阅读说明：本技术 液相色谱串联质谱检测新型心血管疾病风险标志物的方法 (Method for detecting novel cardiovascular disease risk marker by liquid chromatography-tandem mass spectrometry ) 是由 周洲 王恺隽 武红梅 赵丽平 高小晶 栗琳 于 2020-01-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于临床生物样本检测技术领域,特别涉及一种高通量液相色谱串联质谱法检测生物样本中氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的方法；该方法可以同时检测生物样本中5种物质,具有高准确度、高灵敏度、高特异性以及所需样本体积少、样本前处理简单及耐受性好等优点。(The invention belongs to the technical field of clinical biological sample detection, and particularly relates to a method for detecting trimethylamine oxide, choline, betaine, creatinine and L-carnitine in a biological sample by a high-throughput liquid chromatography-tandem mass spectrometry method; the method can be used for simultaneously detecting 5 substances in the biological sample, and has the advantages of high accuracy, high sensitivity, high specificity, small required sample volume, simple sample pretreatment, good tolerance and the like.)

液相色谱串联质谱检测新型心血管疾病风险标志物的方法

技术领域

本发明涉及高通量液相色谱串联质谱法检测生物样本中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、左旋肉碱和肌酐的方法。

背景技术

中国心血管病(cardiovascular disease，CVD)的患病率及死亡率持续上升，患病人数约2.9亿。CVD死亡率居各病因之首，占居民疾病死亡构成的40％以上。与此同时，中国心血管疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。随着社会经济的发展，国民生活方式发生了深刻的改变。在社会老龄化和城市化进程加快、居民不健康生活方式盛行的背景下，国民CVD危险因素普遍暴露，高血压、血脂异常、糖尿病的患病率持续增加，导致了中国CVD患病率和死亡率的不断上升，目前CVD 呈现在低龄化、低收入群体中快速增长趋势。今后十年我国CVD患病人数仍将持续增长，防控工作十分严峻。

降低CVD风险的一个重要步骤是识别和治疗已知的风险因素(如吸烟、血脂异常、高血压、饮食不良)。新的风险因素，如代谢物氧化三甲胺(TMAO)，有助于完善CVD风险评估，并可能成为CVD治疗干预的新目标物质。

循环系统中的TMAO与心血管疾病的各种病理生理过程有关。血液中的TMAO 水平与摄入的营养成分：如胆碱(Choline)、甜菜碱(Betaine)和左旋肉碱 (L-Carnitine)。肠道细菌将这些前体营养物质转化为三甲胺(TMA)，三甲胺随后在肝脏中氧化为TMAO。研究表明在啮齿类动物模型中，富含TMAO前体的饮食增加动脉粥样硬化引起的泡沫细胞，导致主动脉病变，抑制胆固醇从组织转移到肝脏，并改变血小板特性增加血栓形成的风险。

大量前瞻性队列的荟萃分析表明，高浓度的TMAO与主要不良冠状动脉事件(MACE)和死亡率的风险增加相关，并独立于其他风险因素。临床数据支持在接冠状动脉造影和急性冠状动脉综合征患者中，使用TMAO进行更准确的MACE风险预测。临床数据也支持使用TMAO来完善外周动脉疾病、心力衰竭、慢性肾病和心肌梗死患者的全因死亡率的风险评估。临床医生和研究人员可根据TMAO的影响，定义为指导饮食调整和治疗的工具。

肌酐(Creatinine)是肌肉在人体内代谢的产物，其水平与肾功能相关，长期高血压或血性心功能不全会引起肾损伤，进而使肌酐水平升高。

目前，长沙都正生物科技有限责任公司于2017年6月27日申请的中国专利“一种氧化三甲胺定量检测试剂盒及方法”，申请号201710502265.5，该发明公开一种测定氧化三甲胺的液相串联质谱方法，但是仅可测氧化三甲胺一种物质，且没有阐明应用价值。苏州帕诺米克生物医药科技有限公司于2018年9月13日申请的中国专利“一种测定小分子生物标志物的方法”，申请号201811068542.7，该发明公开一种测定11种小分子(胆碱、甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺、肌酐、同型半胱氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的液相串联质谱方法：由于一次检测多种物质，样本前处理复杂，且需要使用还原剂。常州市第一人民医院于2019年4月8日申请的中国专利“一种试剂盒”，申请号201910274765.7，该发明公开一种测定血浆TMAO含量的试剂盒，仅可测TMAO一种物质。

