一种三叶青药材中山柰酚-3-o-芸香糖苷含量的测定方法
阅读说明：本技术 一种三叶青药材中山柰酚-3-o-芸香糖苷含量的测定方法 (Method for determining content of kaempferol-3-O-rutinoside in radix tetrastigme medicinal material ) 是由 李洪玉 张红心 李礼斌 王娜妮 许平翠 寿旦 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法,属于化学检测技术领域。本发明使用高效液相色谱法对三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量进行测定,取样量小、提取溶剂用量少、提取溶液不需要浓缩,测定方法简便快速且重复性好,能够对三叶青药材的质量进行准确评价。实施例结果表明,本发明方法所得谱图山柰酚-3-O-芸香糖苷峰与其他峰的分离度大于1.5,说明其分离度好；在线性关系试验中,本发明测定方法进样量在0.004～0.12μg范围内线性关系良好；在重复性试验中,本发明测定方法山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的相对标准偏差为2.76％,说明本发明方法重复性良好。(The invention provides a method for determining the content of kaempferol-3-O-rutinoside in a radix tetrastigme medicinal material, and belongs to the technical field of chemical detection. The method uses the high performance liquid chromatography to determine the content of kaempferol-3-O-rutinoside in the radix tetrastigme medicinal material, has the advantages of small sample amount, small using amount of extraction solvent, no need of concentrating the extraction solution, simple, convenient and quick determination method and good repeatability, and can accurately evaluate the quality of the radix tetrastigme medicinal material. The example results show that the separation degree of the kaempferol-3-O-rutinoside peak and other peaks obtained by the method is more than 1.5, which indicates that the separation degree is good; in a linear relation test, the linear relation of the sample introduction amount of the measuring method is good within the range of 0.004-0.12 mu g; in a repeatability test, the relative standard deviation of the content of the kaempferol-3-O-rutinoside in the determination method is 2.76%, which shows that the repeatability of the method is good.)
技术领域
本发明涉及药物中间体生产技术领域，特别涉及一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法。
背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)为葡萄科三叶崖爬藤属多年生常绿藤本植物，是我国特有的珍稀药用植物。三叶青具有清热解毒、消肿止痛、化痰散结的功效，用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎、毒蛇咬伤等症。三叶青主要分布在浙江、江西、福建、湖南、广西、贵州等地。
目前，三叶青药材的质量控制成分为三叶青中黄酮类物质。使用高效液相色谱法对三叶青中黄酮类成分进行测定时，由于三叶青中黄酮类成分种类较多，需要的样品取样量较大，为3.0～4.0g；提取溶剂用量多，为40～50mL，且提取后溶液需要浓缩，测定方法较为繁琐。因此，需要寻找一种新的三叶青药材质量控制成分及其测定方法，以降低样品取样量和提取溶剂用量，并简化测定过程。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法。本发明通过对三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷进行高效液相色谱测试，取样量小，提取溶剂用量少，方法简单，且能够对三叶青药材的质量进行准确评价。
为了实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法，包括以下步骤：
(1)将三叶青粉末与甲醇混合，依次进行超声提取和微滤，所述微滤得到的滤液为供试品溶液；所述三叶青粉末的质量为0.11～0.22g，所述甲醇的体积为5～10mL；
(2)取样所述供试品溶液进行高效液相色谱测试，得到供试品液相色谱测试结果；
所述高效液相色谱测试的条件包括：
色谱柱为CAPCELL PAK C18，所述色谱柱的柱长为250mm，柱径为4.6mm，填料粒径为5μm；
所述高效液相色谱的柱温为30℃；
所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为纯水；所述流动相A和B的流速为1.0mL/min；
所述流动相的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：
0min时，流动相A与B的体积比为15：85；
30min时，流动相A与B的体积比为30：70；
