阅读说明：本技术 一种使用高效液相色谱测定粪便中褪黑素的方法 (Method for determining melatonin in excrement by using high performance liquid chromatography ) 是由 熊家军 李可可 何长久 齐德生 陈建国 许学林 荆焕松 孙旭阳 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种使用高效液相色谱测定粪便中褪黑素的方法,包括：将待测粪便捣碎混匀,用冻干机冻干,甲醇浸提待测粪便,离心取上清液用氮吹仪吹干；用乙腈正己烷溶液溶解,离心取下层液,经微孔滤膜过滤；上机进行高效液相色谱检测,采用外标法对粪便样品中褪黑素进行定量。本发明首次实现了对粪便中褪黑素的提取和检测,检测方法的灵敏度高、专一性强、稳定性好、结果准确可靠,可以建立动物非创伤性褪黑素检测新方法,阐明动物内源褪黑素分泌昼夜节律。(The invention discloses a method for determining melatonin in excrement by using high performance liquid chromatography, which comprises the following steps: smashing and uniformly mixing the excrement to be detected, freeze-drying the excrement to be detected by using a freeze dryer, extracting the excrement to be detected by using methanol, centrifuging the obtained product, and taking supernatant liquid to blow and dry the obtained supernatant liquid by using a nitrogen blowing instrument; dissolving with acetonitrile n-hexane solution, centrifuging to obtain supernatant, and filtering with microporous membrane; and (4) performing high performance liquid chromatography detection on the excrement sample by using a machine, and quantifying melatonin in the excrement sample by using an external standard method. The invention realizes the extraction and detection of the melatonin in the excrement for the first time, the detection method has high sensitivity, strong specificity, good stability and accurate and reliable result, and a new animal non-traumatic melatonin detection method can be established to clarify the circadian rhythm of endogenous melatonin secretion of animals.)

一种使用高效液相色谱测定粪便中褪黑素的方法

技术领域

本发明涉及褪黑素检测技术领域，特别涉及一种使用高效液相色谱测定粪便中褪黑素的方法。

背景技术

褪黑素(Melatonin，MT)是一种吲哚类激素，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一种广谱的生理调节剂。褪黑素主要来自于哺乳动物的松果体，被证实是目前已知的抗氧化作用最强的内源性白由基清除剂，其对睡眠、促进性腺发育和生理节奏具有重要作用。动物发现了褪黑素的存在，其具有调节昼夜节律，光周期与生长发育的作用，褪黑素在动物中的功能包括清除自由基、增强免疫力、抑制衰老等作用，其生理与药理功能的多样性得到了国内外学者的普遍重视，美国食品与药品管理局认可褪黑素作为普通膳食补充剂，中国卫生部则先后批准20余种含褪黑素产品作为改善睡眠的保健食品，全世界至今已经有数百万人长期服用。通过对植物材料中MT含量的提取与检测，可以评估相关食品的合理饮用量，为人们的健康饮食、功能保健食品的开发利用提供科学依据。

目前，国内已有动物组织、血浆、血清中褪黑素的检测方法，例如，《湖北农业科学》2010年第10期“绒山羊血浆中褪黑素含量的测定”以绒山羊为试验材料,采用放射性免疫法测定一个年周期内夜间绒山羊血浆中褪黑素的水平。在获取动物组织、血浆、血清时会对动物体造成一定的伤害，影响其生产性能，同时也需要使用大量的人力物力造成经济损失。而采集动物粪便检测褪黑素采样方便，可避免对动物的创伤，也可减少经济损失，动物粪便成分复杂，动物粪便检测褪黑素时粪便前处理是一个难点，但是现在还未见动物粪便前处理以及动物粪便中褪黑素检测方法的报道。因此有必要对采用动物粪便检测褪黑素的方法以及粪便前处理过程进行研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用高效液相色谱测定粪便中褪黑素的方法，检测方法灵敏度高、专一性强、稳定性好、结果准确可靠。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种使用高效液相色谱测定粪便中褪黑素的方法，包括：将待测粪便捣碎混匀，用冻干机冻干，甲醇浸提待测粪便，离心取上清液用氮吹仪吹干；用乙腈正己烷溶液溶解，离心取下层液，经微孔滤膜过滤；上机进行高效液相色谱检测，采用外标法对粪便样品中褪黑素进行定量。

优选地，在用乙腈正己烷溶液溶解，离心取下层液与微孔滤膜过滤之间增加重复离心，取上清的步骤。

优选地，待测粪便与甲醇加入量的比为0.1g:6ml。

优选地，离心的过程为4℃12000RPM离心10min。

优选地，乙腈正己烷溶液为1ml的乙腈水(4：6，V/V)和1ml的正己烷混合制成的溶液。

优选地，高效液相色谱检测的色谱条件为：色谱柱:C18色谱柱250×4.6mm,5um；柱温:25℃；检测器:荧光检测器；激发波Ex:285nm，发射波Em:345nm；流速:0.5mL/min,进样体积:20uL。

