阅读说明：本技术 一种多黏菌素b的氨基酸构型分析方法和n-多肽端序列测序方法 (Polymyxin B amino acid configuration analysis method and N-polypeptide terminal sequence sequencing method ) 是由 张含智 刘浩 罗文燕 顿俊玲 于 2020-04-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法和N-多肽端序列测序方法,建立了多黏菌素B组分的液相纯化方法,可以快速从多黏菌素B组分中纯化分离出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；建立了多黏菌素B酶解组分的制备方法和液相纯化方法,可快速纯化分离出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I的酶解组分；采用多黏菌素B组分水解-氨基酸手性衍生-液质联用测定氨基酸构型；采用多黏菌素B组分酶解-液相色谱纯化-蛋白质测序联用测定N-多肽端序列,为严格控制多黏菌素B的质量提供了研究基础。(The invention discloses an amino acid configuration analysis method and an N-polypeptide terminal sequence sequencing method of polymyxin B, and establishes a liquid phase purification method of a polymyxin B component, so that polymyxin B1, polymyxin B2 and polymyxin B1-I can be quickly purified and separated from the polymyxin B component; a preparation method and a liquid phase purification method of the polymyxin B enzymatic component are established, and the polymyxin B1, polymyxin B2 and polymyxin B1-I enzymatic components can be quickly purified and separated; the amino acid configuration is determined by adopting polymyxin B component hydrolysis-amino acid chiral derivation-liquid chromatography-mass spectrometry; the N-polypeptide terminal sequence is determined by adopting the combination of polymyxin B component enzymolysis, liquid chromatography purification and protein sequencing, and a research basis is provided for strictly controlling the quality of polymyxin B.)

一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法和N-多肽端序列测序 方法

技术领域

本发明涉及药物分析化学领域，尤其涉及一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法和N-多肽端序列测序方法。

背景技术

多黏菌素B为脂肽类抗菌肽，对革兰氏阴性杆菌有强效杀菌作用，是临床治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的“最后一道防线”。主要组分为多黏菌素B1、B2及B1-I，结构式见附图1，前两者氨基酸包括L-2,4-二氨基丁酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸及D-苯丙氨酸，B1-I中的L-亮氨酸由L-异亮氨酸取代；并且，多黏菌素是发酵产物，在生产过程中可能发生氨基酸的构型转化。氨基酸的改变及D-/L-构型的差异会造成抗菌活性及肾毒性的较大变化，必须对其氨基酸及其构型进行监控以保证药品安全。另外，也有必要确认多肽序列即氨基酸连接次序是否正确。

目前，对氨基酸构型的分析方法包括水解后的手性衍生-色谱/质谱法、直接采用手性色谱分析，但这种方法测定的是氨基酸混合物，无法确定每个位点的氨基酸及其构型。N-端测序(Edman降解法)是常见的测定氨基酸序列的方法，可以弥补以上缺陷，即从N-端开始测定每个位点的氨基酸，但需裸露出N-端氨基酸的α-氨基。

因此，建立一种简单易操作的分析方法用于多黏菌素B的氨基酸构型分析和N-多肽端序列测序，为严格控制多黏菌素B的质量提供研究基础，是本发明技术人员急需解决的问题。

发明内容

本发明为解决现有技术存在的缺陷，提出一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法和N-多肽端序列测序方法，简单易操作，用于多黏菌素B的氨基酸构型分析和N-多肽端序列测序，为严格控制多黏菌素B的质量提供了研究基础。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法，包括如下步骤：

S1：采用液相色谱法从多黏菌素B混合组分中分离纯化出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；

S2：将纯化的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I分别于氘代盐酸的重水溶液中加热水解，得到供试品溶液，然后分别采用手性Marfey′s试剂将对照品溶液和水解后的供试品溶液进行衍生化反应；