(3)根据预定的标准曲线和所述步骤(2)得到的供试品液相色谱测试结果，得到所述供试品溶液的理论进样量，所述标准曲线为山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量与液相色谱峰面积之间的线性关系曲线；
(4)根据所述步骤(3)得到的理论进样量和所述步骤(2)的实际进样量，得到三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量。
优选的，所述三叶青粉末的粒度≥40目。
优选的，所述超声提取的功率为300～400W，频率为40kHz，时间为50～60min。
优选的，所述微滤的方法为微孔膜过滤。
优选的，所述微滤用微孔膜为醇溶性微孔膜，孔径为0.45μm。
优选的，所述高效液相色谱测试的进样量为5～10μL。
优选的，所述高效液相色谱测试的检测器为紫外可见光检测器；所述检测器的检测波长为350nm。
本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法，山柰酚-3-O-芸香糖苷在三叶青药材黄酮类成分中含量较高，且是三叶青抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用的活性成分。本发明使用三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷作为质量控制成分，通过高效液相色谱法对三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量进行测定，取样量小、提取溶剂用量少、提取溶液不需要浓缩，测定方法简便快速且重复性好，能够对三叶青药材的质量进行准确评价。实施例结果表明，本发明方法所得谱图山柰酚-3-O-芸香糖苷峰与其他峰的分离度大于1.5，说明其分离度好；在线性关系试验中，本发明测定方法进样量在0.004～0.12μg范围内线性关系良好；在重复性试验中，本发明测定方法山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的相对标准偏差为2.76％，说明本发明方法重复性良好。
附图说明
图1为1μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱；
图2为3μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱；
图3为5μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱；
图4为7μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱；
图5为10μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱；
图6为3μL(0.04mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱；
图7为对照品溶液的标准曲线图；
图8为实施例1中供试品溶液的HPLC图谱；
图9为实施例2中供试品溶液的HPLC图谱；
图10为实施例3中供试品溶液的HPLC图谱；
图11为实施例4中供试品溶液的HPLC图谱；
图12为实施例5中供试品溶液的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法，包括以下步骤：
(1)将三叶青粉末与甲醇混合，依次进行超声提取和微滤，所述微滤得到的滤液为供试品溶液；所述三叶青粉末的质量为0.11～0.22g，所述甲醇的体积为5～10mL；
(2)取样所述供试品溶液进行高效液相色谱测试，得到供试品液相色谱测试结果；
所述高效液相色谱测试的条件包括：
色谱柱为CAPCELL PAK C18，所述色谱柱的柱长为250mm，柱径为4.6mm，填料粒径为5μm；
所述高效液相色谱的柱温为30℃；
所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为纯水；所述流动相的流速为1.0mL/min；
所述流动相的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：
0min时，流动相A与B的体积比为15：85；
30min时，流动相A与B的体积比为30：70；
(3)根据预定的标准曲线和所述步骤(2)得到的供试品液相色谱测试结果，得到所述供试品溶液的理论进样量，所述标准曲线为山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量与液相色谱峰面积之间的线性关系曲线；
(4)根据所述步骤(3)得到的理论进样量和所述步骤(2)的实际进样量，得到三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量。
本发明将三叶青粉末与甲醇混合，依次进行超声提取和微滤，所述微滤得到的滤液为供试品溶液。在本发明中，所述三叶青粉末的制备方法优选包括以下步骤：
将三叶青药材依次进行粉碎和过筛，得到三叶青粉末。
本发明对所述粉碎的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的粉碎方式即可。在本发明中，所述过筛优选为过40～60目筛，所述三叶青粉末的粒度优选≥40目，更优选≥60目。
在本发明中，所述三叶青粉末的质量为0.11～0.22g，优选为0.2g；所述甲醇的体积为5～10mL，优选为10mL。本发明对所述三叶青粉末与甲醇的混合方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合。在本发明中，所述超声提取的功率优选为300～400W，更优选为350W；所述超声提取的频率优选为40kHz，时间优选为50～60min，更优选为52～56min。本发明在所述超声提取后，优选将所得溶液冷却至室温并用甲醇补足减失量。本发明使用甲醇作为提取剂，能够将目标组分充分的提取出来。
在本发明中，所述过滤的方式优选为微孔膜过滤，所述微孔膜优选为醇溶性微孔膜，所述微孔膜的孔径优选为0.45μm。
本发明得到所述滤液后，不需要浓缩，所述滤液直接作为供试品溶液进样。
得到供试品溶液后，本发明取样所述供试品溶液进行高效液相色谱测试，得到供试品液相色谱测试结果。在本发明中，所述高效液相色谱测试的进样量优选为5～10μL。在本发明中，所述高效液相色谱测试的条件包括：
色谱柱为CAPCELL PAK C18，所述色谱柱的柱长为250mm，柱径为4.6mm，填料粒径为5μm；
所述高效液相色谱的柱温为30℃；
所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为纯水；所述流动相的流速为1.0mL/min；
