阅读说明：本技术 酶法合成喹嗪酮化合物的方法 (Method for synthesizing quinolizinone compound by enzyme method ) 是由 史社坡 王娟 王晓晖 刘晓 吴云 丁宁 齐博文 屠鹏飞 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法合成喹嗪酮化合物的方法。该酶法合成喹嗪酮化合物的方法采用Ⅲ型聚酮合酶,通过酶法合成喹嗪酮化合物。本发明的酶法合成喹嗪酮化合物的方法可以实现绿色合成,避免使用价格昂贵的稀有金属催化剂以及反应试剂环境不友好问题。(The invention discloses a method for synthesizing a quinolizinone compound by an enzymatic method. The method for synthesizing the quinolizinone compound by the enzyme method adopts type III polyketide synthase and synthesizes the quinolizinone compound by the enzyme method. The method for synthesizing the quinolizinone compound by the enzyme method can realize green synthesis, and avoids the problems of expensive rare metal catalysts and environment-unfriendly reaction reagents.)

酶法合成喹嗪酮化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种酶法合成喹嗪酮化合物的方法。

背景技术

喹嗪酮化合物是一类在结构上具有双环系统，且在环结合处含有氮原子的杂环化合物。喹嗪酮化合物具有极性两性离子特性，显示出独特的物理和化学性质，如作为配体分子容易与蛋白受体结合、具有适中的LogP值等。喹嗪酮化合物还具有非常广泛的药理活性，如抗病毒、抗肿瘤、抗菌等，常用于治疗阿尔茨海默症、II型糖尿病、HIV、疟疾和脊髓性肌萎缩症等。

目前关于构建喹嗪酮化合物的喹嗪酮结构母核的方法虽然比较多，但均为化学合成法，大多合成方法都无法避免反应条件苛刻、使用价格昂贵的稀有金属催化剂、反应试剂环境不友好等问题。例如，CN105001216A公开了一种喹嗪酮的制备方法，利用取代的氮杂环烯丙胺和一氧化碳为原料，在过渡金属催化剂、有或无配体存在下发生羰基化反应，得到喹嗪酮结构的化合物。CN106928215A公开了一种制备式Ⅰ的喹嗪酮化合物的方法，其包括：步骤(A)式Ⅲ的化合物在溶剂中，在氧化剂作用下、电氧化还原条件下或光氧化还原条件下被氧化，然后用酸处理得到成环的顺式的式Ⅱ的化合物；以及步骤(B)式Ⅱ的化合物经水解得到式Ⅰ的化合物。

如何绿色地合成喹嗪酮化合物，避免使用价格昂贵的稀有金属催化剂以及反应试剂环境不友好问题，目前尚无相关报道。

酶催化合成法作为绿色化学合成技术中的重要组成部分，日益受到科学家们的关注。

鉴于现有技术的缺陷，建立一种酶法合成喹嗪酮生物碱及其衍生物的方法，从而实现绿色合成，避免使用价格昂贵的稀有金属催化剂以及反应试剂环境不友好问题，这是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酶法合成喹嗪酮化合物的方法，其采用酶法合成方法，实现绿色合成，避免使用价格昂贵的稀有金属催化剂以及反应试剂环境不友好问题。

本发明采用如下技术方案实现上述目的。

本发明提供一种酶法合成喹嗪酮化合物的方法，采用Ⅲ型聚酮合酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物。

根据本发明的方法，优选地，采用Ⅲ型聚酮合酶和辅酶A连接酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物；所述辅酶A连接酶选自苯乙酰辅酶A连接酶PCL或丙二酰辅酶A连接酶At.MatB。

根据本发明的方法，优选地，采用Ⅲ型聚酮合酶、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB三种酶，以吡啶乙酸类化合物和丙二酸类化合物为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物；其中，所述Ⅲ型聚酮合酶选自聚酮合酶HsPKS3；所述吡啶乙酸类化合物选自吡啶乙酸或取代的吡啶乙酸；所述丙二酸类化合物选自丙二酸或取代的丙二酸。

根据本发明的方法，优选地，所述吡啶乙酸类化合物选自吡啶乙酸、2-(5-氟吡啶-3-基)乙酸、2-(6-氟吡啶-3-基)乙酸中的至少一种；所述丙二酸类化合物选自丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、烯丙基丙二酸中的至少一种。

根据本发明的方法，优选地，包括如下具体步骤：

在磷酸盐缓冲溶液中加入MgCl₂、NaCl、DTT、ATP Na₂、CoA、吡啶乙酸类化合物、丙二酸类化合物、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，25～35℃反应1h后，加入聚酮合酶HsPKS3，28～45℃继续反应过夜；次日，将反应液经萃取、浓缩与纯化，得到喹嗪酮化合物；其中，吡啶乙酸类化合物、丙二酸类化合物的摩尔比为0.8～1.2:0.8～1.2；吡啶乙酸类化合物、苯乙酰辅酶A连接酶PCL的摩尔比为8×10⁵～1.2×10⁶:1；丙二酸类化合物、丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的摩尔比为8×10⁵～1.2×10⁶:1；苯乙酰辅酶A连接酶PCL、丙二酰辅酶A连接酶At.MatB、聚酮合酶HsPKS3的摩尔比为0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2。

根据本发明的方法，优选地，仅采用Ⅲ型聚酮合酶作为唯一的酶催化吡啶乙酰型辅酶A和丙二酰型辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物；其中，所述Ⅲ型聚酮合酶选自聚酮合酶HsPKS3；所述吡啶乙酰型辅酶A选自吡啶乙酰辅酶A或取代的吡啶乙酰辅酶A；所述丙二酰型辅酶A选自丙二酰辅酶A或取代的丙二酰辅酶A。

