阅读说明：本技术 一种海洋真菌来源的penialidins类化合物、制备方法及其应用 (Penialidins compound derived from marine fungi, preparation method and application thereof ) 是由 陈敏 梁朝阳 沈南星 王长云 于 2018-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种海洋真菌来源的penialidins类化合物、制备方法及其应用,所述penialidins类化合物结构如式I所示：<Image he="360" wi="583" file="DDA0001818945700000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>其中R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>各自独立地选自H、任选取代烷基、酰基,“---”表示单键或不存在,且当“---”表示单键时,OR<Sub>3</Sub>不存在。本发明对海洋真菌Penicillium limosum HK1-23,进行大规模发酵,任选进行衍生化可大量获得penialidins类化合物或其药学上可接受的盐,其中penialidin A、penialidin C的发酵产量在260mg/L以上,可为penialidins类化合物药理活性的研究提供丰富的化合物。(The invention relates to a pentalidins compound from marine fungi, a preparation method and application thereof, wherein the structure of the pentalidins compound is shown as a formula I: wherein R is 1 、R 2 、R 3 Each independently selected from H, optionally substituted alkyl, acyl, "- - -" represents a single bond OR is absent, and OR when "- -" represents a single bond 3 Is absent. The invention is used for marine fungus PenicilThe lium limosum HK1-23 is subjected to large-scale fermentation, and a large amount of penilidins or pharmaceutically acceptable salts thereof can be obtained by optionally performing derivatization, wherein the fermentation yield of penilidins A and C is over 260mg/L, and abundant compounds can be provided for research on pharmacological activity of the penilidins.)

一种海洋真菌来源的penialidins类化合物、制备方法及其 应用

技术领域

本发明属于海洋真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种海洋真菌来源的penialidins类化合物、制备方法及其应用。

背景技术

Penialidins A-C是由Michael Spiteller等首次报道的一种聚酮类抗菌活性化合物(Fitoterapia，2014(98)，209–214)。目前尚未有关于Penialidins A-C类化合物的化学合成或大规模发酵制备的报道。本发明提供一种利用海洋真菌Penicillium limosumHK1-23大规模制备Penialidins A和C的方法，并对penialidins类化合物进行了生物活性测试。

发明内容

本发明所述海洋真菌Penicillium limosum HK1-23的菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年2月5日；保藏编号：CGMCCNo.15361；分类命名：Penicillium limosum。

本发明提供一种由海洋真菌Penicillium limosum HK1-23制备penialidin A、penialidin C混合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)先在菌种培养基中对海洋真菌Penicillium limosum HK1-23进行菌种培养；

(2)再在发酵培养基中对步骤(1)中的海洋真菌Penicillium limosum HK1-23进行发酵培养；

(3)将步骤(2)发酵培养后得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用有机溶剂A萃取2～4次，合并萃取液后减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用有机溶剂B浸提2～4次，合并浸提液后减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，经色谱分离得粗品；

(4)步骤(3)得到的粗品用有机溶剂A稀释后，用碳酸氢钠溶液萃取2～4次后，合并碳酸氢钠溶液(无机层)后，加浓盐酸调pH至1-3，析出黄色沉淀，经过滤、洗涤、干燥后即得penialidin A、penialidin C的混合物。

其中所述菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水，发酵培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、粗海盐、水。

本发明上述制备方法中，所述的有机溶剂A优选乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或***中的一种或几种；所述的有机溶剂B优选甲醇、乙醇、THF或丙酮中的一种或几种；所述的色谱分离优选减压柱色谱分离，减压柱色谱的填料优选正相硅胶或大孔树脂。

本发明上述制备方法中菌种培养基优选含有葡萄糖0.2％–5.0％、酵母膏0.02％–2％、蛋白胨0.02％–2％、琼脂0.2％–3.0％、粗海盐0.05％–5％，适量的水；上述百分比均为重量百分比；培养温度优选为15–25℃；培养时间优选为3–7天。发酵培养基优选含有葡萄糖0.2％–5.0％、酵母膏0.02％–2％、蛋白胨0.02％–2％、粗海盐0.05％–5％，适量的水；上述百分比均为重量百分比；培养温度优选为15–25℃；培养时间优选为4–5周；所述的减压柱色谱分离中采用的流动相为本领域常规洗脱剂，优选乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、水或氯仿中的一种或几种混合。

