阅读说明：本技术 一种作为诊断结直肠癌肝转移标志物的血浆外泌体circRNA (Plasma exosome circRNA as marker for diagnosing colorectal cancer liver metastasis ) 是由 张力图 刘海洲 宁淑芳 利基林 于 2020-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种作为诊断结直肠癌肝转移标志物的血浆外泌体circRNA。它包括人血浆外泌体中的hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773。本发明利用微阵列分析用于检测血浆外泌体中差异表达的circRNA,并证实这些候选circRNA确实存在差异并且可以用作潜在的结直肠癌肝转移诊断生物标记。结果发现结直肠癌患者血浆外泌体中的hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773表达改变可以作为诊断结直肠癌肝转移的标志物的组合,这将有助于探索这种疾病的发病机理,并为CRC的诊断提供新的方向。(The invention discloses a plasma exosome circRNA as a marker for diagnosing colorectal cancer liver metastasis. It includes hsa _ circ _0001296 and hsa _ circ _0006773 in human plasma exosomes. The invention utilizes microarray analysis for detecting circrnas differentially expressed in plasma exosomes and confirms that these candidate circrnas are indeed differential and can be used as potential colorectal cancer liver metastasis diagnostic biomarkers. As a result, the expression change of hsa _ circ _0001296 and hsa _ circ _0006773 in plasma exosome of colorectal cancer patients can be used as a combination of markers for diagnosing liver metastasis of colorectal cancer, which helps to explore the pathogenesis of the disease and provides a new direction for the diagnosis of CRC.)

一种作为诊断结直肠癌肝转移标志物的血浆外泌体circRNA

技术领域

本发明属于结直肠癌诊断技术领域，具体涉及一种作为诊断结直肠癌肝转移标志物的血浆外泌体circRNA。

背景技术

环状RNA(circRNA)是一种新型的非编码RNA，可形成共价闭合的连续环。CircRNA没有3'和5'末端，但是具有大量的miRNA结合位点。大多数circRNA是外显子circRNA，它们是通过反向剪接从已知蛋白质编码基因的外显子区域衍生而来的。CircRNA在外泌体和血浆中含量丰富且稳定，为检测提供了更方便的方法。外泌体是直径为40-100nm的纳米级双层膜囊泡，通常以杯形出现。多种人类细胞可以通过细胞外分泌释放外泌体，这些囊泡广泛分布于血液，唾液，尿液和其他体液中。外泌体可以携带脂质体，蛋白质，mRNA和非编码RNA到达靶组织，并且可以参与细胞通讯，免疫反应以及肿瘤的生长和迁移。

与血液中游离的RNA相比，测量外泌体衍生的RNA作为生物标记具有许多优势。一方面，外泌体膜可以有效地保护内含物免受RNase降解，从而保持循环血液中外泌体RNA的完整性和功能性。另一方面，癌细胞将外泌体分泌到外周循环液中，而外泌体RNA可以更准确地反映出肿瘤演化过程中癌细胞的变化。circRNA稳定且在血液，唾液和外泌体中含量丰富，是癌症早期诊断和预后的有希望的指标。人血清外泌体包含大量完整和稳定的circRNA，其作为未来肿瘤检测的生物标志物具有巨大潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种作为诊断结直肠癌肝转移标志物的血浆外泌体circRNA。

一种诊断结直肠癌肝转移的标志物，包括人血浆外泌体中的hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773。

所述hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773在结直肠癌肝转移患者的血浆外泌体中表达量升高。

一种诊断结直肠癌肝转移的试剂盒，包括hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773。

本发明的有益效果：本发明利用微阵列分析用于检测血浆外泌体中差异表达的circRNA(DE-circRNA)，并证实这些候选circRNA确实确实存在差异并且可以用作潜在的结直肠癌肝转移诊断生物标记。结果发现结直肠癌肝转移患者血浆外泌体中的hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773表达改变可以作为诊断结直肠癌肝转移的标志物的组合，这将有助于探索这种疾病的发病机理，并为CRC的诊断提供新的方向。

附图说明

图1为外泌体的TEM图像(比例尺，100nm)。

图2为通过NTA分析确认的外来体的大小范围。

图3为三种代表性外泌体特异性标志物的蛋白质印迹：TSG101，CD63和CD9。

图4为差异表达的circRNA的热图分析。

图5为差异表达的circRNA的火山图分析。

图6为qRT-PCR检测血浆外泌体中hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773表达；所有数据均以平均值±SD表示，与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7为hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773结直肠癌肝转移检测的ROC曲线；所有数据均以平均值±SD表示，与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下述实施例中人CRC细胞系(SW480，SW620，LoVo，HT-29)和正常NCM460结肠上皮细胞购自中国科学院上海生物科学研究所。所有细胞系均在合适的培养环境(5％CO₂，37℃)下保存在补充有10％FBS(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco，美国)中。