根据本发明的方法，优选地，所述吡啶乙酰型辅酶A选自吡啶乙酰辅酶A、2-(5-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A、2-(6-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A中的至少一种；所述丙二酰型辅酶A选自丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A、烯丙基丙二酰辅酶A中的至少一种。

根据本发明的方法，优选地，包括如下具体步骤：

在磷酸盐缓冲溶液中加入吡啶乙酰型辅酶A、丙二酰型辅酶A和聚酮合酶HsPKS3，28～45℃水浴摇床中反应过夜；次日，将反应液经萃取、浓缩与纯化，得到喹嗪酮化合物；其中，吡啶乙酰型辅酶A、丙二酰型辅酶A、聚酮合酶HsPKS3的摩尔比为800～1200:800～1200:6.5～9.5。

根据本发明的方法，优选地，还包括苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化吡啶乙酸类化合物生成吡啶乙酰型辅酶A的步骤；其中，所述吡啶乙酸类化合物选自吡啶乙酸或取代的吡啶乙酸。

根据本发明的方法，优选地，苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化吡啶乙酸类化合物生成吡啶乙酰型辅酶A的步骤如下：取Tris-HCl、NaCl、MgCl₂、CoA、ATP Na₂、吡啶乙酸类化合物和苯乙酰辅酶A连接酶PCL，加水，25～35℃反应4～8h，得到吡啶乙酰型辅酶A；其中，吡啶乙酸类化合物、苯乙酰辅酶A连接酶PCL的摩尔比为8×10⁵～1.2×10⁶:1。

本发明的酶法合成喹嗪酮化合物的方法，采用Ⅲ型聚酮合酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物，实现了绿色合成，避免使用价格昂贵的稀有金属催化剂以及反应试剂环境不友好问题。

附图说明

图1为蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3的SDS-PAGE凝胶电泳结果。

图2为克隆pcl基因的凝胶电泳结果。

图3为克隆表达的苯乙酰辅酶A连接酶PCL的SDS-PAGE凝胶电泳结果。

图4为丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的SDS-PAGE凝胶电泳结果。

图5为采用Ⅲ型聚酮合酶(聚酮合酶HsPKS3)、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB三种酶合成喹嗪酮化合物的合成路线图。

图6为仅采用Ⅲ型聚酮合酶(聚酮合酶HsPKS3)作为唯一的酶催化吡啶乙酰型辅酶A和丙二酰型辅酶A合成喹嗪酮化合物的合成路线图。

图7为苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化吡啶乙酸类化合物生成吡啶乙酰型辅酶A的合成路线图。

图8为丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化丙二酸类化合物生成丙二酰型辅酶A的合成路线图。

图9为喹嗪酮化合物的一种合成路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

传统的喹嗪酮化合物的制备方法均采用化学合成法，大多合成方法都无法避免反应条件苛刻、使用价格昂贵的稀有金属催化剂、反应试剂环境不友好等问题。本申请意外地发现，采用Ⅲ型聚酮合酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物，可以实现绿色合成，避免使用价格昂贵的稀有金属催化剂以及反应试剂环境不友好问题。此外，采用Ⅲ型聚酮合酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物，可以实现喹嗪酮化合物的合成途径在微生物中的重构提供必要的基因元件。

本发明的酶法合成喹嗪酮化合物的方法包括：采用Ⅲ型聚酮合酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物。采用Ⅲ型聚酮合酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物，实现了绿色合成，避免使用价格昂贵的稀有金属催化剂以及反应试剂环境不友好问题。

在本发明中，Ⅲ型聚酮合酶是一种重复使用的亚基分子大小为40×10³～47×10³的同源二聚体自主式合酶，能直接催化泛酞辅酶A间的缩合，形成单环或双环芳香类聚酮化合物。Ⅲ型聚酮合酶优选为聚酮合酶HsPKS3，更优选为从蛇足石杉(Huperzia serrata)中克隆表达的聚酮合酶HsPKS3。

在本发明中，可以采用Ⅲ型聚酮合酶和辅酶A连接酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物。所述辅酶A连接酶优选选自苯乙酰辅酶A连接酶PCL或丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，更优选为苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB。优选地，采用Ⅲ型聚酮合酶与苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB三种酶，通过酶法合成喹嗪酮化合物。苯乙酰辅酶A连接酶PCL优选为从产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)中克隆表达的苯乙酰辅酶A连接酶(PCL)。丙二酰辅酶A连接酶(At.MatB)优选为从拟南芥(A.thaliana)中克隆表达的丙二酰辅酶A连接酶(At.MatB)。

在本发明中，也可以仅采用Ⅲ型聚酮合酶作为唯一的酶，以吡啶乙酰型辅酶A和丙二酰型辅酶A为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物。吡啶乙酰型辅酶A可以通过市售购买方式得到，也可以通过常规化学合成方法得到，还可以通过生物方法例如酶催化合成法得到。优选地，吡啶乙酰型辅酶A通过生物方法例如酶催化合成法得到。丙二酰型辅酶A可以通过市售购买方式得到，也可以通过常规化学合成方法得到，还可以通过生物方法例如酶催化合成法得到。优选地，丙二酰型辅酶A通过生物方法例如酶催化合成法得到。

根据本发明的一个实施方式，采用Ⅲ型聚酮合酶、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB三种酶，以吡啶乙酸类化合物和丙二酸类化合物为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物；其中，所述Ⅲ型聚酮合酶选自聚酮合酶HsPKS3；所述吡啶乙酸类化合物选自吡啶乙酸或取代的吡啶乙酸；所述丙二酸类化合物选自丙二酸或取代的丙二酸。其中，所述喹嗪酮化合物的合成路线如图5所示。