本发明的另一实施方案提供一种制备penialidin A和penialidin C纯品的方法，其特征在于包括如下步骤：

取上述制备方法步骤(4)得到的penialidin A、penialidin C的混合物经正相硅胶柱层析，得penialidin C和penialidin A。

所述正相硅胶柱层析采用的固定相为200-300目硅胶，流动相为二氯甲烷/甲醇体积比为20/1-10/1的混合溶剂或者石油醚/乙酸乙酯体积比为1.5/1-1/1.5的混合溶剂。流动相中任选加入适量的有机酸或有机碱，有机酸选自甲酸或乙酸，有机碱选自三乙胺。

本发明的另一实施方案提供所述海洋真菌Penicillium limosum HK1-23在制备penialidins类化合物或其药学上可接受的盐中的应用；尤其是在制备penialidin A、penialidin C或者其混合物或其药学上可接受的盐中的应用。

本发明所述的penialidins类化合物指的是与penialidin A、penialidin C骨架相同，区别仅在于个别取代基不同的化合物，结构如式I所示下：

其中R₁、R₂、R₃各自独立地选自H、任选取代烷基(例如甲基、乙基、苄基)、酰基(例如乙酰基、苯甲酰基)，“---”表示单键或不存在，且当“---”表示单键时，OR₃不存在；当“---”不存在时，R₃选自H、任选取代烷基(例如甲基、乙基、苄基)、酰基(例如乙酰基、苯甲酰基)。优选penialidins A、C、E-J化合物。

本发明的另一实施方案提供上述式I结构的penialidins类化合物或其药学上可接受的盐在制备降血糖先导化合物、候选药物及药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述式I结构的penialidins类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗由葡萄糖激酶介导的疾病的药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述式I结构的penialidins类化合物或其药学上可接受的盐在防治烟草赤星病方面的应用。

本发明的另一实施方案提供上述式I结构的penialidins类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗烟草赤星病菌药物中的应用。

本发明所述的海洋真菌Penicillium limosum HK1-23，分离自海口东寨港红树林保护区海桑根际土壤。

本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。

本发明给出了penialidin A、penialidin C或者其混合物的制备实施例，同时给出了penialidin A、penialidin C甲基化、乙酰化的制备例，其它penialidins类化合物或其药学上可接受的盐，可通过本领域常规的化学衍生化方法或盐的制备方法由penialidinA、penialidin C或其衍生物进行制备得到，这属于本领域的常规技术手段。

本发明的优点在于本发明中采用的海洋真菌Penicillium limosum HK1-23，可通过人工进行大规模发酵，不受资源限制，通过采用上述培养基及培养条件进行发酵，任选进行衍生化可大量获得penialidins类化合物或其药学上可接受的盐，penialidin A、penialidin C的发酵产量在260mg/L以上，可为penialidins类化合物药理活性的研究提供丰富的化合物。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是penialidin A的¹H NMR图；

图2是penialidin C的¹H NMR图；

图3是penialidin C的¹³C NMR图。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1

(1)海洋真菌Penicillium limosum HK1-23菌种的培养

真菌Penicillium limosum HK1-23的菌种培养所用的培养基为每1000mL水中加入：马铃薯200g煮沸取汁，葡萄糖20g，粗海盐30g，琼脂15g；使用时倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板。真菌菌株接种于培养基平板中，在25℃下摇床培养3天。

(2)海洋真菌Penicillium limosum HK1-23的发酵

真菌Penicillium limosum HK1-23的发酵培养所用的发酵培养基为每1000mL水中加入：马铃薯200g煮沸取汁，葡萄糖20g，粗海盐30g；使用时分装于锥形瓶中。真菌菌株接种于锥形瓶的培养基中，于20～25℃静置培养28天。

