阅读说明：本技术 基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法 (Method for establishing influence of amoxicillin concentration on lactobacillus acidophilus based on metabonomics ) 是由 苏志恒 郭玥 刘西 黄慧敏 宋慧 郑华 梁永红 冯氏岁 蒙明薇 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法,包括：以不同浓度阿莫西林给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行液质联用分析,得到代谢物的碎片信息；通过建立正交偏最小二乘法判别分析模型对代谢物的碎片信息进行筛选,得到潜在的生物标志物；其中,筛选条件为变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1、p值小于0.05；对潜在的生物标志物进行代谢通路富集,得到不同浓度阿莫西林引起嗜酸乳杆菌代谢紊乱发生发展的相关重要代谢通路；将重要的代谢通路里的潜在生物标志物通过代谢通路连接起来,得到综合代谢网络。本发明建立阿莫西林通过影响嗜酸乳杆菌代谢而造成损伤的方法,得到在阿莫西林用于嗜酸乳杆菌时,嗜酸乳杆菌的代谢物以及代谢通路之间的联系,以便对阿莫西林诱导的嗜酸乳杆菌损伤的作用机理进一步的研究。(The invention discloses a method for establishing the influence of amoxicillin concentration on lactobacillus acidophilus based on metabonomics, which comprises the following steps: carrying out LC-MS analysis on intracellular metabolites of lactobacillus acidophilus after the amoxicillin with different concentrations is administrated, and obtaining fragment information of the metabolites; screening fragment information of the metabolite by establishing an orthogonal partial least square method discriminant analysis model to obtain a potential biomarker; wherein the screening conditions are that the projection value of the variable importance is greater than 1, the absolute value of the difference multiple is greater than 1, and the p value is less than 0.05; carrying out metabolic pathway enrichment on the potential biomarker to obtain relevant important metabolic pathways for development of lactobacillus acidophilus metabolic disorder caused by amoxicillin with different concentrations; potential biomarkers in important metabolic pathways are connected through the metabolic pathways to obtain the comprehensive metabolic network. The invention establishes a method for causing damage to amoxicillin by influencing the metabolism of lactobacillus acidophilus, and obtains the relation between the metabolite of lactobacillus acidophilus and the metabolic pathway when amoxicillin is used for lactobacillus acidophilus, so as to further research the action mechanism of the lactobacillus acidophilus damage induced by amoxicillin.)

基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，具体涉及嗜酸乳杆菌代谢产物用于阿莫西林浓度的筛选方法。

背景技术

抗生素在临床使用过程中会出现一些不良反应，其中，胃肠道反应其中比较常见的一种。比如，抗生素相关性腹泻。其实抗生素引起腹泻是因为它在抗菌作用的同时破坏了肠道菌群的稳态平衡，在杀死有害菌的同时也伤害了益生菌。已有研究表明，乳杆菌是对健康有益的益生菌，而且在给抗生素给药之后会对它造成损伤。

阿莫西林是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，在酸性条件下稳定，胃肠道吸收率达90％。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞膜的能力也强。是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一，其制剂有胶囊、片剂、颗粒剂、分散片等等。阿莫西林具有很强的杀菌作用，可以杀死敏感细菌，并与益生菌结合在肠道粘膜上暴露出许多细菌定植靶标，从而为病原菌留下定居空间并使它们繁殖。优势菌群的形成导致肠道微生态破坏。但是，目前还没有明确阿莫西林诱导的嗜酸乳杆菌损伤的作用机理，因而无法为阿莫西林在嗜酸性乳酸杆菌应用的临床应用提供依据。

嗜酸乳杆菌是乳酸菌中最具有代表性的一个菌种，是人体肠道中为数不多的有益菌之一，可以改善肠道菌群平衡、增强免疫力、降低胆固醇水平、缓解乳糖不耐症、抑制肿瘤的形成，并且被认为是一种对人体安全的食品添加剂，广泛应用于各种食品中。然而，近年来，在治疗疾病的过程中，由于抗生素的大量使用，肠道微生物群出现紊乱，有益菌减少，病原菌增加,微生物的种类多样性减少，菌群代谢功能变化，严重的情况还会导致肠道疾病等等。

因此，亟需一种基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的另一个目的是提供一种能够明确阿莫西林诱导的嗜酸乳杆菌损伤的作用机理的基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供一种基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法，其中，包括：

以不同浓度阿莫西林给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行液质联用分析，得到代谢物的碎片信息。