S3：将步骤S2衍生化后的对照品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱-质谱分析。

进一步地，所述多黏菌素B的氨基酸构型分析方法，包括如下步骤：

S1：从多黏菌素B混合组分中分离纯化出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；

称取多黏菌素B混合组分加入溶剂，配制成浓度为2-40mg/mL的溶液，采用液相色谱法纯化；

液相色谱条件十八烷基键合硅胶色谱柱；进样量100-1000μL；流动相A为水，含有0.01-1％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈或甲醇，流动相A:流动相B＝50:50-90:10(v/v)；流速为5-20mL/min；紫外吸收波长190-280nm；补充液为含0.01-1％甲酸的50-90％甲醇水溶液，补充液流速为0.2-0.8mL/min；

S2：将纯化的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I分别于氘代盐酸的重水溶液中加热水解，得到供试品溶液，然后分别采用手性Marfey′s试剂将对照品溶液和水解后的供试品溶液进行衍生化反应；

S3：将步骤S2衍生化后的对照品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱-质谱分析；

液相色谱条件常规反相色谱柱；柱温25-40℃；检测波长为340nm；动相A为水，含有0.01-0.2％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈或甲醇；流速为0.8-1.8mL/min，进质谱检测前分流，分流比为2:1；梯度洗脱；

质谱条件质谱离子源为ESI或APCI，扫描模式正负模式均可，质量检测器为空间/线性离子肼、飞行时间或三重四级杆质谱。

进一步地，S1中，所述多黏菌素B混合组分为多黏菌素B原料药、注射剂或软膏剂；所述溶剂为水和乙腈，其体积比为水:乙腈＝50:50-90:10。

进一步地，经S1纯化得到的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I，可采用HPLC-Q/TOF-MS测试其精确的分子量和纯度；

色谱条件为：流动相A为水，含有0.01-0.2％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈，含有0.01-0.2％甲酸(v/v)，流流动相A:流动相B＝80:20(v/v)，柱温25-60℃，流速为0.8-1.8mL/min，进样量2-10μL。

质谱条件为：电喷雾-单四级杆质谱的正离子扫描模式，质荷比300-1200。

进一步地，所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I的进样浓度均为1-10mg/mL，其中的溶剂为水和乙腈，其体积比为水:乙腈＝50:50-90:10。

进一步地，S2中，所述加热水解具体为：分别将多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I溶解于摩尔浓度为4-8mol/L的氘代盐酸重水溶液中，使所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I的浓度均为0.5-2mg/mL，充氮气，密封，于温度100-140℃下热解5-24h，冷却至室温，分别加入4-8mol/L氢氧化钠溶液，中和至中性，即得供试品溶液。

进一步地，S2中，所述Marfey′s试剂为L/D-FDAA、FDVA、FDLA或FDPA，用于溶解所述Marfey′s试剂的溶剂为二甲亚砜、丙酮或乙醇，Marfey′s试剂溶液的浓度为0.5-4mg/mL。

进一步地，S2中，所述衍生化反应具体为：分别量取多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I供试品溶液20-80μL和0.1-1mg/mL的对照品溶液10-60μL，置液相进样瓶中，加入Marfey′s试剂溶液30-80μL和碱性溶液10-50μL，混匀，置水浴中反应30-90min，取出，放冷至室温，加入0.02-0.08mol/L的乙酸溶液10-50μL使成中性。

进一步地，所述对照品为D/L-亮氨酸、D/L-异亮氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-苏氨酸和D/L-2,4-二氨基丁酸；所述碱性溶液为0.02-0.08mol/L的三乙胺溶液或碳酸氢钠溶液；所述水浴的温度为40-60℃。

