阅读说明：本技术 一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法 (Bionic metabolism method of main active ingredients in hawthorn ) 是由 曹君 王秋燕 胡雨涵 杨娟 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然药物仿生代谢技术领域,为解决传统天然药物仿生代谢方法反应复杂,检测灵敏度低的问题,提供了一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法,包括以下步骤：(1)配制标准品溶液,与GSH溶液混合,注入质谱中进行分析表征其代谢产物；(2)将大鼠肝微粒体蛋白和山楂类标准品溶解在磷酸盐缓冲溶液中,加入氯化镁和β-NADP进行孵育,孵育完成后加入乙腈,离心,取上清液通过LC-MS分析表征其代谢产物；(3)将代谢产物进行比较。本发明将在线电化学与质谱技术巧妙结合起来,以及与肝微粒体体外孵育代谢相比较,能便捷高效地模拟出山楂中的主要活性成分的代谢产物。(The invention relates to the technical field of natural medicine bionic metabolism, and provides a bionic metabolism method of main active ingredients in hawthorn, aiming at solving the problems of complex reaction and low detection sensitivity of the traditional natural medicine bionic metabolism method, which comprises the following steps of (1) preparing a standard solution, mixing the standard solution with a GSH solution, injecting the mixture into a mass spectrum to analyze and characterize metabolites of the standard solution, (2) dissolving rat liver microsome protein and hawthorn standard products into a phosphate buffer solution, adding magnesium chloride and β -NADP to incubate, adding acetonitrile after incubation is finished, centrifuging, taking supernate to analyze and characterize metabolites of the standards through L C-MS, and (3) comparing the metabolites.)

一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法

技术领域

本发明涉及天然药物仿生代谢技术领域，尤其涉及一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法。

背景技术

山楂是蔷薇科山楂属药用植物的常见名称，因其有益的健康效应和低毒性，在中国，欧洲和北美洲等地被广泛用于药用和食品原料。最近的研究表明，山楂具有多种生物活性，如抗氧化活性，抗发炎，抗高血压，抗心律失常和降血脂等作用。山楂提取物中含有大量的生物活性物质:甾醇，三萜类，类黄酮，原花色素，有机酸等，其中黄酮类化合物是最重要，最有效的成分之一，是决定山楂质量的主要成分。黄酮类化合物，主要由金丝桃苷，槲皮素，槲皮苷，异槲皮苷，芦丁，牡荆素，异牡荆素和表儿茶素等组成。据报道，黄酮类化合物的消耗与冠心病死亡率呈负相关。黄酮类化合物的这些生理学益处通常被认为是由于它们的抗氧化和自由基清除特性。因其独特的医学效益，山楂和山楂衍生的工业副产品被广泛用于治疗慢性心力衰竭和各种消化系统疾病，改善冠状动脉血流，降低血浆胆固醇和甘油三酯滞等。虽然已经基本报道了山楂黄酮的药理作用，但它们的体内代谢机制尚未明确定义。

代谢调查对于预测和理解山楂活性物质的代谢稳定性以及所产生的代谢物与人体之间可能的相互作用至关重要。代谢通常可分为两个不同的阶段。I相反应主要是氧化反应，由来自细胞色素P450家族的酶在肝脏中催化所产生的代谢物直接由肾脏或胆汁排泄，或者它可以经历II相代谢步骤，其中小而亲水生物分子，如谷胱甘肽(GSH)，与I相代谢产物偶联。GSH是动物细胞中存在的主要低分子量硫醇，在解毒中起着重要作用，是研究蛋白质反应性的常用替代物。这些研究通常使用实验室动物体内代谢或基于体外代谢模型进行。代谢研究中的典型体外方法包括使用重组表达的细胞色素P450酶，匀浆或来自人或动物肝脏，肝切片和人肝细胞的微粒体研究。肝细胞具有高水平的细胞色素P450活性，而肝脏是参与各种内源性化合物和药物生物转化的主要器官。因此，由于微粒体代谢模型应用操作简单、价格合理、储存简单方便，被广泛用于药物代谢研究初期的高通量筛选。然而，由于该体系中含有大量的脂类物质和其它蛋白质,容易降低药物在体系中的游离浓度，从而使实验结果出现偏差。近年来，人们对可以提供可能代谢物可靠信息的新方法越来越感兴趣。