(3)粗品的制备

取步骤(2)所得的发酵物10L，将发酵液和菌体分离后，发酵液用乙酸乙酯萃取2～4次，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用甲醇浸提2～4次，减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，先进行减压正相硅胶柱色谱分离，固定相：100～200目硅胶，流动相依次采用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇分别洗脱5-6个柱体积，合并洗脱剂浓缩得粗品(11.8g)。

(4)penialidin A、penialidin C混合物的制备

取步骤(3)得到的粗品(11.8g)用二氯甲烷(500mL)稀释后，用质量分数为5％的碳酸氢钠溶液萃取3次(300mL×3)后，合并碳酸氢钠溶液(无机层)后，加浓盐酸调pH至1-3，析出黄色沉淀，过滤、沉淀水洗、甲醇洗、干燥后即得penialidin A、penialidin C的混合物(2.85g)。

实施例2

(1)海洋真菌Penicillium limosum HK1-23菌种的培养

真菌Penicillium limosum HK1-23的菌种培养所用的培养基中含有葡萄糖0.2％(重量百分比，下同)、酵母膏2％、蛋白胨0.02％、琼脂0.2％、粗海盐5％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在25℃下培养7天。

(2)海洋真菌Penicillium limosum HK1-23的发酵

真菌Penicillium limosum HK1-23的发酵培养所用的发酵培养基为含有葡萄糖0.2％(重量百分比，下同)、酵母膏0.02％、蛋白胨2％、粗海盐0.05％，适量的水，真菌菌株于15℃发酵培养35天。

(3)粗品的制备

取步骤(2)所得的发酵物30L，将发酵液和菌体分离后，发酵液用***萃取4次，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用乙醇浸提2次，减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，先进行减压大孔树脂柱色谱分离，流动相为采用体积分数为60-70％的乙醇溶液，洗脱25个柱体积，合并洗脱剂浓缩得粗品(35.6g)。

(4)penialidin A、penialidin C混合物的制备

取步骤(3)得到的粗品(35.6g)用乙酸乙酯(2L)稀释后，用饱和碳酸氢钠溶液萃取4次(1.0L×4)后，合并碳酸氢钠溶液(无机层)后，加浓盐酸调pH至1-2，析出黄色沉淀，过滤、沉淀水洗、甲醇洗、干燥后即得penialidin A、penialidin C的混合物(8.92g)。

实施例3

(1)海洋真菌Penicillium limosum HK1-23菌种的培养

真菌Penicillium limosum HK1-23的菌种培养所用的培养基中含有葡萄糖5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.02％、蛋白胨2％、琼脂3％、粗海盐1％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在20℃下培养4天。

(2)海洋真菌Penicillium limosum HK1-23的发酵

真菌Penicillium limosum HK1-23的发酵培养所用的发酵培养基为含有葡萄糖5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.02％、蛋白胨2％、粗海盐5％，其余为水，真菌菌株于20℃培养30天。

(3)粗品的制备

取步骤(2)所得的发酵物50L，将发酵液和菌体分离后，发酵液用二氯甲烷萃取2次，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用丙酮浸提2次，减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，先进行减压正相硅胶柱色谱分离，固定相：200～300目硅胶，流动相依次采用氯仿、乙酸乙酯、甲醇分别洗脱5-6个柱体积，合并洗脱剂浓缩得粗品(56.8g)。

(4)penialidin A、penialidin C混合物的制备

取步骤(3)得到的粗品(56.8g)用氯仿(5L)稀释后，用质量分数为6％碳酸氢钠溶液萃取2次(5.0L×2)后，合并碳酸氢钠溶液(无机层)后，加浓盐酸调pH至2-3，析出黄色沉淀，过滤、沉淀水洗、乙醇洗、干燥后即得penialidin A、penialidin C的混合物(14.13g)。