进一步地，S3中，所述梯度洗脱的洗脱条件如下：

0min时，流动相A为73％，流动相B为27％；

5min时，流动相A为60％，流动相B为40％；

15min时，流动相A为60％，流动相B为40％；

20min时，流动相A为50％，流动相B为50％；

34min时，流动相A为50％，流动相B为50％；

36min时，流动相A为20％，流动相B为80％；

44min时，流动相A为20％，流动相B为80％；

45min时，流动相A为73％，流动相B为27％；

50min时，流动相A为73％，流动相B为27％。

本发明的第二方面是提供一种多黏菌素B的N-多肽端序列测序方法，包括如下步骤：

S1：采用液相色谱法从多黏菌素B混合组分中分离纯化出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；

S2：将纯化的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I分别进行酶解，得到酶解产物溶液，采用液相色谱法将所述酶解产物溶液纯化，得到多黏菌素B1、多黏菌素B2、多黏菌素B1-I的酶解产物；

S3：将S2得到酶解产物溶解后，加入经聚凝胺处理的玻璃纤维膜上，干燥后安装到蛋白质测序仪PPSQ-53A上进行分析，循环数设置为9。

进一步地，所述多黏菌素B的N-多肽端序列测序方法，包括如下步骤：

S1：从多黏菌素B混合组分中分离纯化出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；

称取多黏菌素B混合组分加入溶剂，配制成浓度为2-40mg/mL的溶液，采用液相色谱法纯化；

液相色谱条件十八烷基键合硅胶色谱柱；进样量100-1000μL；流动相A为水，含有0.01-1％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈或甲醇，流动相A:流动相B＝50:50-90:10(v/v)；流速为5-20mL/min；紫外吸收波长190-280nm；补充液为含0.01-1％甲酸的50-90％甲醇水溶液，补充液流速为0.2-0.8mL/min；

S2：将纯化的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I分别进行酶解，得到酶解产物溶液；

所述酶解产物溶液采用十八烷基键合硅胶色谱柱；流动相A为水，含有0.01-1％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈或甲醇，梯度洗脱；流速为5-20mL/min，进样量100-1000μL，紫外吸收波长190-280nm；补充液为含0.01-1％甲酸的50-90％甲醇水溶液，流速为0.2-0.8mL/min；选择电喷雾-单四级杆质谱的正离子扫描模式，质荷比300-1200，分别收集多黏菌素B1、多黏菌素B2、多黏菌素B1-I的酶解产物；

S3：将S2得到酶解产物溶解后，加入经聚凝胺处理的玻璃纤维膜上，干燥后安装到蛋白质测序仪PPSQ-53A上进行分析，循环数设置为9。

进一步地，经S2得到的酶解产物还经旋转蒸发仪去除水分，冻干，得白色粉末。

进一步地，S2中，所述梯度洗脱的洗脱条件如下：

0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；

5min时，流动相A为95％，流动相B为5％；

6min时，流动相A为70％，流动相B为30％；

10min时，流动相A为60％，流动相B为40％；

11min时，流动相A为95％，流动相B为5％；

15min时，流动相A为95％，流动相B为5％；

进一步地，S2中，所述酶解具体为：称取10-100mg纯化后的多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I，溶于5-20mL的0.1mol/L的磷酸二氢钾缓冲液中；称量10-20mg蛋白酶溶于2.5ml氯化钠溶液中，相当于蛋白酶为1U/mL，在37℃水浴中孵育10-60min；将上述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I溶液分别加入到预热的蛋白酶溶液中，30-50℃水浴10-24h，煮沸10min，离心10min后，过滤，备用。

进一步地，所述蛋白酶为草杆菌蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶或链霉蛋白酶；所述氯化钠溶液浓度为3mol/L。

进一步地，S3中，采用反相色谱分离，分离柱为Wakosil PTH-IIcolumn，4.6×250mm，流动相为30-50％乙腈的水溶液，等度洗脱，流速为0.5-2.0mL/min；柱温为25-45℃，检测波长为269nm。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明建立了多黏菌素B组分的液相纯化方法，可以快速从多黏菌素B组分中纯化分离出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；建立了多黏菌素B酶解组分的制备方法和液相纯化方法，可快速纯化多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I的酶解组分；采用多黏菌素B组分水解-氨基酸手性衍生-液质联用测定氨基酸构型；采用多黏菌素B组分酶解-液相色谱纯化-蛋白质测序联用测定N-多肽端序列，为严格控制多黏菌素B的质量提供了研究基础。