通过建立正交偏最小二乘法判别分析模型对代谢物的碎片信息进行筛选，得到潜在的生物标志物；其中，筛选条件为变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1、p值小于0.05。

对潜在的生物标志物进行代谢通路富集，得到不同浓度阿莫西林引起嗜酸乳杆菌代谢紊乱发生发展的相关重要代谢通路。

将重要的代谢通路里的潜在生物标志物通过代谢通路连接起来，得到综合代谢网络。

上述方案中，首先通过超高效液相色谱-串联质谱技术对不同浓度阿莫西林损伤的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行分析，得到包含保留时间和质荷比的信息；建立正交偏最小二乘法判别分析模型根据变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1、p值小于0.05的条件筛选数据，得到潜在的生物标志物；对它们的保留时间、准确分子质量和质谱碎片信息分析化学结构式，并通过在线数据库进行验证，得到具有统计学差异的代谢物；根据这些有差异的代谢物进行代谢通路富集，得到不同浓度阿莫西林造成嗜酸乳杆菌代谢紊乱发生发展的相关重要代谢通路；将重要的代谢通路连接起来，得到综合代谢网络以提示临床用药剂量应引起重视，并为胃肠道保护药物的研发和使用奠定了基础。

优选的是，所述不同浓度给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物通过以下方式获得：

取培养至对数生长期的嗜酸乳杆菌，分成3组，分别给1.0×10^-4，1.0×10^-5，1.0×10^-6M浓度的阿莫西林，给药后24小时收集得到。

上述方案中，以嗜酸乳杆菌为研究对象，在对数生长期给药，以避免在分析的过程中嗜酸乳杆菌因自身因素影响给药的损伤效果。

优选的是，所述液质联用分析的条件为：

采用100×2.1mm，1.8μm粒径，HSS T3 C18色谱柱为色谱柱；色谱柱的柱温为40℃；

流动相A为乙酸铵，B为乙腈，流动相流速0.3mL·min^-1；

洗脱程序为：先用90～70％的A液洗脱0～1.5分钟；然后用70-2％的A液继续洗脱1.5～8分钟；再用2～90％的A液洗脱8～9分钟；最后用90％的A液洗脱9～10分钟；其中，进样温度为4℃，进样量为5μL；

采集质谱质量数范围为50～1200Da，且所有数据在电喷雾离子源正、负离子模式下进行采集，其中，毛细管电压为3.0kV，椎孔电压为40kV，提取电压为4.0kV；离子源温度为100℃，脱溶剂气温度为350℃；锥孔气流量为40L·h^-1，脱溶剂流量800L·h^-1。

优选的是，获得所述差异代谢物的具体步骤为：

根据不同浓度阿莫西林给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行分组，并设置空白对照组，分别对各组进行主成分分析、偏最小二乘法判别分析和正交偏最小二乘法判别分析；

对各组间的差异代谢物进行筛选，选取差异代谢物的变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1且p值小于0.05的变量作为差异代谢物；

其中，偏最小二乘法判别分析模型拟合能力指数分别为：

正离子模式下：R²X＝0.554，R²Y＝0.921，Q²＝0.659；

负离子模式下：R²X＝0.613，R²Y＝0.854，Q²＝0.536。

优选的是，对差异代谢物进行代谢通路富集的具体步骤为：将差异代谢物上传到代谢组分在线分析网页，并录入各个差异代谢物的名称，进行相关通路的富集。

优选的是，还包括对嗜酸乳杆菌胞内代谢物的预处理：

把所述不同浓度阿莫西林给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物分别在2000转的条件下低速低温离心10分钟，得到的沉淀。

用磷酸盐缓冲溶液对沉淀洗涤3次，加入3倍体积的冰甲醇提取蛋白20分钟，再经过超声破碎15分钟，然后在12000转条件下高速低温离心20分钟，取上清液。

将上清液用氮气吹干，进样前用400μL乙腈与水等体积混合液进行复溶，并通过0.22μm尼龙滤膜过滤。

上述方案中，通过对嗜酸乳杆菌胞内代谢物的预处理将培养液等去除以确保用于液质联用分析的嗜酸乳杆菌胞内代谢物的稳定性。

优选的是，在主成分分析之前，对代谢物的碎片信息进行处理，数据经过80％过滤原则处理，将含空白值大于80％的变量去除，并进行归一化、峰对齐等预处理；其中，所述预处理是在MetaboAnalyst网站进行；