综上所述，现有技术关于新型心血管疾病风险标志物的方法检测的过程主要缺陷在于：

1、多数方法仅仅能检测TMAO一种物质，无法满足临床需求；

2、生物样本前处理方法太复杂，无法自动化，难以推广到临床应用；

3、检测标志物临床意义不明确，且无足够文献及数据支撑。

4、检测无关标志物太多，成本太高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量液相色谱串联质谱法检测生物样本中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、左旋肉碱和肌酐的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

(一)、标准溶液的配制

(a)、标准曲线的配制

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准品适量，用50％～90％甲醇水溶液溶解，配制标准品储备液。使用50％～90％甲醇水溶液稀释标准品储备液，配制混合标准品工作液。

使用50％～90％甲醇水溶液稀释混合标准品工作液，配制标准曲线，使其浓度范围分别为：TMAO 0.01-10μg/mL，Choline 0.1-100μg/mL，Betaine 100～10000.1-100μg/mL，Creatinine 0.1-100μg/mL，L-Carnitine 0.1-100μg/mL。

(b)、标准内标液的配制

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的内标适量，用50％～90％甲醇水溶液溶解，配制内标储备液。使用蛋白质沉淀剂稀释标准品储备液，配制混合内标工作液。使其浓度分别为：TMAO-d9 5～50ng/mL，Choline-d4 5～50ng/mL，Betaine-d3 50～500ng/mL，Creatinine-d3 5～50ng/mL，L-Carnitine-d3 5～50 ng/mL。

(c)、质控品的配制

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准品适量，用50％～90％甲醇水溶液溶解，配制质控品储备液。使用50％～90％甲醇水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度、中浓度、高浓度，三个浓度混合质控品工作液。

将10～20人份的生物样本混合，加入不超过生物样本总体积10％的混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)。每支30μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用。

(二)生物样本的处理

取待检血液至少1mL，在离心速度为1500～3000rpm下离心10～30min，得到上清液，置于-80℃备用；

(三)待测生物样本/标准曲线/质控品处理

移液器移取步骤(b)的混合内标工作液500～1000μL于1.5mL离心管中，然后加入10～50μL的生物样本/标准曲线/质控品于上述离心管中，混匀，在离心速度为13000～24000rpm下离心10～30min，去除蛋白质沉淀，移液器取上清供LC-MS/MS 检测。

(四)待测样本的检测

使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对(三)中处理后的生物样本/标准曲线/质控品进行检测。通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测生物样本的峰面积计算出待测生物样本中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的浓度。

优选地，在上述方法中，生物样本包括血清和血浆。

优选地，在上述方法中，标准曲线为八种不同浓度梯度。

优选地，在上述方法中，所述内标分别为氘代同位素内标，具体为氧化三甲胺-d9(TMAO-d9)、胆碱-d4(Choline-d4)、甜菜碱-d3(Betaine-d3)、肌酐-d3(Creatinine-d3) 和左旋肉碱-d3(L-Carnitine-d3)。

优选地，在上述方法中，所述使用蛋白质沉淀剂作为内标工作液溶剂，蛋白质沉淀剂包括甲醇/乙腈(100～0％-0～100％)。

优选地，在上述方法中，所述在步骤(c)质控品配制中，生物样本加标浓度如下表：

分析物	LQC μg/mL	MQC μg/mL	HQC μg/mL
				TMAO	0.05～0.5	0.5～1	1～3
Choline	0.5～2	2～5	5～15
				Betaine	0.5～5	5～15	20～50
Creatinine	1～10	10～20	30～60
				L-Carnitine	1～10	10～30	30～100

优选地，在上述方法中，所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为HILIC色谱柱或Amide色谱柱、柱温为30～40℃，进样量为2～10μL；

