阅读说明：本技术 分子标志物及其应用 (Molecular marker and application thereof ) 是由 刘兴国 杨亮 唐海特 于 2019-02-01 设计创作，主要内容包括：本发明提出了分子标志物及其应用,具体提出了含有Exon4b的Opa1异形体蛋白作为肝癌标志物的用途。发明人通过q-PCR检测肝癌和癌旁组织中的线粒体相关基因表达,惊喜地发现,相对于癌旁组织,肝癌组织中带有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达显著下调,而不含Exon4b外显子的Opa1异形体蛋白的表达无统计学差异。由此,含有Exon4b的Opa1异形体蛋白可作为肝癌的特异性分子标志物。(The invention provides a molecular marker and application thereof, and particularly provides application of Opa1 allotrope protein containing Exon4b as a liver cancer marker. The inventors examined mitochondrial-associated gene expression in liver cancer and in paracarcinoma tissues by q-PCR and surprisingly found that expression of Opa1isoform protein with Exon4b was significantly down-regulated in liver cancer tissues relative to paracarcinoma tissues, while expression of Opa1isoform protein without Exon4b was not statistically different. Therefore, Opa1isoform protein containing Exon4b can be used as a specific molecular marker of liver cancer.)

分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及分子标志物及其应用，更具体地，本 发明涉及含有Exon4b的Opa1异形体蛋白作为肝癌标志物的用途、试剂盒、试剂在制备试剂盒中的用途、肝癌细胞模型、肝癌动物模型以及诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果的系统。

背景技术

肝癌是世界上最常见的五种恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于胃癌及食管癌。肝癌患者 未经治疗，5年生存率不到10％，然而“小肝癌”根治性切除后5年生存率可达70％。并且， 肝癌早期无明显症状，往往被人忽视，到出现临床症状时，已到中晚期，此时往往已经丧 失了手术机会，这使得肝癌的早期发现和治疗变得格外重要。在早期筛查中，肿瘤标记物 起到了非常重要的作用，但这些肿瘤标记物都存在着或多或少的弊端，筛选并鉴定出新的 特异的肝癌的分子标志物，具有非常重要的临床价值。

因而，现阶段找到一种新的特异的肝癌的分子标志物，对于肝癌的前期筛查和诊断， 意义重大。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

人的OPA1基因位于3号染色体上(Christiane Alexander et al.,2000)，由28个外显子组 成，其产物OPA1(参考前述文献《Christiane Alexander et al.,2000》中的图1-2)是一种核 编码的线粒体动力学相关蛋白，是线粒体网络结构的组分之一，具有类似动力学相关的GTP 酶活性。在人体细胞中，OPA1基因转录后经过复杂的选择性剪接形成8种转录本(Delettre et al.,2001)，进而翻译成8种OPA1异形体蛋白(OPA 1iso-1、2、3、4、5、6、7、8)。这8 种蛋白的区别主要在于其mRNA区段外显子4、4b、5b的选择性剪接(参考下述文献《Ste′phane Duvezin-Caubet et al.,2007》中的图1-32)(Ste′phane Duvezin-Caubet etal.,2007)。