在本发明中，取代的吡啶乙酸，其取代基可以选自羟基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、卤代基、芳香基中任意一种，优选为羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代基、苯基、苄基中任意一种，更优选为羟基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤代基中任意一种。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。卤代基优选选自氟代基、氯代基、溴代基。

在本发明中，取代的丙二酸，其取代基可以选自羟基、烯丙基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、卤代基、芳香基中任意一种，优选为羟基、烯丙基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代基、苯基、苄基中任意一种，更优选为羟基、烯丙基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤代基中任意一种。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。卤代基优选选自氟代基、氯代基、溴代基。

在本发明中，吡啶乙酸类化合物优选选自吡啶乙酸、5-F-吡啶乙酸(2-(5-氟吡啶-3-基)乙酸)、6-F-吡啶乙酸(2-(6-氟吡啶-3-基)乙酸)中的至少一种。丙二酸类化合物优选选自丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、烯丙基丙二酸中的至少一种。

在某些实施方案中，酶法合成喹嗪酮化合物的方法包括如下具体步骤：在磷酸盐缓冲溶液中加入MgCl₂、NaCl、DTT、ATP Na₂、CoA、吡啶乙酸类化合物、丙二酸类化合物、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，25～35℃反应1h后，加入聚酮合酶HsPKS3，28～45℃继续反应过夜；次日，将反应液经萃取、浓缩与纯化，得到喹嗪酮化合物。吡啶乙酸类化合物、丙二酸类化合物的摩尔比可以为0.8～1.2:0.8～1.2，优选为0.9～1.1:0.9～1.1，更优选为0.95～1.05:0.95～1.05。吡啶乙酸类化合物、苯乙酰辅酶A连接酶PCL的摩尔比可以为8×10⁵～1.2×10⁶:1，优选为9×10⁵～1.1×10⁶:1，更优选为9.5×10⁵～1.05×10⁶:1。丙二酸类化合物、丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的摩尔比可以为8×10⁵～1.2×10⁶:1，优选为9×10⁵～1.1×10⁶:1，更优选为9.5×10⁵～1.05×10⁶:1。苯乙酰辅酶A连接酶PCL、丙二酰辅酶A连接酶At.MatB、聚酮合酶HsPKS3的摩尔比可以为0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，优选为0.9～1.1:0.9～1.1:0.9～1.1，更优选为0.95～1.05:0.95～1.05:0.95～1.05。

根据本发明的另一个实施方式，仅采用Ⅲ型聚酮合酶作为唯一的酶催化吡啶乙酰型辅酶A和丙二酰型辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物；其中，所述Ⅲ型聚酮合酶选自聚酮合酶HsPKS3；所述吡啶乙酰型辅酶A选自吡啶乙酰辅酶A或取代的吡啶乙酰辅酶A；所述丙二酰型辅酶A选自丙二酰辅酶A或取代的丙二酰辅酶A。所述喹嗪酮化合物的合成路线如图6所示。

在本发明中，取代的吡啶乙酰辅酶A，其取代基可以选自羟基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、卤代基、芳香基中任意一种，优选为羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代基、苯基、苄基中任意一种，更优选为羟基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤代基中任意一种。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。卤代基优选选自氟代基、氯代基、溴代基。

在本发明中，取代的丙二酰辅酶A，其取代基可以选自羟基、烯丙基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、卤代基、芳香基中任意一种，优选为羟基、烯丙基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代基、苯基、苄基中任意一种，更优选为羟基、烯丙基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤代基中任意一种。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。卤代基优选选自氟代基、氯代基、溴代基。

在本发明中，吡啶乙酰型辅酶A优选选自吡啶乙酰辅酶A、5-F-吡啶乙酰辅酶A(2-(5-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A)、6-F-吡啶乙酰辅酶A(2-(6-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A)中的至少一种。丙二酰型辅酶A优选选自丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A、烯丙基丙二酰辅酶A中的至少一种。

在某些实施方案中，酶法合成喹嗪酮化合物的方法包括如下具体步骤：在磷酸盐缓冲溶液中加入吡啶乙酰型辅酶A、丙二酰型辅酶A和聚酮合酶HsPKS3，28～45℃水浴摇床中反应过夜；次日，将反应液经萃取、浓缩与纯化，得到喹嗪酮化合物；其中，吡啶乙酰型辅酶A、丙二酰型辅酶A、聚酮合酶HsPKS3的摩尔比为800～1200:800～1200:6.5～9.5。吡啶乙酰型辅酶A、丙二酰型辅酶A、聚酮合酶HsPKS3的摩尔比优选为900～1100:900～1100:7～9；更优选为950～1050:950～1050:7.8～8.5。磷酸盐缓冲溶液优选选自磷酸钾缓冲溶液或磷酸钠缓冲溶液，更优选为磷酸钾缓冲溶液。根据本发明的一个具体实施方式，在磷酸钾缓冲溶液中加入吡啶乙酰型辅酶A、丙二酰型辅酶A和聚酮合酶HsPKS3，28～45℃水浴摇床中反应过夜；次日，将反应液经萃取、浓缩与纯化，得到喹嗪酮化合物；其中，吡啶乙酰型辅酶A、丙二酰型辅酶A、聚酮合酶HsPKS3的摩尔比为950～1050:950～1050:7.8～8.5。

在本发明中，通过酶法合成喹嗪酮化合物的方法还可以包括苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化吡啶乙酸类化合物生成吡啶乙酰型辅酶A的步骤；其中，所述吡啶乙酸类化合物选自吡啶乙酸或取代的吡啶乙酸。其中，所述吡啶乙酰型辅酶A的合成路线如图7所示。取代的吡啶乙酸，其取代基可以选自羟基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、卤代基、芳香基中任意一种，优选为羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代基、苯基、苄基中任意一种，更优选为羟基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤代基中任意一种。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。卤代基优选选自氟代基、氯代基、溴代基。