所述预处理的参数为：保留时间为0～10min；质量数为50～1200Da；质量数容许度为0.01；质量数窗口为0.02；噪音去除程度为6。

上述方案中，通过将含空白值大于80％的变量去除，以减少色谱图中不存在的峰所造成的缺失值而影响对结果的判断。

本发明至少包括以下有益效果：

首先，通过超高效液相色谱-串联质谱技术对不同浓度阿莫西林损伤的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行分析，得到包含保留时间和质荷比的碎片信息，建立模型根据变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1、p值小于0.05的条件筛选数据，得到潜在的生物标志物；对它们的保留时间、准确分子质量和质谱碎片信息分析化学结构式，并通过在线数据库进行验证，得到具有统计学差异的代谢物；根据这些有差异的代谢物进行代谢通路富集，得到不同浓度阿莫西林造成嗜酸乳杆菌代谢紊乱发生发展的相关重要代谢通路；将重要的代谢通路连接起来，得到综合代谢网络以提示临床用药剂量应引起重视，并为胃肠道保护药物的研发和使用奠定了基础。

其次，以嗜酸乳杆菌为研究对象，在对数生长期给药，以避免在分析的过程中嗜酸乳杆菌因自身因素影响给药的损伤效果。

再有，通过对嗜酸乳杆菌胞内代谢物的预处理将培养液等去除，以确保用于液质联用分析的嗜酸乳杆菌胞内代谢物的稳定性。

最后，通过将含空白值大于80％的变量去除，以减少色谱图中不存在的峰所造成的缺失值而影响对结果的判断。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1是本发明实施例中不同浓度给药后嗜酸乳杆菌的MTT实验图；

图2为本发明实施例中不同浓度给药后嗜酸乳杆菌的电竞扫描图；

图3为本发明实施例中基于超高效液相色谱-串联质谱在正离子模式下和负离子模式下采集的各组总离子流图；

图4为本发明实施例中不同浓度阿莫西林给药后嗜酸乳杆菌代谢物的三维PCA图；

图5为本发明实施例中不同浓度阿莫西林给药后嗜酸乳杆菌代谢物的PLS-DA图；

图6为本发明实施例中不同浓度阿莫西林给药后嗜酸乳杆菌代谢物的200次置换检验图；

图7为本发明实施例中不同浓度阿莫西林给药后嗜酸乳杆菌代谢物分别与对照组的OPLS-DA图；

图8为本发明实施例在metaboanalyst平台在线构建的代谢通路富集图；

图9为本发明实施例建立得到的综合代谢网络图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例

一种基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法，其中，包括：

步骤一、取培养至对数生长期的嗜酸乳杆菌，分为四组，每组有8个生物学重复，分别为高浓度给药组、中浓度给药组、低浓度给药组和空白对照组，分别给1.0×10^-4，1.0×10^-5，1.0×10^-6M浓度的阿莫西林，给药后24小时收集。

步骤二、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪对收集得到的4组酸乳杆菌胞内代谢物进行液质联用分析，得到不同代谢物的包含保留时间和质荷比的碎片数据信息。其中，液质联用分析的条件为：采用100×2.1mm，1.8μm粒径，HSS T3 C18色谱柱为色谱柱；色谱柱的柱温为40℃；流动相A为乙酸铵，B为乙腈，流动相流速0.3mL·min^-1；洗脱程序为：先用90～70％的A液洗脱0～1.5分钟；然后用70-2％的A液继续洗脱1.5～8分钟；再用2～90％的A液洗脱8～9分钟；最后用90％的A液洗脱9～10分钟；其中，进样温度为4℃，进样量为5μL；采集质谱质量数范围为50～1200Da，且所有数据在电喷雾离子源正、负离子模式下进行采集，其中，毛细管电压为3.0kV，椎孔电压为40kV，提取电压为4.0kV；离子源温度为100℃，脱溶剂气温度为350℃；锥孔气流量为40L·h^-1，脱溶剂流量800L·h^-1。

步骤三、将步骤二得到的碎片数据信息，采用Waters公司的Masslynx软件进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化等处理，得到各个峰的峰高、峰面积及保留时间的数据。然后在保留时间范围0～20min；质量数范围100～1000Da；质量数容许度0.01；质量数窗口0.05；噪音去除程度6的参数下经过80％过滤原则处理以后，将含空白值>80％的变量去除。

步骤四、将步骤三处理后的数据根据不同浓度给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行分组，并设置空白对照组，采用SIMCA-P14.1软件对各组数据进行主成分分析，得到不同组的代谢模式是否存在差异以验证数据的获得是否可靠。

