阅读说明：本技术 嘌呤的发酵生产工艺 (Fermentation production process of purine ) 是由 权春善 刘宝全 金梅姝 郭斌梅 陈苛蒙 金黎明 俞勇 郑立 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种嘌呤的发酵生产工艺,包括以下步骤：(1)将海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118进行活化,得到单一菌落；(2)种子液扩大培养,得到种子液；(3)将种子液接种到发酵培养基中发酵,得到发酵液；(4)对发酵液离心、萃取,进行初级分离,获得嘌呤纯品；(5)单因素试验初步优化嘌呤的发酵生产工艺；(6)正交实验确定最优的发酵生产工艺条件。本发明涉及到的发酵工艺大幅提高了嘌呤的产量,经优化后嘌呤的产量由基础发酵培养基中的4.76mg/L提高到17.88mg/L,具有发酵产率高、周期短、条件易控制等优点,解决了化学合成法合成嘌呤耗费大量有机溶剂,原料来源困难及环境污染等问题。(The invention relates to a purine fermentation production process which comprises the following steps of (1) activating marine Bacillus sp.JIN118 to obtain a single colony, (2) carrying out amplification culture on seed liquid to obtain seed liquid, (3) inoculating the seed liquid into a fermentation culture medium to ferment to obtain fermentation liquid, (4) centrifuging and extracting the fermentation liquid to carry out primary separation to obtain a pure purine product, (5) primarily optimizing the purine fermentation production process through a single-factor test, and (6) determining the optimal fermentation production process conditions through an orthogonal test.)

嘌呤的发酵生产工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种嘌呤的发酵生产工艺。

背景技术

嘌呤是一种有机合成中间体，是非常重要的化工原料，广泛用于染料、农药、医药及香料等产品的生产，社会需求量很大。另外，许多嘌呤类似物在临床上用作抗肿瘤药物，如天然的咖啡碱对人体有兴奋、利尿的作用。因此，嘌呤化合物在生命健康中具有非常重要的作用。

目前生产嘌呤的方法主要有化学合成法。由于化学合成法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题。发酵法生产嘌呤还未见报道，但一般来说，发酵法生产化工原料具有周期短、控制容易等优点，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高嘌呤产量、提高生产效率的发酵嘌呤的优化工艺。

本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的一种嘌呤的发酵生产工艺，具体包括以下步骤：

(1)将海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118进行活化，得到单一菌落；

(2)挑取活化好的单一菌落，进行种子液扩大培养，得到种子液；

(3)将种子液接种到发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；

(4)对发酵液进行离心处理，弃菌体，得到上清；上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液通过中压制备色谱法进行初级分离，得到粗品；将粗品利用制备型高效液相色谱分离获得嘌呤纯品。

上述嘌呤化合物其具体结构如式Ⅰ所示：

本发明有益效果如下：

本发明嘌呤的发酵生产工艺优化后，具有发酵周期短、发酵成本低廉、发酵条件简单容易控制等特点。

本发明的有益效果在于解决了化学合成法获得嘌呤的过程中耗费大量有机溶剂，原料来源困难及环境污染等问题。发酵法生产嘌呤由于其产率高、周期短、控制容易等优点。

本发明提供了一种嘌呤的发酵生产工艺，本发明旨在通过优化嘌呤的发酵生产工艺进一步提高嘌呤产量，目的在于解决化学合成法合成嘌呤化合物过程副产物多、难分纯、反应条件不可控等技术问题。

本发明提供了一种嘌呤的发酵生产工艺，通过单因素实验初步确定嘌呤的最佳发酵生产工艺条件，再结合正交试验进一步确定最优的发酵生产工艺条件为：(NH₄)₂SO₄作为氮源且添加量为11g/L，温度为37℃，转速为150r/min，培养时间为72h，pH为7.0。经优化后嘌呤的产量由基础发酵培养基中的4.76mg/L提高到17.88mg/L，本发明具有发酵产率高、周期短、条件容易控制等优点，解决了化学合成法合成嘌呤耗费大量有机溶剂，原料来源困难及环境污染等问题，将成为工业化生产嘌呤的重要方法。且本发明中海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118稳定生产嘌呤，便于后期嘌呤的工业生产开发。