在本发明中，苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化吡啶乙酸类化合物生成吡啶乙酰型辅酶A的步骤优选如下：取Tris-HCl、NaCl、MgCl₂、CoA、ATP Na₂、吡啶乙酸类化合物和苯乙酰辅酶A连接酶PCL，加水，25～35℃反应4～8h，得到吡啶乙酰型辅酶A；其中，吡啶乙酸类化合物、苯乙酰辅酶A连接酶PCL的摩尔比为8×10⁵～1.2×10⁶:1。吡啶乙酸类化合物、苯乙酰辅酶A连接酶PCL的摩尔比优选为9×10⁵～1.1×10⁶:1，更优选为9.5×10⁵～1.05×10⁶:1。

在本发明中，通过酶法合成喹嗪酮化合物的方法还可以包括丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化丙二酸类化合物生成丙二酰型辅酶A的步骤；其中，所述丙二酸类化合物选自丙二酸或取代的丙二酸。其中，所述丙二酰型辅酶A的合成路线如图8所示。取代的丙二酸，其取代基可以选自羟基、烯丙基、C1-C9烷基、C1-C9烷氧基、卤代基、芳香基中任意一种，优选为羟基、烯丙基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代基、苯基、苄基中任意一种，更优选为羟基、烯丙基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、卤代基中任意一种。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。卤代基优选选自氟代基、氯代基、溴代基。

在本发明中，丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化丙二酸类化合物生成丙二酰型辅酶A的步骤优选如下：取磷酸盐缓冲溶液、MgCl₂、CoA、ATP Na₂、DTT、丙二酸类化合物和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，加水，25～35℃反应8～15h，得到丙二酰型辅酶A；其中，丙二酸类化合物、丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的摩尔比为4×10⁵～9×10⁵:1。丙二酸类化合物、丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的摩尔比优选为5×10⁵～8×10⁵:1，更优选为5.5×10⁵～7×10⁵:1。磷酸盐缓冲溶液优选选自磷酸钾缓冲溶液或磷酸钠缓冲溶液，更优选为磷酸钾缓冲溶液。根据本发明的一个具体实施方式，取磷酸盐缓冲溶液、MgCl₂、CoA、ATP Na₂、DTT、丙二酸类化合物和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，加水，25～35℃反应8～15h，得到丙二酰型辅酶A；其中，丙二酸类化合物、丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的摩尔比为5.5×10⁵～6.5×10⁵:1。

根据本发明的一个具体实施方式，酶法合成喹嗪酮化合物的方法包括如下步骤：(1)苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化吡啶乙酸类化合物生成吡啶乙酰型辅酶A；其中，所述吡啶乙酸类化合物选自吡啶乙酸或取代的吡啶乙酸；(2)丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化丙二酸类化合物生成丙二酰型辅酶A；其中，所述丙二酸类化合物选自丙二酸或取代的丙二酸；(3)仅采用Ⅲ型聚酮合酶作为唯一的酶催化吡啶乙酰型辅酶A和丙二酰型辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物；其中，所述Ⅲ型聚酮合酶选自聚酮合酶HsPKS3。所述喹嗪酮化合物的合成路线如图9所示。

以下实施例与实验例采用的实验试剂、仪器以及检测指标如下：

LB液体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，蒸馏水溶解后，用NaOH调pH至7.0，加蒸馏水定容到1L，121℃高压蒸汽灭菌15min。

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、PMSF(苯甲基磺酰氟)均购买自北京拜尔迪生物有限公司。CoA(辅酶A)、ATP Na₂(三磷酸腺苷二钠)、DTT(二硫苏糖醇)、吡啶乙酸、2-(5-氟吡啶-3-基)乙酸、2-(6-氟吡啶-3-基)乙酸、丙二酸、甲基丙二酸、乙基丙二酸、烯丙基丙二酸均购买自上海源叶生物科技有限公司。

蛋白破碎提取纯化相关缓冲液的配制：

裂解缓冲液：称取4.145g K₂HPO₄，0.25g KH₂PO₄，2.92g NaCl，0.17g咪唑，溶于300mL双蒸水，调节pH至7.9，定容至500mL；

结合缓冲液：称取2.072g K₂HPO₄，0.125g KH₂PO₄，14.61g NaCl，溶于300mL双蒸水，调节pH至7.9，定容至500mL；

KPB洗涤缓冲液：称取2.072g K₂HPO₄，0.125g KH2PO4，14.61g NaCl，1.362g咪唑，溶于300mL双蒸水，调节pH至7.9，定容至500mL；

KPB洗脱缓冲液：称取1.554g K₂HPO₄，0.096g KH₂PO₄，50mL甘油，13.62g咪唑，溶于300mL双蒸水，调节pH至7.9，定容至500mL；

脱盐时采用的脱盐缓冲液：称取2.145g K₂HPO₄，0.0817g KH₂PO₄，50mL甘油，1mL0.5M EDTA溶于300mL双蒸水，调节pH至7.9，定容至500mL。

TANG Buffer：称取3.028g Tris，用HCl调节pH至7.5，5.844g NaCl，50mL甘油，0.01g叠氮化钠，溶于500mL双蒸水。

Washing Buffer：称取3.028g Tris，用HCl调节pH至7.5，5.844g NaCl，50mL甘油，0.01g叠氮化钠，17.02g咪唑，溶于500mL双蒸水。

SDS-PAGE凝胶电泳相关试剂配制：

蛋白上样缓冲液：40mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，10％甘油，2％SDS，5％β-巯基乙醇(现用现加)，0.1％溴酚蓝。