步骤五、将步骤三处理后的数据根据不同浓度给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行分组，并设置空白对照组，对各组数据进行偏最小二乘法判别分析，以分析不同浓度阿莫西林干预后嗜酸乳杆菌的代谢模式发生的变化。其中，偏最小二乘法判别分析模型拟合能力指数分别为：正离子模式下：R²X＝0.554，R²Y＝0.921，Q²＝0.659；负离子模式下：R²X＝0.613，R²Y＝0.854，Q²＝0.536。

步骤六、将步骤三处理后的数据根据不同浓度给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行分组，并设置空白对照组，对各组数据采用SPSS 20.0软件进行正交偏最小二乘法判别分析，对各组间的潜在生物标志物进行筛选，选取差异代谢物的变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1且p值小于0.05的变量作为差异代谢物。

步骤七、将差异代谢物上传到MetaboAnalyst分析网页，进行通路富集，得到每组的相关的重要代谢通路，最后把重要的相关代谢物通过代谢通路连接起来，得到综合代谢网络图。

数据分析：

从高浓度给药组、中浓度给药组、低浓度给药组中各取10μL混合，作为质量控制样本组。

1、取培养至对数生长期的嗜酸乳杆菌，分成对照组、高浓度给药组、中浓度给药组、低浓度给药组；其中高浓度给药组、中浓度给药组、低浓度给药组分别给1.0×10^-4，1.0×10^-5，1.0×10^-6M浓度的阿莫西林，给药后24小时收集。把每个组的样本小心地除去上清液，加入20μL的MTT，1小时后，用100μL的DMSO溶解MTT-甲酰胺晶体，然后在570nm下测量溶液的吸光度，结果如图1。

从图1的数据可知，阿莫西林的浓度越低嗜酸乳杆菌的活细胞数量越多，可见，阿莫西林的浓度越高对嗜酸乳杆菌的活性抑制越大。

2、除去对照组、高浓度给药组、中浓度给药组、低浓度给药组中的培养液，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤菌液3次，然后将细菌转移至1.5ml离心管中，并在4℃条件下将细菌固定在浓度为3％的冰戊二醛的磷酸盐缓冲盐水中过夜，然后固定在浓度为1％四氧化锇中。再通过用浓度为30％～90％的乙醇进行梯度脱水后，将细胞嵌入812环氧树脂中。待干燥后，将金粉以真空状态喷雾，最后在扫描电子显微镜下观察，结果如图2。其中，A为对照组的扫描电镜图，B为低浓度给药组的扫描电镜图，C为中浓度给药组的扫描电镜图，D为高浓度给药组的扫描电镜图。

从图2可知，A中的嗜酸乳杆菌状态正常，B中小部分的嗜酸乳杆菌细胞壁受损，C中的部分的嗜酸乳杆菌细胞壁受损，D中的大部分的嗜酸乳杆菌细胞壁受损；即给药浓度越大，细菌受损越严重。

3、采用实施例的方法用超高效液相色谱-串联质谱对不同给药剂量收集得到的酸乳杆菌胞内代谢物进行液质联用分析，结果如图3。其中，A为正离子模式下采集的总离子流图；B为负离子模式下采集的总离子流图。

从图3可知，不同剂量阿莫西林给药后，细菌的代谢物会有所不同。

4、采用实施例的方法对不同给药剂量收集得到的酸乳杆菌胞内代谢物进行主成分分析，结果如图4。其中，C为对照组，L为低剂量组，M为中剂量组，H为高剂量组，QC为质量控制样本组。

主成分分析作为一种无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。模型组与空白组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异，且QC样本聚集较紧密，说明在数据采集过程中的仪器状态是良好的，保证了数据的可靠性。主成分分析PCA得分图中的每一个点代表每个实验样本的菌液代谢轮廓。

从图4可知，对照组、高浓度给药组、中浓度给药组、低浓度给药组均分离良好，没有交叉和重叠，说明代谢模式存在明显的差异。QC样本聚集较紧密，说明在数据采集过程中的仪器状态是良好的，保证了数据的可靠性。

5、采用实施例的方法对不同给药剂量收集得到的酸乳杆菌胞内代谢物进行偏最小二乘法判别分析，结果如图5。其中，C为对照组，L为低剂量组，M为中剂量组，H为高剂量组，QC为质量控制样本组。PLS-DA分类模型所能够解释X和Y矩阵信息的百分比，Q²则为通过交叉验证计算得出，用以评价PLS-DA模型的预测能力，Q²越大代表模型预测效果较好。

