用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法

文档序号：1320936 发布日期：2020-07-14 浏览：6次 >En<

阅读说明：本技术 用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法 (Kit and detection method for early detection of cancer ) 是由朱桂春于垚垚姚鲁帅盛青松于 2020-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法,该试剂盒包括：检测PRKY、HOXD3b、HOXA7或者GSTP1基因位点的DNA甲基化水平的引物探针组合物,DNA聚合酶及反应体系。通过发明,能够通过对PRKY、HOXD3b、HOXA7或者GSTP1基因目标位点的DNA甲基化水平予以快速、高特异性检测,具有灵敏度高,特异性强,操作简便快捷等优点,可为临床医生对前列腺癌、肾癌或者膀胱癌早期诊断及鉴别诊断提供重要参考。(The invention provides a kit and a detection method for early detection of cancer, wherein the kit comprises: a primer probe composition for detecting the DNA methylation level of PRKY, HOXD3b, HOXA7 or GSTP1 gene locus, DNA polymerase and a reaction system. By the invention, the DNA methylation level of the PRKY, HOXD3b, HOXA7 or GSTP1 gene target site can be detected quickly and with high specificity, the kit has the advantages of high sensitivity, strong specificity, simplicity and quickness in operation and the like, and can provide important reference for early diagnosis and differential diagnosis of prostate cancer, kidney cancer or bladder cancer for clinicians.)

用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

前列腺癌是世界范围内高发和主要的致死癌症之一。

肿瘤的早期诊断早期治疗非常重要，是治疗后生存率的关键决定因素。早期肿瘤由于肿瘤细胞负荷小，其特征性分子的改变往往不明显，难以与慢性疾病分辨。但一般来说分子改变早于临床影像学改变，分子检测依然是肿瘤早期诊断及鉴别诊断的最重要最有希望的手段。

申请人经过检索后发现，公开号为CN109182518A的中国发明专利公开了一种基于焦磷酸测序技术的GSTP1基因启动子甲基化测序方法。本发明的目标基因甲基化位点与CN109182518A不同，权利要求覆盖也几乎没有相同点。临床检测对检测性能参数是有相当要求的，一个科研可以用的检测方法往往不一定能应用到临床检测，需要进行大量的优化及临床样品验证。本发明的重点是该组合基因或单个基因特异性的甲基化位点甲基化水平的检测在临床上的应用价值而不是焦磷酸测序方法学本身。

发明内容

本发明的目的在于揭示用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法，实现对前列腺癌、肾癌或者膀胱癌的早期筛查与诊断。