本发明的氨基酸构型分析方法和N-多肽端序列测序方法，也可用于分析其他的多黏菌素的组分，可以全面且精细地控制多肽药品的质量。

附图说明

图1为多黏菌素B1、多黏菌素B2、多黏菌素B1-I的结构式；

图2为纯化多黏菌素B1的质谱总离子流图；

图3为纯化多黏菌素B1的质谱图；

图4为纯化多黏菌素B2的质谱总离子流图；

图5为纯化多黏菌素B2的质谱图；

图6为纯化多黏菌素B1-I的质谱总离子流图；

图7为纯化多黏菌素B1-I的质谱图；

图8为10种氨基酸对照品的典型色谱图(8-A)及总离子流图(8-B)；

图9为多黏菌素B1中各氨基酸-FDAA衍生物的总离子流图(9-A)、典型色谱图(9-B)及提取离子流色谱图(9-C、D、E、F)；

图10为多黏菌素B2中各氨基酸-FDAA衍生物的总离子流图(10-A)、典型色谱图(10-B)及提取离子流色谱图(10-C、D、E、F)；

图11为多黏菌素B1-I中各氨基酸-FDAA衍生物的总离子流图(11-A)、典型色谱图(11-B)及提取离子流色谱图(11-C、D、E、F)；

图12为多黏菌素B1、多黏菌素B2的酶解产物结构式；

图13为多黏菌素B1-I的酶解产物结构式；

图14为多黏菌素B1酶解产物的总离子流图；

图15为多黏菌素B1酶解产物的质谱图；

图16为多黏菌素B1酶解产物的氨基酸序列测定图；

图17为多黏菌素B2酶解产物的氨基酸序列测定图；

图18为多黏菌素B1-I酶解产物的氨基酸序列测定图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

仪器与试药：

Agilent 1290型高效液相色谱仪-6550QTOF-MS(美国Agilent Technologies公司)。质谱引导的Waters自动纯化系统(沃特世科技(上海)有限公司)；冻干机(美国LABCONCO型真空冻干机)。

多黏菌素B《中国药典》对照品(批号：130313201310)

实施例1

本实施例提供了从多黏菌素B混合组分中分离纯化出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I的方法：

称取多黏菌素B混合组分加入溶剂，配制成浓度为10mg/mL的溶液，溶剂为水:乙腈＝80:20(v/v)，采用液相色谱法纯化；

十八烷基键合硅胶色谱柱；进样量500μL；流动相A为水，含有0.1％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈，流动相A:流动相B＝85:15(v/v)；流速为15mL/min；紫外吸收波长215nm；补充液为含0.1％甲酸的90％甲醇水溶液，补充液流速为0.45mL/min；

选择电喷雾-单四级杆质谱的正离子扫描模式，质荷比范围：300-1200。收集多黏菌素B1(m/z 602.4，[M+2H]²⁺)、多黏菌素B2(m/z 595.4，[M+2H]²⁺)、多黏菌素B1-I(m/z602.4，[M+2H]²⁺)，经旋转蒸发仪去除水分，冻干，得白色粉末。

将上述纯化后的多黏菌素B1，溶解于溶剂水:乙腈＝80:20(v/v)，浓度为2mg/mL，经HPLC-Q/TOF-MS测试精确分子量(m/z 602.3848，[M+2H]²⁺)及纯度(98.5％)，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，流动相A:流动相B＝80:20，柱温为50℃，流速为1mL/min；进样量为5μL；上述多黏菌素B1的总离子流图如图2所示，质谱图如图3所示。