从图5可知，对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组均分离良好，提示不同浓度的阿莫西林干预后嗜酸乳杆菌的代谢模式发生变化，表明不同浓度的阿莫西林对嗜酸乳杆菌的作用不同。

6、对偏最小二乘法判别分析模型进行置换检验，结果如图6。其中，A为正离子模式下的200次置换检验图；B为负离子模式下的200次置换检验图。

从图6可知，这个损伤模型没有过拟合，结果是可信。

7、采用实施例的方法对不同给药剂量收集得到的酸乳杆菌胞内代谢物建立正交偏最小二乘法分析，结果如图7。其中，A图为正离子模式下的对照组和低剂量组；B图为正离子模式下的对照组和中剂量组；C图为正离子模式下的对照组和高剂量；D图为负离子模式下的对照组和低剂量组；E图为负离子模式下的对照组和中剂量组；F图负离子模式下的对照组和高剂量组。C为对照组，L为低剂量组，M为中剂量组，H为高剂量组。

从图7可知，在阿莫西林给药之后，嗜酸乳杆菌代谢物有显著变化。

8、采用实施例的方法对不同给药剂量收集得到的酸乳杆菌胞内代谢物中的差异代谢物进行代谢通路富集，筛选出相关差异代谢物如表1～2，以及相关的代谢通路如图8。其中，CG,为对照组；LCG,为低剂量组；MCG,为中剂量组；HCG,为高剂量组；图A为对照组和低剂量组；图B为对照组和中剂量组；图C为对照组和高剂量组。

表1：正离子模式下不同浓度阿莫西林组和对照组差异代谢产物和含量变化：和对照组相比：*p<0.05，**p<0.01。

表2：负离子模式下不同浓度阿莫西林组和对照组差异代谢产物和含量变化：和对照组相比：*p<0.05，**p<0.01。

从表1～2的数据可知，与对照组相比，在低剂量组中有6个代谢物含量下降：甘油、肌肽、乳清酸、烟酸、假尿嘧啶核苷、色氨酸；同时，尿刊酸的含量增加。在中剂量组中有6个代谢物含量下降：甘油、胞嘧啶、烟酸、L-2,4-二氨基丁酸、肌肽、烟尿酸。在高剂量组中有5个代谢物含量下降：胞嘧啶、烟酸、L-2,4-二氨基丁酸、鸟氨酸、烟尿酸。与此相反，在高剂量组中，肌肽、亚胺甲基谷氨酸、胸腺嘧啶的含量增加。

结合图8可知，氨酸和脯氨酸代谢的影响值为0.130、烟酸和烟酰胺代谢的影响值为0.106、甘油酯代谢的影响值为0.188、色氨酸代谢的影响值为0.109，是阿莫西林造成嗜酸乳杆菌代谢紊乱发生发展的最相关的4条重要代谢通路。

9、将采用实施例的方法得到的重要的代谢通路连接起来，得到综合代谢网络，结果如图9。其中，图中箭头向上表示代谢物在给药组相对于对照组是上调趋势，向下则反之；L箭头表示低剂量组中生物标志物的代谢变化；M箭头表示中剂量组中生物标志物的代谢变化；H箭头表示高剂量组中生物标志物的代谢变化。

从图9可知，得到的生物标志物左旋色氨酸在色氨酸代谢中通过间接影响乙酰辅酶A从而影响柠檬酸盐，最终通过影响三羧酸循环而影响嗜酸乳杆菌的代谢；生物标志物l-2,4-二氨基丁酸在甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢中通过间接影响乙醛酸酯从而间接影响鸟氨酸；生物标志物肌肽在β-丙氨酸代谢中通过影响β-丙氨酸而影响精胺；生物标志物胸腺嘧啶、胞嘧啶、乳清酸、假尿苷在嘧啶代谢中间接通过影响尿嘧啶从而影响β-丙氨酸最终影响精氨酸和脯氨酸代谢中的精胺而影响鸟氨酸；鸟氨酸和生物标志物甘油通过间接影响甘油脂代谢中的丙酮酸而影响草酰乙酸最终通过影响三羧酸循环而影响嗜酸乳杆菌的代谢；烟酸和烟酰胺代谢中的生物标志物烟尿酸和烟酸通过影响琥珀酸酯从而影响三羧酸循环，最终影响嗜酸乳杆菌的代谢；组氨酸代谢中的生物标志物尿酸和甲氨基谷氨酸通过影响谷氨酸从而影响2-氧戊二酸酯来影响三羧酸循环，最终影响嗜酸乳杆菌的代谢。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。