为实现上述第一个发明目的，本发明提供了一种用于癌症早期检测的试剂盒，包括：

检测PRKY、HOXD3b、HOXA7或者GSTP1基因位点的DNA甲基化水平的引物探针组合物，DNA聚合酶及反应体系。

作为本发明的进一步改进，所述引物探针组合物包括：

用于检测PRKY基因位点的DNA甲基化水平且核苷酸序列为SEQ NO.1 至SEQ NO.3的引物探针组合物；

用于检测HOXD3b基因位点的DNA甲基化水平且核苷酸序列为SEQ NO.4至SEQ NO.6的引物探针组合物；

用于检测HOXA7基因位点的DNA甲基化水平且核苷酸序列为SEQ NO.7至SEQ NO.9的引物探针组合物；

用于检测GSTP1基因位点的DNA甲基化水平且核苷酸序列为SEQ NO.10至SEQNO.12的引物探针组合物；

用于检测内参基因beta-actin且核苷酸序列为SEQ NO.13至SEQ NO.15 的引物探针组合物。

作为本发明的进一步改进，甲基化目标检测基因可以按不同组合使用。

作为本发明的进一步改进，甲基化目标检测基因可以单独使用。

作为本发明的进一步改进，目标检测基因的甲基化区域保持不变，但扩增引物及/或探针序列部分或全部改变。

作为本发明的进一步改进，试剂盒的检测结果对癌症的早期诊断及鉴别诊断提供参考。

作为本发明的进一步改进，所述癌症为前列腺癌、肾癌或者膀胱癌。

同时，本申请还揭示了基于上述任一发明创造所揭示的用于癌症早期检测的试剂盒的检测方法，使用检测系统对检测材料进行检测。

作为本发明的进一步改进，所述检测材料是人外周血游离DNA或分离的循环肿瘤细胞。

作为本发明的进一步改进，所述检测材料是人尿液或前列腺按摩后尿液或前列腺按摩液细胞沉渣或活检组织提取的DNA。

作为本发明的进一步改进，目标检测基因的甲基化区域保持不变，但扩增引物及/或探针序列部分或全部改变。

作为本发明的进一步改进，检测结果对癌症的早期诊断及鉴别诊断提供参考。

作为本发明的进一步改进，所述癌症为前列腺癌、肾癌或者膀胱癌。

作为本发明的进一步改进，所述检测系统包括：qPCR检测法，焦磷酸测序检测法，芯片检测法，质谱法检测法或者高通量测序检测法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

通过发明，能够通过对PRKY、HOXD3b、HOXA7或者GSTP1中的一种或者几种基因位点的DNA甲基化水平予以快速、高特异性检测，具有灵敏度高，特异性强，操作简便快捷等优点，可为临床医生对前列腺癌、肾癌或者膀胱癌的早期诊断及鉴别诊断提供重要的医学参考。

附图说明

图1为通过本发明所揭示的基于癌症早期检测试剂盒的检测方法针对 PRKY基因位点的DNA甲基化水平进行检测的扩增曲线；

图2为通过本发明所揭示的基于癌症早期检测试剂盒的检测方法针对 HOXD3b基因位点的DNA甲基化水平进行检测的扩增曲线；

图3为通过本发明所揭示的基于癌症早期检测试剂盒的检测方法针对HOXA7基因位点的DNA甲基化水平进行检测的扩增曲线；

图4为通过本发明所揭示的基于癌症早期检测试剂盒的检测方法针对 GSTP1基因位点的DNA甲基化水平进行检测的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。在本申请中，术语“sec”是时间单位：秒；术语“min”是时间单位：分钟。术语“mM”是浓度单位：毫摩尔每升。

实施例一：

一种用于癌症早期检测的试剂盒(以下简称“试剂盒”)，包括：检测 PRKY、HOXD3b，HOXA7或者GSTP1中的一种或者几种基因位点的DNA 甲基化水平的引物探针组合物、DNA聚合酶及反应体系。该试剂盒用于对上述一种或者几种基因位点的DNA甲基化水平的特异性检测，且通过该试剂盒对前列腺癌、肾癌或者膀胱癌予以早期诊断。DNA聚合酶为Taq酶，反应体系由PCR缓冲液、dNTPs和MgCl₂组成。

内参基因beta-actin作为持家基因(Home-keeping Gene，HKG)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。从而为PRKY，HOXD3b，HOXA7，GSTP1基因位点的DNA甲基化水平进行检测，以对上述一种或者几种目标基因位点的DNA甲基化进行基因检测提供准确的参考依据。具体分析时对目标基因扩增Ct值与样本actin 扩增Ct值得的比值进行比较分析。

在本实施例中，特异性探针的3’端标均记有荧光淬灭基团，特异性探针的5’端均标记有荧光报告基团；其中，荧光淬灭基团选自DABCYL、 MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX 或TAMRA中的任意一种。不同基因组合使用时使用不同的荧光基团。

本发明所揭示的引物探针组合物的序列设计如下表1所示表1.引物及探针序列

E:荧光基团，Q:淬灭基团。

实施例二：

结合图1至图4所示，本实施例揭示了一种基于癌症早期检测试剂盒的检测方法(以下简称“检测方法”)，包括以下步骤(1)至步骤(4)。该检测方法基于实施例一所揭示的试剂盒予以实现。

步骤(1)提取生物检材样本。该生物检材样本选择人外周血或者人尿液细胞沉渣。具体的，使用STRECK管采集早期前列腺癌确诊病人(初诊，且前列腺癌未发生转移)外周血10ml，混匀后送检；同时，采集正常人的前列腺良性增生病人的外周血作为对照组。