实施例1 外泌体的获取

使用超速离心从血浆中提取外泌体。解冻后，首先将血浆样品以500g离心5分钟，然后将上清液转移至新的聚碳酸酯试管中，并以2000g离心10分钟。然后将它们以10,000g离心30分钟，以消除脱落的微囊泡(sMV)。收集上清液，并通过0.22μm的膜滤器(MerckMillipore)渗滤，并进一步以100,000g离心2小时。将外泌体沉淀用PBS洗涤一次，并重复先前的步骤。最后，将外泌体悬浮在PBS中，并保存在-80℃下以备后用。

将通过上述方法获得的十微升悬浮的外泌体置于铜网上，静置10分钟，并用2％乙酸铀酰水溶液染色3分钟。使用滤纸擦去多余的染料，并将样品在室内温度下风干。然后通过日立H-7650透射电子显微镜(TEM)观察外泌体(图1)。同时，使用来自ParticleMetrix(德国)的ZetaView粒子追踪器通过纳米粒子追踪分析(NTA)计算了外泌体的浓度和大小分布(图2)。随后，通过蛋白质印迹检测外泌体生物标志物，例如四跨膜蛋白分子CD63(Abcam)，CD9(Abcam)和TSG101(Abcam)(图3)。

实施例2 微阵列分析

选择四对原发性结直肠癌和结直肠癌肝转移患者血浆进行微阵列分析。根据Arraystar的标准方案完成样品制备和微阵列杂交。用Rnase R(Epicentre，Inc.)消化总RNA，以消除外泌体中线性RNA并富集circRNA，然后使用随机引物技术(Arraystar SuperRNA Labeling Kit；Arraystar)将其收集，延伸并转录为荧光cRNA。标记的cRNA与Arraystar Human circRNA Array V2(8×15K，Arraystar)进一步杂交。冲洗载玻片后，利用安捷伦扫描仪G2505C扫描阵列。使用安捷伦特征提取软件(版本11.0.1.1)分析采集的图像阵列。

发现216种circRNA表达存在显着差异(|logFC|值>2.0，P值<0.05)。与原发性结直肠癌样品相比，结直肠癌肝转移患者样品中的123circRNAs(包括2个基因间，3个反义，88exonic，22intronic和8sense重叠)被上调，而72circRNAs(包含2个反义，68个外显子，1个内含子和1个有义重叠)被下调。hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773在血浆外泌体和组织中都存在差异(图4-5)。

实施例3 qRT-PCR分析

从20对原发性结直肠癌和结直肠癌肝转移患者中收集了血液，并从手术切除患者中收集了20对原发性结直肠癌、结直肠癌肝转移患者和匹配的相邻非癌组织样本，并在-80℃下及时保存。使用exoRNeasy血清/血浆Maxi试剂盒(Qiagen)从1mL血浆样品中提取外泌体RNA。根据制造商的说明，使用miRNeasy mini Kit(Qiagen)解析组织和细胞样品的总RNA。使用带有gDNA橡皮擦(完美实时)(Takara)的PrimeScript^TMRT试剂盒将总RNA反转录为cDNA。使用荧光定量PCR仪器qTOWER3G(德国Analytikjena)和Premix ExTaq^TMII(Tli RNaseH Plus)(Takara)对RT的产物进行分析，每个样品进行三次重复分析。

结果表明，与原发性结直肠癌相比，结直肠癌肝转移患者血浆外泌体中的hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773的表达上调(p<0.05)，与微阵列结果一致(图6-7)。

本发明的circRNA组合与对照组相比，结直肠癌患者血浆外泌体，组织和结直肠癌细胞系中的两个circRNA(hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773)显着上调(p<0.05)。原发性结直肠癌和结直肠癌肝转移患者血浆外泌体水平hsa_circ_0001296和hsa_circ_0006773有所不同，AUC值分别为0.839和0.747。结合这两种circRNA的计算模型具有0.918的AUC值，灵敏度为80.00％，特异性为90％。血浆外泌体hsa_circ_0006896，hsa_circ_0016404，hsa_circ_0003839是新型结直肠癌诊断生物标志物。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。