将上述纯化后的多黏菌素B2，溶解于水:乙腈＝80:20(v/v)，浓度为2mg/mL，经HPLC-Q/TOF-MS测试精确分子量(m/z 595.3770，[M+2H]²⁺)及纯度(98.7％)。上述多黏菌素B2的总离子流图如图4所示，质谱图如图5所示。

将上述纯化后的多黏菌素B1-I，溶解于水:乙腈＝80:20(v/v)，浓度为2mg/mL，经HPLC-Q/TOF-MS测试精确分子量(m/z 602.3847，[M+2H]²⁺)及纯度(94.5％)。上述多黏菌素B1-I的总离子流图如图6所示，质谱图如图7所示。

实施例2

本实施例提供了一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法：

分别将实施例1纯化得到的多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I溶解于摩尔浓度为6mol/L的氘代盐酸重水溶液中，使所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I的浓度均为2mg/mL，充氮气，密封，于温度110℃下热解7h，冷却至室温，分别加入6mol/L氢氧化钠溶液，中和至中性，即得供试品溶液。

分别量取多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I供试品溶液50μL和0.5mg/mL的对照品(D/L-亮氨酸、D/L-异亮氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-苏氨酸和D/L-2,4-二氨基丁酸)溶液30μL，置液相进样瓶中，加入Marfey′s试剂溶液50μL和0.02-0.08mol/L的三乙胺溶液或碳酸氢钠溶液20μL，混匀，置40℃水浴中反应60min，取出，放冷至室温，加入0.05mol/L的乙酸溶液20μL使成中性；其中，所述Marfey′s试剂为L/D-FDAA、FDVA、FDLA或FDPA，用于溶解所述Marfey′s试剂的溶剂为二甲亚砜、丙酮或乙醇，Marfey′s试剂溶液的浓度为2mg/mL。

将衍生化后的对照品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱-质谱分析：

液相色谱条件常规反相色谱柱(如C8、C18)；柱温25℃，检测波长为340nm；动相A为水，含有0.1％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈；流速为1.5mL/min，进质谱检测前分流，分流比为2:1；梯度洗脱；所述梯度洗脱的洗脱条件如表1所示：

表1

质谱条件质谱离子源为ESI或APCI，扫描模式正负模式均可，质量检测器为空间/线性离子肼、飞行时间或三重四级杆质谱。

图9、10、11分别为纯化组分多黏菌素B1、B2及B1-I经氘代盐酸水解、L-FDAA衍生后所得到的总离子流图、典型色谱图以及提取离子流色谱图。

具体：

图9为多黏菌素B1中各氨基酸-FDAA衍生物的总离子流图(9-A)、典型色谱图(9-B)及提取离子流色谱图(9-C、D、E、F)；

图10为多黏菌素B2中各氨基酸-FDAA衍生物的总离子流图(10-A)、典型色谱图(10-B)及提取离子流色谱图(10-C、D、E、F)；

图11为多黏菌素B1-I中各氨基酸-FDAA衍生物的总离子流图(11-A)、典型色谱图(11-B)及提取离子流色谱图(11-C、D、E、F)。

对比(对照品)10种氨基酸-L-FDAA衍生物的紫外典型色谱图及总离子流图(图8)，可见本发明中的方法可以实现较为理想的分离。

通过提取各氨基酸(苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、2,4-二氨基丁酸)-L-FDAA的[M+H]⁺，得到各氨基酸的提取离子流色谱图，与各对照品-FDAA衍生物的图谱(图8)进行比较，即可以判断多黏菌素B各组分中氨基酸的构型。通过本实施例通可判断多黏菌素B1中的氨基酸为L-苏氨酸、L-亮氨酸、D-苯丙氨酸、L-2,4-二氨基丁酸，判断多黏菌素B2中的氨基酸为L-苏氨酸、L-亮氨酸、D-苯丙氨酸、L-2,4-二氨基丁酸，判断多黏菌素B1-I中的氨基酸为L-苏氨酸、L-异亮氨酸、D-苯丙氨酸、L-2,4-二氨基丁酸。