优选地，外标法对褪黑素进行定量的标准曲线为：y＝0.0859x+0.065，其中：y代表峰面积，x代表褪黑素浓度(ng/ml)。

本发明的有益效果在于：本发明对动物粪便进行前处理，首次实现了对粪便中褪黑素的提取和检测，检测方法的灵敏度高、专一性强、稳定性好、结果准确可靠，可以建立动物非创伤性褪黑素检测新方法，阐明动物内源褪黑素分泌昼夜节律。

附图说明

图1是本发明对照品褪黑素标准曲线。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。

1、色谱条件

色谱柱:C18色谱柱250×4.6mm,5um；柱温:25℃；检测器:荧光检测器；激发波Ex:285nm，发射波Em:345nm；流速:0.5mL/min,进样体积:20uL。

2、对照品溶液的制备及标准曲线的绘制

取一定量褪黑素标准品用流动相稀释配成褪黑素浓度为10、25、50、100、250、500、1000ng/ml，取20μl进样测定。以各标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

3、待检测粪便样品的制备

3.1样品采集与处理

收集梅花鹿粪便，取0.1g/样，用冻干机冻干。

3.2甲醇提取褪黑素

取3ml甲醇于冻干瓶中浸提粪便，震荡，将其全部转移到15ml离心管中，再加3ml的甲醇重复提取一次，合并两次的提取液,并4℃12000RPM离心10min取上清，重复离心一次，取上清，用氮吹仪吹干。

3.3正己烷脱脂、上机

1ml的乙腈水(4：6)和1ml的正己烷溶解，4℃12000RPM离心10min，取下层液，重复离心，取上清，过0.22vm的滤膜过滤，上机待测。

4、回收率测定

12个粪样，1、2、3号只加粪样；4、5、6号中粪样加100ng褪黑素；7、8、9号中粪样加250ng的褪黑素；10、11、12号中粪样加500ng的褪黑素，然后都按相同的处理方式进行处理。

5、上机测量

将上机样与标准样同时进行高效液相色谱测定。色谱条件如上所述。

6、结果

6.1褪黑素线性关系分析

将配制好的褪黑素标准系列溶液上机检测，标准溶液的浓度与峰面积如表1所示。以浓度(ng/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线，结果见图1。线性方程为y＝0.0859x+0.065，相关系数R²为0.9999。褪黑素在10-1000ng/ml范围浓度与峰面积之间线性关系良好，可用于定量分析。

表1褪黑素线性关系分析

6.2精密度分析

精密度是评判方法优劣的又一指标。精密度通常由平行性和重现性组成。根据我国国家标准GB/T 27404-2008实验室质量控制规范中规定，被测组分含量低于100μg/kg，实验室内变异系数(CV)在15％以内；被测组分含量低于10μg/kg，CV在21％以内；被测组分含量低于1μg/kg，CV在30％以内。本试验用浓度50ng/ml的标准品重复上机六次，结果：保留时间的变异系数为0.5876％，峰高的变异系数为4.7619％，峰面积的变异系数为5.3055％。说明，平行性和重现性满足GB/T 27404-2008要求，方法精密度高。

表2褪黑素精密度试验结果

6.3样品回收率

样品加标回收率可反映出检测方法的准确度。依据我国国家标准GB/T 27417-2017合格评定-化学分析方法确认和验证指南中对检测方法的技术要求，当被测组分含量在0.1～1mg/kg，回收率范围在80％～110％；当被测组分含量低于0.1ng/kg，回收率范围在60％～120％。本试验粪便进行加标实验，结果显示，加标1000ng/g时，各种样品加标平均回收率在83％～105％；加标2500ng/g时，各种样品加标平均回收率在94％～97％；加标5000ng/g时，各种样品加标平均回收率在106％～109％。说明，粪便中回收率的结果满足GB/T 27417-2017的要求，表明本试验所建立的检测方法准确性良好。

表3粪便加标回收率

7、检测本发明方法的适用性

同时比较本发明方法与ELISA(酶联免疫吸附测定法)的准确性。

5个粪样，1号只加粪样；2号中粪样加25ng褪黑素；3号中粪样加50ng的褪黑素；4号中粪样加250ng的褪黑素；5号中粪样加250ng的褪黑素，然后用上述方法提取大熊猫粪样中的褪黑素。

液相色谱检测大熊猫粪中褪黑素与ELISA检测大熊猫粪中褪黑素比较发现，液相色谱测得结果明显比ELISA检测结果好。

表4粪便加标测得浓度与ELISA测得浓度比较

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。