HPLC显示实施例1-3制备的penialidin A、penialidin C混合物中penialidin A、penialidin C的总含量均在92％以上，penialidin A与penialidin C的比例约为4：3。

实施例4 Penialidin A、penialidin C纯品的制备

取实施例1制备的penialidin A、penialidin C混合物(1.5g)经正相硅胶柱层析(固定相为200-300目硅胶，流动相为二氯甲烷/甲醇体积比为20/1-10/1的混合溶剂)，得penialidin C(611mg)和penialidin A(820mg)。

penialidin C的¹H NMR(600Hz,DMSO-d₆)、¹³C NMR(150Hz,DMSO-d₆)及penialidinA的¹H NMR(600Hz,DMSO-d₆)与文献报道一致，详见下表及说明书附图，高分辨质谱HRESIMS也与文献报道一致。

实施例5 Penialidin A、penialidin C纯品的制备

取实施例2制备的penialidin A、penialidin C混合物(2.2g)经正相硅胶柱层析(固定相为200-300目硅胶，流动相为石油醚/乙酸乙酯体积比为1.5/1-1/1.5的混合溶剂含0.1％体积分数的三乙胺)，得penialidin C(901mg)和penialidin A(1.18g)。

实施例6 Penialidin A、penialidin C纯品的制备

取实施例3制备的penialidin A、penialidin C混合物(3.0g)经正相硅胶柱层析(固定相为200-300目硅胶，流动相为二氯甲烷/甲醇体积比为20/1-10/1的混合溶剂含0.1％体积分数的甲酸)，得penialidin C(1.15g)和penialidin A(1.68g)。

实施例7

将penialidin A(100mg)加入THF(5mL)中，加入碳酸钠(100mg)、碘甲烷(300μL)，室温下搅拌3小时后，TLC检测原料消失，反应液浓缩后，经正相硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇体积比为30/1-15/1的混合溶剂)，得penialidin E(黄色固体20mg，NMR和MS数据与文献一致)、penialidin G(黄色固体，14mg，ESI-MS[M+H]⁺数据与理论值相同，NMR数据显示其为12-单甲基化penialidin A)、penialidin F(黄色固体，41mg，ESI-MS[M+H]⁺数据与理论值相同，NMR数据显示其为11,12-双甲基化penialidin A)；

结构如下：

实施例8

将penialidin C(200mg)加入CH₂Cl₂(10mL)中，加入三乙胺(1.5mL)、醋酐(0.5mL)、催化量的DMAP，室温下搅拌5小时后，TLC检测原料消失，反应液浓缩后，经正相硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇体积比为30/1-15/1的混合溶剂)，得penialidin H(黄色固体48mg，ESI-MS[M+H]⁺数据与理论值相同，NMR数据显示其为11-单乙酰化penialidin C)、penialidin I(黄色固体，80mg，ESI-MS[M+H]⁺数据与理论值相同，NMR数据显示其为11,12-双乙酰化penialidin C)、penialidin J(黄色固体，29mg，ESI-MS[M+H]⁺数据与理论值相同，NMR数据显示其为12-单乙酰化penialidin C)；

结构如下：

实施例9

按照专利CN102482267A(WO2011/013141)中记载的方法，测试本发明penialidins类化合物(penialidins A、C、E-J)的葡萄糖激酶(GK)活化效力及EC₅₀，结果显示，在1μM浓度下，penialidins A、C、E-J化合物在DMSO中的GK活性均在273％以上，其EC₅₀均小于0.1μM。

实施例10

按照文献“Journal of Ethnopharmacology 74(2001)89–96”中介绍的带毒培养基抗真菌活性测试方法，测试本发明penialidins类化合物(penialidins A、C、E-J)对烟草赤星病菌的抑制率。结果表明，penialidins类化合物浓度为5-50μg·mL^-1时，对烟草赤星病菌的抑制率为45.7％-56.8％。

参考文献：

1.Fitoterapia 98(2014)209–214。

2.Natural Product Research,32:3,282-286。

3.Journal of Ethnopharmacology 74(2001)89–96。