实施例3

本实施例提供了多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I酶解产物的制备方法：

分别称取实施例1纯化得到的多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I50mg，溶于7.5mL的0.1mol/L的磷酸二氢钾缓冲液(pH经磷酸调至7.0)中；称量12.5mg无花果蛋白酶溶于2.5ml氯化钠溶液(3mol/L)中，相当于无花果蛋白酶为1U/mL，在37℃水浴中孵育30min；将上述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I溶液分别加入到预热的无花果蛋白酶溶液中，37℃水浴16h，煮沸10min，离心10min(eppendorf离心机，13400rpm)后，过滤，得到酶解产物溶液备用。

将上述酶解产物溶液，采用十八烷基键合硅胶制备色谱柱，流动相A采用0.1％甲酸水溶液，流动相B采用乙腈，梯度洗脱；所述梯度洗脱的洗脱条件如表2所示：

表2

流速为15mL/min；进样量为100μL；紫外吸收波长为215nm；补充液为含0.1％甲酸的90％甲醇水溶液，流速为0.45mL/min。选择电喷雾-单四级杆质谱的正离子扫描模式，质荷比范围：300-1200。分别收集多黏菌素B1、多黏菌素B2、多黏菌素B1-I的酶解产物(m/z963.6，[M+H]+)，经旋转蒸发仪去除水分，冻干，得白色粉末。

由于无花果蛋白酶可以较为专一性的去除N-脂肪酰基链和1位α,γ-L-二氨基丁酸，所以上述多黏菌素B1、多黏菌素B2、多黏菌素B1-I的酶解产物分子量一致，多黏菌素B1、多黏菌素B2的酶解产物结构式如图12所示，多黏菌素B1-I的酶解产物结构式如图13所示。以多黏菌素B1酶解产物为例，经HPLC-Q/TOF-MS测定，多黏菌素B1酶解产物的[M+H]⁺m/z为963.5786，[M+2H]²⁺m/z为482.2931，其总离子流图和质谱图分别如图14、15所示。

实施例4

本实施例提供了一种多黏菌素B的N-多肽端序列测序方法：

将实施例3得到的多黏菌素B1、多黏菌素B2、多黏菌素B1-I的酶解产物，溶于水中(浓度为5mg/mL)，加入经聚凝胺处理的玻璃纤维膜上，干燥后安装到蛋白质测序仪PPSQ-53A上进行分析(Shimadzu，Kyoto,Japan)，循环数设置为9。采用反相色谱分离，分离柱为Wakosil PTH-II column(4.6×250mm)，流动相为37％乙腈的水溶液，等度洗脱，流速为1.0mL/min；柱温为40℃，检测波长为269nm。

多黏菌素B1酶解产物的氨基酸序列图如图16所示，第一个循环中测定的氨基酸为苏氨酸(Thr)，第二个循环(有部分Thr残留)中测定的为α,γ-L-二氨基丁酸(Dab)，第三个循环中的Dab含量较小，可能是与其γ-氨基还连接在后续肽链上有关，第四个循环中测定的是Dab，第五个循环中测定的是苯丙氨酸(Phe)，第六个循环中测定的是亮氨酸(Leu)，第七个循环中测定的是Dab，第八个循环中测定的是Dab，第九个循环中测定的是Thr。

多黏菌素B2酶解产物的氨基酸序列与多黏菌素B1的相同，如图17所示。

多黏菌素B1-I酶解产物的氨基酸序列图如图18所示，与多黏菌素B1相比，仅在于第六个循环中测定的是异亮氨酸(Ile)。

综上所述，本发明的方法可以判断多黏菌素B组分的氨基酸序列及每个位点的氨基酸构型，建立了多黏菌素B序列测定及氨基酸构型分析平台。本发明中的氨基酸序列及构型测定方法简单、灵敏，适合于多肽药物的质量控制。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。