发明人通过q-PCR检测肝癌和癌旁组织中的线粒体相关基因表达，惊喜地发现，相对 于癌旁组织，肝癌组织中带有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达显著下调，而不含Exon4b外显子的Opa1异形体蛋白的表达无统计学差异。因此，带有Exon4b的Opa1异形体蛋白 可作为肝癌的特异性分子标志物。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了含有Exon4b的Opa1异形体蛋白作为肝癌 标志物的用途。需要说明的是，如前所述，OPA1基因转录后经过复杂的选择性剪接形成8种转录本(Delettre et al.,2001)，进而翻译成8种OPA1异形体蛋白(OPA 1iso-1、2、3、4、5、6、7、8)。这8种蛋白的区别主要在于其mRNA区段外显子4、4b、5b的选择性剪接。 本发明中的“含有Exon4b的Opa1异形体蛋白”指的是包含外显子4b的mRNA翻译形成的 异形体蛋白。在一些实施例中，含有Exon4b的Opa1异形体蛋白包括选自Opal iso 3、Opal iso 5、Opaliso 6、Opal iso 8蛋白的至少之一。发明人在实验中惊喜地发现，相对于癌旁组 织，肝癌组织中带有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达显著下调，而不含Exon4b外显子 的Opa1异形体蛋白的表达无统计学差异。因此，带有Exon4b的Opa1异形体蛋白可作为 肝癌的特异性分子标志物。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒 包括：试剂，所述试剂用于检测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白，所述试剂盒用于诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果。如前所述，相对于癌旁组织，肝癌组织中带有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达显著下调，而不含Exon4b外显子的Opa1异形体蛋白的表达无统计学差异。由此，带有Exon4b的Opa1异形体蛋白可作为肝癌的特异性分子标志物。根据本发明 实施例的试剂盒包括检测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的试剂，能够检测含有Exon4b 的Opa1异形体蛋白的表达量，进而，利用根据本发明实施例的试剂盒可以特异性诊断肝 癌或判断肝癌患者预后效果。

根据本发明的实施例，上述试剂盒还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述含有Exon4b的Opa1异形体蛋白包括选自Opal iso 3、Opal iso 5、Opal iso 6、Opal iso 8的至少之一。发明人发现，相对于癌旁组织，肝癌组织中Opal iso 3、Opal iso 5、Opal iso 6和Opal iso 8蛋白的表达显著下调，由此，Opaliso 3、Opal iso 5、Opal iso 6和Opal iso 8蛋白的至少之一可作为肝癌的特异性分子标志物。进而，利用根 据本发明实施例的试剂盒可以特异性诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果。

所述试剂的种类不受特别限制，只要能够实现特异性检测含有Exon4b的Opa1异形体 蛋白的表达量即可，本领域技术人员可以理解的是，“表达量”既可指绝对表达量也可指相 对表达量，可以以对照样本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达量作为基准，相对表示待测样本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达量，也可以以管家基因的表达量为基准，相对表示含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达量。

根据本发明的具体实施例，所述试剂包括选自特异性检测含有Exon4b的Opa1异形体 蛋白的抗体、引物和探针的至少之一。例如，当采用特异性检测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的抗体对含有Exon4b的Opa1异形体蛋白进行检测时，可以通过蛋白质印迹法、流 式细胞述等方法进行检测；当采用特异性检测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的引物对含 有Exon4b的Opa1异形体蛋白进行检测时，可以通过实时定量PCR的方法检测含有Exon4b 的Opa1异形体蛋白的mRNA的表达量；当采用特异性检测含有Exon4b的Opa1异形体 蛋白的探针对含有Exon4b的Opa1异形体蛋白进行检测时，可采用Northern blot的方法检 测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的mRNA的表达量。

根据本发明的实施例，所述引物具有SEQ ID NO：1～6中任两个所示的核苷酸序列。

GAGTATATCGATTTTGGTTCTC(SEQ ID NO：1)

CTTTTTTACCTCAGGTTCTCC(SEQ ID NO：2)

GAGTATATCGATTTTGGTCACA(SEQ ID NO：3)

GACTTTTTTACCTCAGGTCAC(SEQ ID NO：4)

CTCTTTGTCTGACACCTTTCT(SEQ ID NO：5)

TCACCAAGCAGACCCTTTCT(SEQ ID NO：6)。

在本发明的第三方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于特异 性检测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白，所述试剂盒用于诊断肝癌或判断肝癌患者预后效 果。如前所述，相对于癌旁组织，肝癌组织中带有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达显著 下调，而不含Exon4b外显子的Opa1异形体蛋白的表达无统计学差异。由此，带有Exon4b的Opa1异形体蛋白可作为肝癌的特异性分子标志物。所述试剂可以特异性检测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白，进而，利用所述试剂盒可以特异性诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果。