步骤(2)自生物检材样本中提取样本DNA，调整样本DNA至标准纯度与标准浓度。提取样本DNA可采用QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒提取ctDNA(Cell-freetumor DNA)。

步骤(3)对样本DNA使用亚硫酸氢盐进行转化。对样本DNA在目标基因位点的DNA甲基化变化水平进行固定。具体的，在步骤(3)中可以用 Qiagen快速亚硫酸氢盐转化试剂盒对样本DNA进行转化。转化前ctDNA量不少于10ng。

步骤(4)对目标基因及内参基因使用检测系统进行甲基化水平检测。检测系统包括：qPCR检测系统、焦磷酸测序检测系统、芯片检测系统、质谱法检测系统或者高通量检测系统。前列腺癌、肾癌或者膀胱癌。在本实施例中，申请人以检测系统选用qPCR检测系统为范例予以范例性说明，本领域普通技术人员可知，焦磷酸测序检测系统、芯片检测系统等相同或者相似的检测系统也可对通过实施例一所揭示的试剂盒对PRKY，HOXD3b， HOXA7或者GSTP1的基因位点的DNA甲基化水平进行特异性检测，以对前列腺癌、肾癌或者膀胱癌进行早期筛查与诊断。qPCR检测系统选用型号为ABI7500的qPCR扩增仪。

qPCR扩增体系如下表2所示：

表2.检测体系范例

试剂	使用量(μl)
		10×缓冲液	2
dNTP(10mM)	1
		Mgcl<sub>2</sub>(50mM)	1.6
Taq聚合酶(10U/ul)	0.2
		引物探针组合物	各0.4
ddH<sub>2</sub>O	补足
		转化后DNA模板	5
总体积	20

具体的，在本实施中，使用qPCR检测系统所执行的扩增反应的反应程序为：

步骤(5)分析目标基因及内参基因的甲基化水平表达。

如图1所示，从早期前列腺癌确诊病人提取的前列腺癌患者血液cfDNA 的检测样本(即前述样本DNA)在对PRKY基因位点使用qPCR检测系统时，样本DNA的Ct值约为19，且对照组无典型的扩增曲线。

如图2所示，从早期前列腺癌确诊病人提取的前列腺癌患者血液cfDNA 的检测样本(即前述样本DNA)在对HOXD3b基因位点使用qPCR检测系统时，样本DNA的Ct值约为18，且对照组无典型的扩增曲线。

如图3所示，从早期前列腺癌确诊病人提取的前列腺癌患者血液cfDNA 的检测样本(即前述样本DNA)在对HOXDA7基因位点使用qPCR检测系统时，样本DNA的Ct值约为18，且对照组无典型的扩增曲线。

如图4所示，从早期前列腺癌确诊病人提取的前列腺癌患者血液cfDNA 的检测样本(即前述样本DNA)在对GSTP1基因位点使用qPCR检测系统时，样本DNA的Ct值约为18，且对照组无典型的扩增曲线。

在本实施例中，在qPCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端(即3’端与5’端)分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与qPCR产物形成完全同步。

本实施例所揭示的检测方法使用实施例一所揭示的试剂盒进行qPCR扩增。利用特异性荧光标记的探针对扩增产物进行实时荧光定量PCR检测，能有效地对PRKY，HOXD3b，HOXA7或者GSTP1中的一种或者几种基因位点的DNA甲基化水平进行检测，具有稳定、快速和特异性高的特点，且检测成本低等诸多优点。

实施例三：

本实施例揭示了一种癌症早期检测方法，通过检测PRKY，HOXD3b， HOXA7或者GSTP1中的一种或者几种基因位点的DNA甲基化水平予以检测。癌症为前列腺癌、肾癌或者膀胱癌。本实施例所揭示的癌症早期检测方法可使用实施例一所揭示的试剂盒，并采用实施例二所揭示的基于癌症早期检测试剂盒的检测方法予以检测，以前列腺癌、肾癌或者膀胱癌予以早期筛查与特异性检测。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 无锡市申瑞生物制品有限公司

<120> 用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 16

<211> 25

<212> DNA