优选地，在上述方法中，所述分析色谱柱的流动相为含有0.1～0.5％甲酸5mmol/L甲酸铵水溶液和含有0.1～0.5％甲酸乙腈溶液，流速为0.2～0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，流动相A和流动相B的体积比为100～0％-0～100％。

优选地，在上述方法中，所述质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：300～600℃；离子源电压：4500～5000V；碰撞气：9～10unit；气帘气：40～50psi； GS1:50～60psi；GS2：50～60psi；检测方式：正离子检测。

优选地，在上述方法中，所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多反映监测(MRM)扫描模式，具体的离子对如下：

分析物	离子对	内标	离子对
				TMAO	76.1→58.0	TMAO-d9	85.1→66.1
Choline	104.1→60.1	Choline-d4	108.3→60.0
				Betaine	118.1→58.1	Betaine-d3	121.1→61.1
Creatinine	114.1→44.1	Creatinine-d3	117.1→47.1
				L-Carnitine	162.2→103.0	L-Carnitine-d3	165.2→105.2

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明能一次检测血清/血浆中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱5种物质；

2、生物样本血清/血浆样本经蛋白沉淀后直接进样，处理方法简单，效率得到很大提高，更容易实现自动化，便于临床推广；

3、首次提出在临床中可用于对心血管疾病患者的MACE风险预测。

附图说明

图1总色谱图。

图2～图6依次为氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱色谱图。

具体实施方式

一、为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明，下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。

(一)、标准溶液的标定

(a)、标准工作液的配制：

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准品10.00mg置于10ml容量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，得到标准储备液，浓度为 1.00mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液稀释得到标准中间液，其浓度为 100μg/mL；

将以上标准中间液别吸取20μL、200μL、200μL、200μL和200μL，再加入180μL 50％甲醇溶液，混匀后，用水溶液进行稀释，在含有0.01-10μg/mL氧化三甲胺、 0.1-100μg/mL胆碱、0.1-100μg/mL甜菜碱、0.1-100μg/mL左旋肉碱、和0.1-100μg/mL 肌酐的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，具体如下：

μg/ml	STD1	STD2	STD3	STD4	STD5	STD6	STD7	STD8
									TMAO	0.01	0.05	0.1	0.2	0.5	1	5	10
Choline	0.1	0.5	1	2	5	10	50	100
									Betaine	0.1	0.5	1	2	5	10	50	100
Creatinine	0.1	0.5	1	2	5	10	50	100
									L-Carnitine	0.1	0.5	1	2	5	10	50	100

(b)、标准内标液的配制：

精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱同位素内标标准品10.00mg置于10ml容量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，得到标准储备液，其同位素的浓度为 1.00mg/mL，用50％的甲醇溶液从标准储备液稀释得到标准中间液，其同位素的浓度为100μg/mL；

将标准中间液分别吸取10μL、10μL、100μL、50μL和10μL，再加入820μL 50％甲醇溶液，混匀后，用水溶液进行稀释，得到含有1μg/mL氧化三甲胺同位素、含有 1μg/mL胆碱同位素、含有10μg/mL甜菜碱同位素、含有5μg/mL左旋肉碱同位素和含有1μg/mL肌酐同位素的标准内标液；

标准内标工作液配制，将上述混合的标准内标液用甲醇稀释100倍后使用。

(c)、质控品配制：

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准品适量，用50％～90％甲醇水溶液溶解，配制质控品储备液。使用50％～90％甲醇水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度、中浓度、高浓度，三个浓度混合质控品工作液。

将10～20人份的生物样本混合，加入不超过生物样本总体积10％的混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)。每支30μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用。具体标准品加入浓度如下表：

分析物	QCL	QCM	QCH
				TMAO	0.2	0.6	1.8
Choline	1	3	9
				Betaine	3	9	27
Creatinine	5	15	45
				L-Carnitine	6	18	54