附图说明

图1含嘌呤组分的高效液相色谱检测结果；

图2为本发明嘌呤纯度检测结果；

图3为本发明嘌呤标准品的标准曲线；

图4为本发明氮源的筛选结果；

图5为本发明(NH₄)₂SO₄浓度的优化结果；

图6为本发明发酵温度优化结果；

图7为本发明发酵时间优化结果；

图8为本发明摇床培养转速优化结果；

图9为本发明初始pH优化结果；

图10为本发明菌株JIN118的系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。

本发明的海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118已提交保藏，具体保藏信息如下：

保藏编号：CCTCC NO：M 2019988；保藏日期：2019年12月2日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学。

16S rDNA序列分析

使用无菌接种环挑取单菌落于装有10μL无菌超纯水的PCR管中，混匀，100℃煮沸5min，4℃冷却5min，吸取4μL上清液作为PCR扩增的DNA模板，按照表1中50μL体系加入所需试剂，表2条件进行PCR扩增。PCR扩增产物进行核酸电泳和测序，将菌株JIN118的16S rDNA的序列(1460bp)在NCBI核酸数据库中通过BLAST进行分析并绘制系统发育树，结果如图10所示。经分析可以确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，命名为Bacillussp.JIN118。

表1 PCR反应体系(50μL)

表2 PCR反应条件

实施例1菌种活化及发酵

(1)菌种活化

将保存在-80℃冰箱中的海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118涂布于基础发酵固体培养基上，30℃培养16-24h。基础发酵培养基(g/L)包含：蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g，琼脂20g，陈海水1L。

(2)种子培养

使用灭好菌的牙签挑取单菌落，接种到装有2mL基础发酵培养基的试管中，30℃、180r/min摇床振荡培养16-24h。然后以1％的接种量接种至装液量为40％的基础发酵培养基中(基础发酵培养基配方如步骤(1)中配方一致)，30℃、180r/min摇床振荡培养24h得到种子液。

(3)发酵培养

将种子液按5％的接种量接种，30℃、180r/min振荡培养72h。

(4)发酵液前处理

发酵液于8000r/min离心10min，即得到发酵上清液。上清液加入等体积乙酸乙酯充分萃取三次，合并有机相，旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯膏状粗提物。

进一步的，所述步骤(4)具体为：膏状粗提物通过中压制备色谱法进行粗分离，色谱柱填料为硅胶粉，流动相为石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇，经高效液相色谱法检测合并含嘌呤组分。

进一步的，所述步骤(4)具体为：利用高效液相色谱仪对中压制备后获得的含嘌呤组分进行嘌呤含量的检测，检测结果如图1所示。其纯度达到了94％，纯度检测结果如图2所示。

(5)嘌呤标准曲线

标准曲线的制作，准确称取嘌呤标准品3mg，用甲醇溶解并定容至120μg/mL，用甲醇逐级稀释至不同的浓度60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL，利用高效液相色谱仪分别对5个梯度浓度标准溶液的峰面积进行测定，各进样20μL，平行测定3次，取平均峰面积，嘌呤标准品的溶液浓度及峰面积如表3所示。以标准品溶液浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标作图，测得嘌呤标准品的线性方程为y＝145746.80+88082.67x，相关系数R²＝0.99954，结果如图3所示。

含量检测：本实验采用外标法分别对标准品和待测物质进行高效液相色谱检测，可根据其相同保留时间对应的峰值的峰面积比例来测定待测物的含量。测定条件为色谱柱Innoval ODS-2C18(4.6x250mm，5μm)，检测波长222nm，流动相为10％-90％甲醇水，流速为0.8mL/min，进样量20μL。

表3嘌呤标准品的溶液浓度及峰面积

实施例2单因素实验

通过单因素实验初步确定氮源及最佳的发酵条件，采用外标法分别对标准品和待测物质进行高效液相色谱检测，据据其相同保留时间对应峰值的峰面积比例来测定待测物的含量，并根据嘌呤标准品的线性方程为y＝145746.80+88082.67x计算嘌呤的产量，峰面积为y值，求x值，即嘌呤的含量。

(1)氮源的筛选：以基础发酵培养基作为对照，取菌种Bacillus sp.JIN118，菌龄为24h，接种量按种子液的5％接种到含有0.5％不同氮源的基础发酵培养基中，氮源分别为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、尿素、氯化铵(NH₄Cl)、硫酸铵(NH₄)₂SO₄，30℃，180r/min摇床振荡培养48h。测定其嘌呤的产量，结果如图4所示，结果显示基础发酵培养基中的嘌呤产量为4.76mg/L，并初步确定最佳氮源为(NH₄)₂SO₄，其嘌呤的产量为13.45mg/L。