根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述试剂包括选自特异性检测含有Exon4b的Opa1异形体蛋白 的抗体、引物和探针的至少之一。

根据本发明的实施例，所述引物具有SEQ ID NO：1～6中任两个所示的核苷酸序列。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种肝癌细胞模型。根据本发明的实施例，与野 生型细胞相比，所述肝癌细胞模型中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平低。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种肝癌动物模型。根据本发明的实施例，与非 癌动物相比，所述肝癌动物模型中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平低，其中，所述非癌动物为不患任何癌症的动物。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果的系统。 根据本发明的实施例，参考图2，所述系统包括：获得装置100，所述获得装置100用于获得待检样本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平；判断装置200，所述判断装置 200与所述获得装置100相连，所述判断装置200用于基于所述待检样本中含有Exon4b的 Opa1异形体蛋白的表达水平，诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果。如前所述，相对于癌旁 组织，肝癌组织中带有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达显著下调。由此，带有Exon4b 的Opa1异形体蛋白可作为肝癌的特异性分子标志物。因此，利用所述获得装置获得待检样 本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平后，基于所述待检样本中含有Exon4b的 Opa1异形体蛋白的表达水平，通过所述判断装置即可诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果。

根据本发明的实施例，上述系统还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述待检样本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平低 于正常样本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平，是所述待检样本患有肝癌的指 示；或所述待检样本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平与正常样本中含有Exon4b的Opa1异形体蛋白的表达水平相当，是所述肝癌患者预后效果良好的指示。

附图说明

图1显示了根据本发明一个实施例的Opa1异形体表达水平图谱；以及

图2显示了根据本发明一个实施例的诊断肝癌或判断肝癌患者预后效果的系统的结构 示意图。

附图标记：

100：获得装置

200：判断装置

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图 描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，iso或isoform指异形体。

实施例1

一、实验方法：通过Q-PCR检测肝癌和癌旁样品cDNA中不同Opa1 isoforms的转录水平。

1、区分Opa1各isoforms的6条引物序列如下，

Opa1各isoforms所用到引物组合如下：

Opa1isoform 1：2-SEx4-5+5-ASEx5-6

Opa1isoform 2:1-SEx3–5+5-ASEx5-6

Opa1isoform 3:3-SEx3-4b+5-ASEx5-6

Opa1isoform 4:1-SEx3–5+6-ASEx5-5b

Opa1isoform 5:4-SEx4-4b+5-ASEx5-6

Opa1isoform 6:3-SEx3-4b+6-ASEx5-5b

Opa1isoform 7:2-SEx4-5+6-ASEx5-5b

Opa1isoform 8:4-SEx4-4b+6-ASEx5-5b

2、QPCR反应体系(20μL)见下表1。

表1：QPCR反应体系

试剂名称	试剂用量	厂家
			Sybr混合物(2x)	10μL	--
正向引物	0.4μL	Takara
			反向引物	0.4μL	Takara
DNA(稀释20倍后)	2μL	Takara
			ddH<sub>2</sub>O	7.2μL	TIANGEN

注：QPCR上样全过程最好做避光处理。

3、QPCR反应条件为：95℃，30秒，一个循环；95℃，5秒；60℃，20秒，43个循 环；70℃到94℃，每5秒中增加0.4℃。

二、END实验结果如图1所示，其中N表示non-tumor(非肿瘤)，代表癌旁样品，T 表示tumor(肿瘤)，代表肝癌样品。图1显示了本发明中22对肝癌和癌旁样品中检测Opa1 异形体的mRNA水平，结果表明肝癌中含Exon4b的外显子的Opa1isoforms表达下降，而 不含Exon4b的外显子的Opa1isoforms表达无统计学差异。

三、结论：肝癌中含Exon4b的外显子的Opa1isoforms表达下降。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术 语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连， 可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领 域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须 针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一 个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合 和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例 进行变化、修改、替换和变型。