，4只家兔敷贴部位均无红肿现象，即复合酶制剂制成的中性蛋白酶酶活约140U/mL的酶液无明显皮肤刺激性。

2.眼部刺激试验

选择4只眼部正常的家兔，将复合酶制剂用无菌水制成中性蛋白酶酶活约140U/mL酶液，取0.1mL滴入家兔一侧眼结膜囊中，另一只以无菌生理盐水作为对照；滴加后使家兔眼部闭合1s，30s后使用生理盐水冲洗，于滴加1h、24h、48h、72h后观察眼角膜、虹膜、结膜充血、红肿情况。

实验结果如表2所示：

表2

刺激情况	1h(只数)	24h(只数)	48h(只数)	72h(只数)
					角膜混浊	0	0	0	0
虹膜受损	0	0	0	0
					结膜充血或水肿	2	2	1	0

经上述实验可知，中性蛋白酶酶活约140U/mL酶液造成的结膜充血或水肿可在72h内恢复，使用较为安全；但对于环境病毒消杀而言，由于污染物会稀释复合酶制剂的浓度，复合酶制剂的投入剂量相对增加，若直接接触皮肤、粘膜，可能会造成刺激反应，因此，在实际操作中，因避免复合酶制剂直接与人体接触。应用于物品消毒时，操作人员应佩戴手套。

实施例3

一种用于病毒消杀的复合酶制剂，原料包含碱性蛋白酶20g、角蛋白酶30g、氨肽酶20g、核酸酶10g、溶菌酶20g。

其中，

碱性蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活45万U/g；

角蛋白酶为角蛋白酶，酶活20万U/g；

氨肽酶为氨肽酶，酶活5000U/g；

核酸酶为核酸酶，酶活10万U/g；

溶菌酶为溶菌酶，酶活2万U/g。

核酸酶、溶菌酶经包囊材料包被，包被方法如下：

将10g核酸酶、20g溶菌酶分散于500mL水中，制得溶液A；

取15g麦芽糊精，7g壳聚糖分散于500mL水中，制得溶液B；

将溶液缓慢加入溶液A中，边添加边搅拌均匀，制得溶液C；

溶液C喷雾干燥制得包囊材料包被的核酸酶、溶菌酶。

包囊材料包被的核酸酶、溶菌酶与中性蛋白酶、角蛋白酶混合均匀即得复合酶制剂，可直接将复合酶制剂加入垃圾、污水、粪尿中进行处理，也可溶于制成病毒消杀液进行喷洒处理。

进一步地，对上述复合酶制剂的病毒消杀能力进行验证；供试病毒包括流感病毒H5N3(MDCK细胞为载体)、甲型肝炎病毒(HepG2.2.15细胞为载体)。

分别培养各组载体细胞，细胞长满单层时接种病毒，待3/4细胞出现病变时，收集载体细胞，超声破碎后离心取上清，分别使用无菌水或灭菌生活污水进行稀释处理，制成约1×10⁴pfu/mL病毒液，调节病毒液pH为8.0。

取上述复合酶制剂分别溶于无菌水中，制成碱性蛋白酶酶活约540U/mL酶液，将酶液与病毒液按1∶10体积比混合，于25±2℃处理40min后，10倍系列梯度稀释，接种细胞。37℃培养48h后甲醇固定、结晶紫染色，清洗后进行蚀斑计数(圆形不着色的透明区为一个蚀斑)。每毫升处理液中病毒含量(pfu/mL)＝平均蚀斑数×稀释倍数。

同时设置空白对照组，使用无菌水或灭菌生活污水与病毒液混合；根据空白对照组计算复合酶制剂的病毒消杀率，试验结果如表3所示：

表3

进一步地，对复合酶制剂中核酸酶、溶菌酶的包被效果进行验证：

其中，实验组采用实施例3复合酶制剂，对照组1复合酶制剂包含碱性蛋白酶20g、角蛋白酶30g、氨肽酶20g、核酸酶10g、溶菌酶20g，未进行包被；对照组2复合酶制剂包含碱性蛋白酶20g、角蛋白酶30g、氨肽酶20g、核酸酶10g、溶菌酶20g，所有酶组分均使用麦芽糊精、壳聚糖进行包被；各组复合酶制剂配置好后室温放置7d后验证各组复合酶制剂的消杀效果。

供试病毒为流感病毒H5N3(MDCK细胞为载体)，培养载体细胞，细胞长满单层时接种病毒，待3/4细胞出现病变时，收集载体细胞，超声破碎后离心取上清，分别使用灭菌生活污水进行稀释处理，制成约1×10⁵pfu/mL病毒液，调节病毒液pH为8.0。

取上述各组复合酶制剂分别溶于无菌水中，制成碱性蛋白酶酶活约540U/mL酶液，将酶液与病毒液按1∶10体积比混合，于25±2℃处理40min后，10倍系列梯度稀释，接种细胞。37℃培养48h后甲醇固定、结晶紫染色，清洗后进行蚀斑计数(圆形不着色的透明区为一个蚀斑)。每毫升处理液中病毒含量(pfu/mL)＝平均蚀斑数×稀释倍数。

同时设置空白对照组，使用灭菌生活污水与病毒液混合；根据空白对照组计算复合酶制剂的病毒消杀率，试验结果如表4所示：

表4

组别	病毒消杀率(％)
		实验组	98.2
对照组1	82.0
		对照组2	89.7

上述所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。