上层浓缩胶缓冲液(0.5M Tris-HCl)：称取30.285g Tris，溶于50mL双蒸水，HCl调节pH至6.8，加2g SDS后，定容至500mL。

下层分离胶缓冲液(0.5M Tris-HCl)：称取90.885g Tris，溶于50mL双蒸水，HCl调节pH至8.8，加2g SDS后，定容至500mL。

10％(w/v)过硫酸铵(Ammonium persulfate,10％AP)(100mL)：10g过硫酸铵粉末，加双蒸水定容至100mL，分装后避光储存于-20℃。

5×蛋白电泳缓冲液：称取15.1g Tris-HCl，72g甘氨酸，5g SDS，加双蒸水定容至1L。

考马斯亮蓝染色液：0.1％考马斯亮蓝R250，25％甲醇，7％冰醋酸，滤纸过滤后使用。注意：考马斯亮蓝R250先充分溶解于甲醇后再加入其它成分。

脱色液：50mL冰乙酸，100mL甲醇，蒸馏水定容至500mL。

电泳仪(Bio-Rad，USA)、PCR扩增仪(Eppendorf，Hamburg，Germany)、质谱仪(日本Shimadzu)、核磁共振仪(美国Varian)、超声破碎仪(Cole Parmer，USA)、Centricon Plus-80 Millipore超滤离心管(Millipore公司)。

实施例1蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3的制备

将含有HsPKS3基因(SEQ ID NO:1)的表达菌株(Org.Lett.,2016,18,3550-3553)以体积比为1:100的比例加入10mL LB液体培养基中，37℃活化过夜；其中，LB液体培养基含50μg/mL的卡那霉素。次日，放大LB液体培养基，依旧将含有HsPKS3基因的表达菌株以体积比为1:100的比例加入LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀在0.4～0.6之间，加入1vol‰的1M的IPTG，23℃低温诱导表达16h。以4℃，7500×g，离心5min，收集菌体。

将收集到的菌体重悬于预冷的裂解缓冲液中，加入1vol‰的PMSF，冰浴超声破碎。超声破碎仪设定为：破碎2s，停4s，共破碎10min。破碎液以4℃，8000×g，离心40min至菌体沉降，得到含有聚酮合酶HsPKS3的上清液；将含有聚酮合酶HsPKS3的上清液迅速转移至干净的50mL离心管中，并置于冰上。然后将上述上清液用0.45μm的微孔滤膜滤过，上样于预平衡好的Ni²⁺螯合树脂亲和色谱柱；先用KPB洗涤缓冲液除去杂蛋白，之后用含有400mM咪唑的KPB洗脱缓冲液洗脱，洗脱液超滤离心浓缩，脱盐，得到蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3。蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图1所示。

实施例2a吡啶乙酰辅酶A的制备

①产黄青霉菌中克隆表达的苯乙酰辅酶A连接酶PCL的克隆表达：

从蛇足石杉中分离纯化出产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum MT-12)，并经ITS rDNA序列测序鉴定(GenBank accession number MF765611)。

根据NCBI中收录的产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)中苯乙酰辅酶A连接酶PCL(AJ001540)基因的全长序列(SEQ ID NO:2)，设计正反向特异性引物PCL-F-EcoR I和PCL-R-Hind III，利用产黄青霉菌基因组DNA(编号：MT-12)为模板，通过PyrobestTM DNAPolymerase进行PCR扩增，获得目标序列全长1737bp，编码563个氨基酸。构建重组质粒pMAl-C₂X-PCL并转入大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中。菌落PCR挑选阳性克隆单菌落接种到10mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃活化过夜。次日，放大LB液体培养基，以体积比为1:100的比例加入菌液，37℃振荡培养至OD₆₀₀在0.4～0.6之间，加入0.5vol‰的1M的IPTG，17℃低温诱导表达16h。以4℃，7500×g，离心5min收集菌体。之后将收集到的菌体重悬于预冷的TANG Buffer中，加入1vol‰的PMSF，冰浴超声破碎。超声破碎仪设定为：破碎2s，停4s，共破碎10min。破碎液以4℃，8000×g，离心40min至菌体沉降，得到含有苯乙酰辅酶A连接酶PCL的上清液。将含有苯乙酰辅酶A连接酶PCL的上清液迅速转移至干净的50mL离心管中，置于冰上。然后将上述上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤，上样于已预先用TANG Buffer平衡好的Ni²⁺螯合树脂亲和柱上；先用TANG Buffer除去杂蛋白，之后用含有500mM咪唑的Washing Buffer洗脱，洗脱液用Centricon Plus-80 Millipore超滤离心管离心浓缩，之后用TANG Buffer替换Washing Buffer除去咪唑即得到苯乙酰辅酶A连接酶PCL。克隆pcl基因的凝胶电泳结果如图2所示。克隆表达的苯乙酰辅酶A连接酶PCL的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图3所示。

②苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化合成吡啶乙酰辅酶A

取5mL浓度为100mM且pH为8.5的Tris-HCl、0.8mL浓度为2M的NaCl、1mL浓度为62.5mM的MgCl₂、11.5mg的CoA、18.16mg的ATP Na₂、10mM吡啶乙酸和10nM步骤①得到的苯乙酰辅酶A连接酶PCL，加双蒸水至10mL，30℃反应6h，得到吡啶乙酰辅酶A。

实施例2b 2-(5-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A的制备

①采用与实施例2a中①完全相同的条件，进行“产黄青霉菌中苯乙酰辅酶A连接酶PCL的克隆表达”，制备苯乙酰辅酶A连接酶PCL。

②苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化合成2-(5-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A