所述流动相的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：
0min时，流动相A与B的体积比为15：85；
30min时，流动相A与B的体积比为30：70。
在本发明中，所述高效液相色谱分析的检测器优选为紫外可见光检测器；所述检测器的检测波长优选为350nm。本发明通过对检测波长筛选、对洗脱程序进行设定，在进行高效液相色谱分离时，洗脱相不需要加酸，山柰酚-3-O-芸香糖苷成分即能得到很好的分离。
得到供试品液相色谱测试结果后，本发明根据预定的标准曲线和所述步骤(2)得到的供试品液相色谱测试结果，得到所述供试品溶液的理论进样量，所述标准曲线为山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量与液相色谱峰面积之间的线性关系曲线。
在本发明中，所述标准曲线的获得方法优选为：
提供山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液；
对不同进样量的对照品溶液进行高效液相色谱分析，得到对照品液相色谱图和山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积；
以峰面积为纵坐标，以山柰酚-3-O-芸香糖苷进样量为横坐标绘制标准曲线。
在本发明中，所述对照品溶液的浓度优选为0.004mg/mL。在本发明中，所述提供山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液优选包括以下步骤：
称取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品1.6mg，加甲醇溶解定容至1mL，取0.25mL置于10mL容量瓶中加甲醇定容，再取1mL溶液至10mL的容量瓶中加甲醇定容，得浓度为0.004mg/mL的山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液。
在本发明中，对不同进样量的对照品溶液进行高效液相色谱分析时，所选取的对照品溶液的进样量优选为1μL(浓度为0.004mg/mL)、3μL(浓度为0.004mg/mL)、5μL(浓度为0.004mg/mL)、7μL(浓度为0.004mg/mL)、10μL(浓度为0.004mg/mL)和3μL(浓度为0.04mg/mL)；所述对对照品溶液进行高效液相色谱测试时，高效液相色谱测试的条件、检测器种类和检测波长与上文相同，在此不再赘述。
得到对照品液相色谱图和山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积后，本发明以峰面积为纵坐标，以山柰酚-3-O-芸香糖苷进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线。本发明对所述绘制标准曲线的方法没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的绘制标准曲线的方法即可。在本发明中，所述进样量与山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积呈正相关。作为本发明的一个具体实施例，所述标准曲线为Y＝175.74x+2047.3。
得到标准曲线后，本发明根据所述供试品液相色谱图和山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积，以及标准曲线得到供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷进样质量(μg)；得到供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷进质样量后，本发明根据式I计算得到供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量浓度；
式I中，C供试品为供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量浓度，mg/mL；
m进样为供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的进样质量，mg；
V进样为供试品溶液的进样体积，mL；
得到供试品溶液的质量浓度后，本发明根据式II计算得到三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量含量：
式II中，A为三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量，％；
C供试品为供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量浓度，mg/mL；
V供试品为供试品溶液的体积，mL；
m三叶青为三叶青粉末的质量，mg。
本发明使用高效液相色谱法对三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量进行测定，取样量小、提取溶剂用量少、提取溶液不需要浓缩，测定方法简便快速且重复性好，能够对三叶青药材的质量进行准确评价。
下面结合实施例对本发明提供的三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
专属性实验：
(1)精密称取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品(购买于成都埃法生物科技有限公司，批号：AF8112493，纯度：98％)1.6mg，加甲醇溶解定容至1mL，取0.25ml置于10mL容量瓶中加甲醇定容，再取1mL溶液至10mL的容量瓶中加甲醇定容，得浓度为0.004mg/mL的山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液。
(2)取三叶青药材饮片适量，粉碎，过60目筛，称取三叶青粉末0.2g，精密称定，置于10mL容量瓶中加甲醇定容，密塞，超声(功率：400W，频率：40kHz)60min，放冷至室温，用甲醇补足减失量，取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
(3)分别精密吸取对照品溶液1μL(0.004mg/mL)、3μL(0.004mg/mL)、5μL(0.004mg/mL)、7μL(0.004mg/mL)、10μL(0.004mg/mL)和3μL(0.04mg/mL)进行高效液相色谱分析，测定山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积，其中1μL(0.004mg/mL)、3μL(0.004mg/mL)、5μL(0.004mg/mL)、7μL(0.004mg/mL)、10μL(0.004mg/mL)和3μL(0.04mg/mL)对照品溶液的高效液相色谱分析(HPLC)图谱分别如图1～6所示，图1～6中的出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰；