(2)(NH₄)₂SO₄浓度的优化：在确定发酵培养基最佳氮源的基础上，更换不同最佳氮源的浓度，分别添加硫酸铵(NH₄)₂SO₄为2g/L、5g/L、8g/L、11g/L、15g/L。30℃，180r/min摇床振荡培养48h。测定其嘌呤的产量，结果如图5所示，初步确定(NH₄)₂SO₄最适的添加量为11g/L，其嘌呤的产量为13.46mg/L。

(3)发酵温度：在确定发酵培养基氮源的基础上，取菌种Bacillus sp.JIN118，菌龄为24h，接种量按种子液的5％接种到发酵培养基中，装液量均为200mL/500mL，分别在22℃、27℃、32℃、37℃、42℃条件下180r/min摇床振荡培养48h。测定其嘌呤的产量，结果如图6所示，初步确定最佳的发酵培养温度为32℃，其嘌呤的产量为14.33mg/L。

(4)发酵时间：取菌种Bacillus sp.JIN118，菌龄为24h，接种量按种子液的5％接种到发酵培养基中，装液量均为200mL/500mL，32℃，180r/min分别培养24h、48h、72h、96h、120h、144h。测定其嘌呤的产量，结果如图7所示，初步确定最佳发酵培养时间为72h，其嘌呤的产量为15.34mg/L。

(5)摇床转速：取菌种Bacillus sp.JIN118，菌龄为24h，接种量按种子液的5％接种到发酵培养基中，装液量均为40％，分别在100r/min、150r/min、200r/min、250r/min条件下于32℃摇床振荡培养72h。测定其嘌呤的产量，结果如图8所示，初步确定最佳的摇床培养转速为200r/min，其嘌呤的产量为15.82mg/L。

(6)初始pH:在6个发酵培养基中，用2mol/L NaOH和2mol/L HCl溶液分别将初始pH值调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，灭菌后待用。取菌种Bacillus sp.JIN118，菌龄为24h，接种量按种子液的5％接种到以上发酵培养基中，装液量均为40％，32℃，200r/min，摇床振荡培养72h。测定其嘌呤的产量，结果如图9所示，初步确定最佳发酵培养初始pH值为8.0，其嘌呤的产量为13.87mg/L。

实施例3正交实验

正交实验：本发明以单因素优化结果为基础，通过设计5因素4水平L₁₆(4⁵)正交实验进一步确定发酵生产嘌呤的最佳培养条件，考察因素为氮源浓度、温度、时间、转速、pH，试验设计因素与水平见表4。

总计共做16组实验，每组试验的培养条件为：32℃，200r/min，培养72h。根据嘌呤标准品的线性方程y＝145746.80+88082.67x计算嘌呤的产量，峰面积为y值，求x值，即嘌呤的含量。L₁₆(4⁵)正交实验设计及结果如表5所示，根据正交实验结果可知，其最优实验组合为A3B4C4D1E3，即最优的发酵培养条件为：氮源为(NH₄)₂SO₄、添加量为11g/L，温度37℃，转速150r/min，时间72h，pH为7.0。

通过最优发酵条件再次发酵培养海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118，测定其嘌呤产量为17.88mg/L。

表4 L₁₆(4⁵)正交实验因素与水平

表5 L₁₆(4⁵)正交实验设计及结果

本发明提供了一种嘌呤的发酵生产工艺，本发明旨在优化嘌呤的发酵生产工艺，达到大幅提高嘌呤产量的目的，为工业化生产提供有效的技术。结合单因素试验与正交试验确定最优的嘌呤的发酵生产工艺条件，最优结果为：氮源为(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₂SO₄添加量为11g/L、温度为37℃、转速为150r/min，时间为72h，pH为7.0。本发明嘌呤的发酵生产工艺经优化后，嘌呤的产量由基础发酵培养基中的4.76mg/L提高到17.88mg/L，本次工艺优化大幅度提高了发酵产量及发酵效率，对后期嘌呤的大批量工业生产具有重要的研究意义。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但并非将本发明限制于所描述的实施例范围内，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 大连民族大学

<120> 嘌呤的发酵生产工艺

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1460

<212> DNA

<213> 海洋芽孢杆菌(Bacillus sp. JIN118)

<400> 1

tagaccgggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct 60

gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac 120

tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag 180

gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac 240

ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300

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ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 780

tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc 840

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