取5mL浓度为100mM且pH为8.5的Tris-HCl、0.8mL浓度为2M的NaCl、1mL浓度为62.5mM的MgCl₂、11.5mg的CoA、18.16mg的ATP Na₂、10mM 2-(5-氟吡啶-3-基)乙酸和10nM步骤①得到的苯乙酰辅酶A连接酶PCL，加双蒸水至10mL，30℃反应6h，得到2-(5-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A。

实施例2c 2-(6-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A的制备

①采用与实施例2a中①完全相同的条件进行“产黄青霉菌中苯乙酰辅酶A连接酶PCL的克隆表达”，制备苯乙酰辅酶A连接酶PCL。

②苯乙酰辅酶A连接酶PCL催化合成2-(6-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A

取5mL浓度为100mM且pH为8.5的Tris-HCl、0.8mL浓度为2M的NaCl、1mL浓度为62.5mM的MgCl₂、11.5mg的CoA、18.16mg的ATP Na₂、10mM 2-(6-氟吡啶-3-基)乙酸和10nM步骤①得到的苯乙酰辅酶A连接酶PCL，加双蒸水至10mL，30℃反应6h，得到2-(6-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A。

实施例3a丙二酰辅酶A的制备

①丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的制备

从拟南芥(A.thaliana)中成功克隆鉴定了丙二酰辅酶A连接酶At.MatB。将含有At.MatB基因的表达菌株以体积比为1:100的比例加入10mL LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中37℃活化过夜；其中，LB液体培养基含50μg/mL的卡那霉素。次日，放大LB液体培养基，依旧以体积比为1:100的比例加入菌液，37℃振荡培养至OD₆₀₀在0.4～0.6之间，加入1vol‰的1M的IPTG，23℃低温诱导表达16h。以4℃，7500×g，离心5min收集菌体。之后将收集到的菌体重悬于预冷的裂解缓冲液中，加入1vol‰的PMSF，冰浴超声破碎。超声破碎仪设定为：破碎2s，停4s，共破碎10min。破碎液以4℃，8000×g，离心40min至菌体沉降，得到含有丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的上清液。将含有丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的上清液迅速转移至干净的50mL离心管中，并置于冰上。然后将上述上清液用0.45μm的微孔滤膜滤过，上样于预平衡好的Ni²⁺螯合树脂亲和色谱柱；先用洗涤缓冲液除去杂蛋白，之后用含有400mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，洗脱液用Centricon Plus-80 Millipore超滤离心管离心浓缩，之后用除盐缓冲液除去咪唑即得到丙二酰辅酶A连接酶At.MatB。经BCA法测定丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的浓度为1.2mg/mL。丙二酰辅酶A连接酶At.MatB的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图4所示。

②丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化合成丙二酰辅酶A

取3.9mL浓度为100mM且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液、1.6mL浓度为62.5mM的MgCl₂、23.02mg CoA、36.31mg ATP Na₂、3.10mg DTT、6mM丙二酸和10nM步骤①得到的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，加双蒸水至10mL，30℃反应12h，得到丙二酰辅酶A。

实施例3b甲基丙二酰辅酶A的制备

①采用与实施例3a中①完全相同的条件制备丙二酰辅酶A连接酶At.MatB。

②丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化合成甲基丙二酰辅酶A

取3.9mL浓度为100mM且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液、1.6mL浓度为62.5mM的MgCl₂、23.02mg CoA、36.31mg ATP Na₂、3.10mg DTT、6mM甲基丙二酸和10nM步骤①得到的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，加双蒸水至10mL，30℃反应12h，得到甲基丙二酰辅酶A。

实施例3c乙基丙二酰辅酶A的制备

①采用与实施例3a中①完全相同的条件制备丙二酰辅酶A连接酶At.MatB。

②丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化合成乙基丙二酰辅酶A

取3.9mL浓度为100mM且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液、1.6mL浓度为62.5mM的MgCl₂、23.02mg CoA、36.31mg ATP Na₂、3.10mg DTT、6mM乙基丙二酸和10nM上述步骤①得到的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，加双蒸水至10mL，30℃反应12h，得到乙基丙二酰辅酶A。

实施例3d烯丙基丙二酰辅酶A的制备

①采用与实施例3a中①完全相同的条件制备丙二酰辅酶A连接酶At.MatB。

②丙二酰辅酶A连接酶At.MatB催化合成烯丙基丙二酰辅酶A

取3.9mL浓度为100mM且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液、1.6mL浓度为62.5mM的MgCl₂、23.02mg CoA、36.31mg ATP Na₂、3.10mg DTT、6mM烯丙基丙二酸和10nM步骤①得到的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，加双蒸水至10mL，30℃反应12h，得到烯丙基丙二酰辅酶A。

实施例4a蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P1

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、吡啶乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物P1。

在10ml浓度为0.1M且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液中加入1μmol实施例2a的吡啶乙酰辅酶A、1μmol实施例3a的丙二酰辅酶A和8.2nmol实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，37℃水浴摇床中反应过夜。次日，将反应液经2倍的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P1。

实施例4b蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P1

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，以吡啶乙酸和丙二酸为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物P1。

在10ml浓度为100mM且pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中加入10mM MgCl₂、200mMNaCl、2mM DTT、6mM ATP Na₂、4.5mM CoA、10mM吡啶乙酸、10mM丙二酸、10nM实施例2a的苯乙酰辅酶A连接酶PCL和10nM实施例3a的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，30℃反应1h后，加入10nM实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，33℃继续反应过夜。次日，将反应液用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，真空离心浓缩仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P1。

实施例5a蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P2

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、吡啶乙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物P2。