其中高效液相色谱分析的参数为：色谱柱：CAPCELLC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为乙腈，B为纯水；梯度洗脱(0～30min，85％～70％B)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测器为紫外可见光检测器，检测波长：350nm；进样量：10μL；以峰面积为纵坐标，以山柰酚-3-O-芸香糖苷进样量为横坐标绘制标准曲线；其中线性回归方程数据如表1所示：
表1线性回归方程数据
所得标准曲线如图7所示，进样量0.004～0.12μg范围内线性关系良好。
(4)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析，分析参数与步骤(3)相同，所得HPLC图谱如图8所示，图8中21.456min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰，由图8可知，所得谱图山柰酚-3-O-芸香糖苷峰与其他峰的分离度大于1.5，说明其分离度好；通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00867％。
实施例2
(1)取三叶青药材饮片适量，粉碎，过60目筛，称取三叶青粉末0.2g，精密称定，置于10mL容量瓶中加甲醇定容，密塞，超声(功率：400W，频率：40kHz)60min，放冷至室温，用甲醇补足减失量，取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析，分析参数与实施例1相同，所得HPLC图谱如图9所示，图9中21.451min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰，通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00927％。
实施例3
(1)取三叶青药材饮片适量，粉碎，过40目筛，称取三叶青粉末0.2g，精密称定,置于10mL容量瓶中加甲醇定容，密塞，超声(功率：400W，频率：40kHz)55min，放冷至室温，用甲醇补足减失量，取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析，分析参数与实施例1相同，所得HPLC图谱如图10所示，图10中21.541min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰，通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00907％。
实施例4
(1)取三叶青药材饮片适量，粉碎，过60目筛，称取三叶青粉末0.2g，精密称定，置于10mL容量瓶中加甲醇定容，密塞，超声(功率：400W，频率：40kHz)60min，放冷至室温，用甲醇补足减失量，取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析，分析参数与实施例1相同，所得HPLC图谱如图11所示，图11中21.454min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰，通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00934％。
实施例5
(1)取三叶青药材饮片适量，粉碎，过40目筛，称取三叶青粉末0.2g，精密称定，置于10mL容量瓶中加甲醇定容，密塞，超声(功率：400W，频率：40kHz)60min，放冷至室温，用甲醇补足减失量，取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析，分析参数与实施例1相同，所得HPLC图谱如图12所示，图12中21.360min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰，通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00929％。
测试例1
(1)精密度试验
分别取10μL对照品溶液，按实施例1的色谱条件连续进样5次，记录各峰面积于表2中；经计算，山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.49％(n＝5)，表明本发明使用仪器精密度良好。
表2精密度试验所得各峰面积
进样次数
第1次进样
第2次进样
第3次进样
第4次进样
第5次进样
峰面积
73192
74574
76253
75538
78220
(2)重复性试验
取同一批三叶青(购买于亳州市齐心药业销售有限公司，批号：191022)，平行取样5份，按实施例1的方法制备供试品溶液，按照实施例1的色谱条件进行分析，记录峰面积并计算含量于表3中；经计算，山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的相对标准偏差(RSD)为2.76％(n＝5)，表明本发明所述方法重复性良好。
表3重复性试验所得各峰面积和含量
(3)稳定性试验
取实施例1中的供试品溶液，于室温下放置0、6、10、12、24h后，按照实施例1的色谱条件进行分析，记录峰面积于表4中；经计算，山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.62％(n＝5)，表明本发明供试品溶液在24h内能够保持稳定。
表4稳定性试验所得各峰面积
放置时间h
0
6
10
12
24
峰面积
38271
37106
36988
37895
39437
(4)加样回收率试验
取已知含量的三叶青粉末(批号：191022)5份，精密称定适量，分别加入等量的已知含量的山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液，按照实施例1的方法制备供试品溶液，按照实施例1的色谱条件进行分析，计算加样回收率，记录结果于表5中。经计算，山柰酚-3-O-芸香糖苷平均加样回收率为97.3％，相对标准偏差(RSD)为3.83％(n＝5)。
表5加样回收率试验数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。