(d)用标准溶液标定，得到标准曲线方程：

用移液枪分别移取至少三种不同浓度的标准工作液20μL，将上述至少三种不同浓度的标准工作液与800μL标准内标工作液混合，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述替代基质为水，供LC-MS/MS检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的色谱图及其对应的标准内标液中氧化三甲胺同位素，胆碱同位素，甜菜碱同位素，肌酐同位素和左旋肉碱同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的峰面积和对应的标准内标液中的氧化三甲胺同位素，胆碱同位素，甜菜碱同位素，肌酐同位素和左旋肉碱同位素的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标 y1,y2,y3,y4和y5，以上述标准工作液中含有氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的浓度与对应的标准内标液中的氧化三甲胺同位素，胆碱同位素，甜菜碱同位素，肌酐同位素和左旋肉碱同位素的浓度之比作为标准曲线图的横坐标 x1,x2,x3,x4和x5，将以上检测所得至少数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，y2＝c*x2+d，y3＝e*x3+f，y4＝g*x4+h和y5＝i*x5+j，并且得到权重系数a、b、c、d、e、f、g、h、i和j；

(二)检测血液的离心

取待检血液至少1mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，得到上清液血浆，置于-80℃备用；

(三)待测样品处理

(e)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标工作液800μL于1.5mL离心管中，然后加入步骤(二)的20μL的血浆于上述离心管中，混匀，在离心速度为13000rpm下离心5min，取上清供LC-MS/MS检测

(四)待测样品的检测

取步骤(d)待测样品，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的色谱图及其对应的标准内标液中氧化三甲胺同位素，胆碱同位素，甜菜碱同位素，肌酐同位素和左旋肉碱同位素的色谱图，将上述色谱图中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的峰面积和对应的标准内标液中的氧化三甲胺同位素，胆碱同位素，甜菜碱同位素，肌酐同位素和左旋肉碱同位素的峰面积之比y1,y2,y3,y4和y5，代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b，y2＝c*x2+d，y3＝e*x3+f，y4＝g*x4+h和 y5＝i*x5+j中，通过计算得到待检测样品中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的浓度与对应的标准内标液中的氧化三甲胺同位素，胆碱同位素，甜菜碱同位素，肌酐同位素和左旋肉碱同位素的浓度之比x1,x2,x3,x4,x5和x6，标准内标液中的氧化三甲胺同位素，胆碱同位素，甜菜碱同位素，肌酐同位素和左旋肉碱同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的浓度。

所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测的质谱仪参数如下：

所述质谱检测的多重反应监控参数如下：

化合物	Q1	Q3	DWELL(ms)	DP	EP	CE	CXP
								TMAO	76.1	58.0	20	60	10	25	9
TMAO-d9	85.1	66.1	20	60	10	25	7
								Choline	104.1	60.1	20	80	10	25	9
Choline-d4	108.3	60.0	20	50	10	25	5
								Betaine	118.1	58.1	20	40	10	40	4
Betaine-d3	121.1	61.1	20	40	10	40	4
								Creatinine	114.1	44.1	20	55	10	30	6
Creatinine-d3	117.1	47.1	20	70	10	30	5
								L-Carnitine	162.2	103	20	30	10	25	7
L-Carnitine-d3	165.2	105.2	20	25	10	27	7

所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测的流动相梯度洗脱程序参数如下：

时间(min)	流速(ml/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0.00	0.4	15	85
0.5	0.4	15	85
				2.8	0.4	100	0
2.9	0.4	15	85
				5	0.4	15	85

二、本实施例中技术方案论证如下：

(一)该方法的线性关系和定量限：

将上述配置的混合标准工作液，经蛋白质沉淀后进样，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的线性范围和定量限如下：

(二)该方法的回收率和精密度

取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准工作液配制成高、中、低 3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，批内、批间精密度如下：

取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准工作液配制成高、中、低3 种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，回收率如下：

综合上述验证实验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血浆中氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱含量，重现性良好，加标回收率高，提高了检测结果的准确度。

血浆样本中氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱色谱图见附图，氧化三甲胺的保留时间为1.18min，胆碱的保留时间为1.27min，甜菜碱的保留时间为 2.05min，苷酸的保留时间为1.42min，左旋肉碱的保留时间为1.46min，从图中可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短，干扰小，特异性强。