在10ml浓度为0.1M且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液中加入1μmol实施例2a的吡啶乙酰辅酶A、1μmol实施例3b的甲基丙二酰辅酶A和8.2nmol实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，37℃水浴摇床中反应过夜。次日，将反应液经2倍的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P2。

实施例5b蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P2

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，以吡啶乙酸和甲基丙二酸为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物P2。

在10ml浓度为100mM且pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中加入10mM MgCl₂、200mMNaCl、2mM DTT、6mM ATP Na₂、4.5mM CoA、10mM吡啶乙酸、10mM甲基丙二酸、10nM实施例2a的苯乙酰辅酶A连接酶PCL和10nM实施例3a的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，30℃反应1h后，加入10nM实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，33℃继续反应过夜。次日，将反应液用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，真空离心浓缩仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P2。

实施例6a蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P3

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、吡啶乙酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物P3。

在10ml浓度为0.1M且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液中加入1μmol实施例2a的吡啶乙酰辅酶A、1μmol实施例3c的乙基丙二酰辅酶A和8.2nmol实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，37℃水浴摇床中反应过夜。次日，将反应液经2倍的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P3。

实施例6b蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P3

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，以吡啶乙酸和乙基丙二酸为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物P3。

在10ml浓度为100mM且pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中加入10mM MgCl₂、200mMNaCl、2mM DTT、6mM ATP Na₂、4.5mM CoA、10mM吡啶乙酸、10mM乙基丙二酸、10nM实施例2a的苯乙酰辅酶A连接酶PCL和10nM实施例3a的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，30℃反应1h后，加入10nM实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，33℃继续反应过夜。次日，将反应液用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，真空离心浓缩仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P3。

实施例7a蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P4

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、吡啶乙酰辅酶A和烯丙基丙二酰辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物P4。

在10ml浓度为0.1M且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液中加入1μmol实施例2a的吡啶乙酰辅酶A、1μmol实施例3d的烯丙基丙二酰辅酶A和8.2nmol实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，37℃水浴摇床中反应过夜。次日，将反应液经2倍的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P4。

实施例7b蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P4

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，以吡啶乙酸和烯丙基丙二酸为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物P4。

在10ml浓度为100mM且pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中加入10mM MgCl₂、200mMNaCl、2mM DTT、6mM ATP Na₂、4.5mM CoA、10mM吡啶乙酸、10mM烯丙基丙二酸、10nM实施例2a的苯乙酰辅酶A连接酶PCL和10nM实施例3a的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，30℃反应1h后，加入10nM实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，33℃继续反应过夜。次日，将反应液用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，真空离心浓缩仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P4。

实施例8a蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P5

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、2-(6-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A和烯丙基丙二酰辅酶A，通过酶法合成喹嗪酮化合物P5。

在10ml浓度为0.1M且pH为7.0的磷酸钾缓冲溶液中加入1μmol实施例2c的2-(6-氟吡啶-3-基)乙酰辅酶A、1μmol实施例3d的烯丙基丙二酰辅酶A和8.2nmol实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，37℃水浴摇床中反应过夜。次日，将反应液经2倍的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P5。

实施例8b蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3催化合成喹嗪酮化合物P5

采用蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3、苯乙酰辅酶A连接酶PCL和丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，以2-(6-氟吡啶-3-基)乙酸和烯丙基丙二酸为底物，通过酶法合成喹嗪酮化合物P5。

在10ml浓度为100mM且pH为7.5的磷酸钾缓冲溶液中加入10mM MgCl₂、200mMNaCl、2mM DTT、6mM ATP Na₂、4.5mM CoA、10mM 2-(6-氟吡啶-3-基)乙酸、10mM烯丙基丙二酸、10nM实施例2a的苯乙酰辅酶A连接酶PCL和10nM实施例3a的丙二酰辅酶A连接酶At.MatB，30℃反应1h后，加入10nM实施例1的蛇足石杉中聚酮合酶HsPKS3，33℃继续反应过夜。次日，将反应液用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次后，合并乙酸乙酯层，真空离心浓缩仪旋干，经过液相色谱纯化，得到喹嗪酮化合物P5。

实验例1

将实施例4a、4b得到的喹嗪酮化合物P1进行结构鉴定。

质谱显示，[M-H]^-峰m/z：160.0404，计算值：峰m/z：160.0406[M-H]^-，分子式为C₉H₇NO₂。

核磁共振的氢谱¹H NMR(500MHz，CD₃OD):δ_H 6.01(1H,s,H-3),6.39(1H,s,H-1),6.92(1H,t,J＝6.0Hz,H-7),7.34(1H,t,J＝8.0Hz,H-6),7.44(1H,d,J＝9.0Hz,H-8),8.81(1H,d,J＝7.0Hz,H-5)。

核磁共振的碳谱¹³C NMR(125MHz，CD₃OD):δ_C 96.4(C-1),168.8(C-2)，95.1(C-3),161.7,(C-4),127.3(C-5),131.2(C-6),114.5(C-7),125.5(C-8),144.8(C-9)。

由此推测喹嗪酮化合物P1为2-羟基喹嗪酮。喹嗪酮化合物P1的化学结构式如下所示：

实验例2

将实施例5a、5b得到的喹嗪酮化合物P2进行结构鉴定。

质谱显示，[M-H]^-峰m/z：174.0563，计算值：峰m/z：174.0561[M-H]^-，分子式为C₉H₁₀NO₂。

核磁共振的氢谱¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆):δ_H 2.01(3H,s),6.37(1H,s,H-1),6.86(1H,t,J＝6.5Hz,H-7),7.26(1H,t,J＝6.5Hz,H-6),7.46(1H,d,J＝7.5Hz,H-8),8.74(1H,d,J＝6.0Hz,H-5)。

核磁共振的碳谱¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆):δ_C 158.5(C-4),92.8(C-1),100.8(C-3),112.8(C-7),124.2(C-8),126.0(C-5),128.7(C-6),139.9(C-9),162.2(C-2),9.7(C-10)。

由此推测喹嗪酮化合物P2为2-羟基-3-甲基喹嗪酮。喹嗪酮化合物P2的化学结构式如下所示：

实验例3

将实施例6a、6b得到的喹嗪酮化合物P3进行结构鉴定。

质谱显示，[M+H]⁺峰m/z：190.0861，计算值：峰m/z：190.0861[M+H]⁺，预测分子式为C₁₁H₁₁NO₂。

喹嗪酮化合物P3的分子量与已确定结构的喹嗪酮化合物P1相比多了28，且同时乙基的分子量为28，确定喹嗪酮化合物P3为2-羟基-3-乙基-喹嗪酮。喹嗪酮化合物P3的化学结构式如下所示：

实验例4

将实施例7a、7b得到的喹嗪酮化合物P4进行结构鉴定。

质谱显示，[M+H]⁺峰m/z：202.0863，计算值：峰m/z：202.0863[M+H]⁺，预测分子式为C₁₂H₁₁NO₂。

喹嗪酮化合物P4的分子量与已确定结构的喹嗪酮化合物P1相比多了40，且同时烯丙基的分子量为40，确定喹嗪酮化合物P4为2-羟基-3-烯丙基-喹嗪酮。喹嗪酮化合物P4的化学结构式如下所示：

实验例5

将实施例8a、8b得到的喹嗪酮化合物P5进行结构鉴定。

质谱显示，[M-H]^-峰m/z：178.0337，计算值：峰m/z：178.0310[M-H]^-，预测分子式为C₉H₆FNO₂。

喹嗪酮化合物P5的分子量与已确定结构的喹嗪酮化合物P1相比多了18，且同时F原子的分子量为18，确定喹嗪酮化合物P5为2-羟基-6-F-喹嗪酮。喹嗪酮化合物P5的化学结构式如下所示：

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

序列表

<110> 北京中医药大学

<120> 酶法合成喹嗪酮化合物的方法

<130> YC12019060030-A

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)

<400> 1

atgttacatc aacaatatgc aactgaagca tctgttgccg acgatttttc cagctgtcag 60

attaagcccg acggtcaggc tactgtcttg gccattggaa ctgccaaccc tcctcatgtg 120

atcgagcaga gcgcattccc agatttctac ttcaacgtta cgaattgcag cggaaagagc 180

gagcttaaga agaagtttca gcgtctttgt gacagatcag gcgtcaagag gaggcatgtg 240

ttcctcacag aagaaattct caaggcaaat ccatccatgt gtacctacat ggcgtcatct 300

ctgaacgtta gacaggagat agcaaactta gaagttccca aactcgccaa agaagctgca 360

ttaaaggcca tcgaggaatg gggtcagccc aagtccaaaa tcacacacct cgtcttcgca 420

acatccaacg gcaatgccat gcctggagca gattttaagc tcgtcaagct tttgggactt 480

cggccagacg tgaaaagagt gatgctatac cagcagggat gttttgctgg agcatctgtg 540

actcgcatcg gcaaagatct ggcggaaaac aataagggag ctcgtgtttt ggcggtttgc 600

agtgaaatca cagctttcac atttcaagct cccagcgaca cccatttccc aaatctcata 660

aattctgctt tatttggcga tggtgctgcc gcactgatcc ttggatcgca tcctattcca 720

gggttagaga agccaatctt tgaaattcac tgggccggac aaactatagt tcctgatagc 780

gatgatgctg tggcgggtcg attaactgaa gctgggatgg tattcttact gatgaagggt 840

ctatcacaac tgatttcagc taacattgag acgatcctct cggaggcatt gcggaaagca 900

ggctcgccgg gctacaaaga catattttgg gctgttcatc cgggagggct ggccatcatc 960

gatgcattgg agcggaagct caaactgaca gcagacaaga tggcatcggc gcgagaaatt 1020

ctagctgcat acggaaacat gtcaagccct tctgtgctat ttgtcctaga tcaacttcgc 1080

aagaaatcac aaaatatgaa gttttctacc actggagaag gctgcgaatg gggtgtgatg 1140

atgggatttg ggccgggctt cactttggaa gttcttgtgc tgaaaagtat cctcctccac 1200

gaattaactt ccactgataa tcgttacctt gaatcctcat ag 1242

<210> 2

<211> 1737

<212> DNA

<213> 产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum MT-12)

<400> 2

atggtttttt tacctccaaa ggagtccggt gcattggacc caatgcccga caatatcccg 60

atcagcgagt ttatgctcaa tgagagatat ggacgagtgc gacacgccag ctcccgggac 120

ccatatacct gtggtattac cgggaagtcc tactcgtcgc aagaggtagc caatcgcgtc 180

gactcgctgg ctcgtagtct ttcaaaggaa tttggttggg cgccgaatga agggtcagaa 240

tgggataaga cattggccgt ttttgccctc aacactgtcg attccttgcc cctattctgg 300

gctgttcaca gactgggcgg tgttctcact cccgccaacg catcatactc cgccgccgag 360

ctgacgcatc agctgcttga ttccaaggcc aaggcccttg tgacttgtgt tcctctcctc 420

tccatctcac tggaagctgc agccaaagct ggtctcccga agaacagaat ctacttactc 480

gatgtacctg agcagcttct tggcggaatc aagcctccag caggatacaa gtccgtttcc 540

gaactgaccg aggctggaaa gtctctaccg ccagtggatg aattgcgatg gagcgcgggt 600

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