Hambitzer和Heitbaum开发一种用于模拟氧化代谢反应的新的纯工具方法。他们构建了用于电化学(EC)氧化N，N-二甲基苯胺的三电极组件并将其连接到热喷射质谱(MS)系统。近年来，EC与MS的在线组合在评估代谢途径的预测方面取得了重大进展。还有研究通过比较EC/LC/MS产生的代谢物与P450系统产生的代谢物，研究了该技术可用于模拟细胞色素P450催化反应的程度。且研究结果表明，通过单电子氧化或氢提取引发的机制进行的N-脱烷基化，S-氧化，P-氧化，醇氧化和脱氢等反应都适用于电化学氧化。在接下来的几年中，报道了许多研究表明EC/MS系统的广泛适用性。有报道详细研究了电化学氧化，活化并且与内源化合物缀合这一方面。还有研究证明在电化学电池中产生的活性代谢物可以与GSH偶联。该系统已成功用于模拟众多化合物的代谢，如双氯芬酸，曲格列酮和四氢西泮。与化学氧化相比，由电化学电池进行的氧化不需要去除试剂，并且电化学流动池可以容易地在线耦合到质谱上，从而实现快速地分析氧化反应，避免亲电子代谢物的化学反应性对实验结果的干扰。

发明内容

本发明为了克服传统天然药物仿生代谢方法反应复杂，检测灵敏度低的问题，提供了一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，该方法简便快捷，对人体无毒、不污染环境，不违反伦理道德，灵敏度高，重现性好。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，包括以下步骤：

(1)称取山楂类标准品配制成标准品溶液，将标准溶液经电化学氧化后与GSH溶液混合，注入质谱中进行分析表征其代谢产物；

(2)将大鼠肝微粒体蛋白和山楂类标准品溶解在磷酸盐缓冲溶液中，加入氯化镁和β-NADP进行孵育，孵育完成后加入乙腈，离心，取上清液通过LC-MS分析表征其代谢产物；

(3)将步骤(1)与步骤(2)中的代谢产物进行比较。

本发明具体提供了一种以谷胱甘肽作为研究蛋白质反应性的常用替代物和电化学联用质谱的技术，用于模拟代谢山楂中的主要活性化合物。具体包括：配置一定浓度的标准溶液，以一定的流速同时注入GSH至质谱中进行分析。所获得的结果与肝微粒体体外孵育的结果进行比较，看是否山楂中活性成分的仿生代谢的结果存在差异。

本发明的要点在于电化学转化与质谱在线耦合对山楂中主要活性成分的模拟仿生代谢研究，充分发挥了电化学转化与质谱在线耦合的优点，用这一组合技术模拟仿生代谢天然产物中的主要有效成分，可以取得前所未有、立竿见影的效果。本发明成功联用在线电化学与质谱应用于研究山楂活性成分的在线监测，并在GSH存在下实现I期和II期代谢物的成功生成和鉴定。所采用的现有技术清楚地证实了模拟的山楂活性成分的几种氧化代谢途径，包括甲基化、乙酰化、葡萄糖醛酸化、脱羧及水解反应。该方法相较于传统的代谢方法简便快捷；对人体无毒、不污染环境；不违反伦理道德。此外，灵敏度大大提高，重现性较好。该系统的简单适用性以及它便捷可重复性使其成为中药代谢研究中的有用工具。本方法应用范围广泛，无论是山楂的活性成分还是其他药材，如丹参均能用本发明方法进行仿生代谢。本发明表明肝微粒体体外孵育与在线电化学与质谱联用方法具有可比较性，而且代谢结果具有较高相似性。

作为优选，步骤(1)中，所述标准品溶液的配制方法如下：在中性介质中，将100μM山楂类标准品溶解于由50％乙腈和50％水组成的20mM甲酸铵缓冲液中，并通过20-22％LC-MS级氨水调节pH至7.4，摇匀；通过0.22μm滤膜过滤，并转移至注射器中。

作为优选，步骤(1)中，所述GSH溶液的浓度为300μM。

作为优选，步骤(1)中，所述GSH溶液通过T-片以10μL/min的流速加入到电化学流出物中。

作为优选，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为50mM。

作为优选，步骤(2)中，孵育温度为35～37℃，孵育时间控制在60～90min。

作为优选，步骤(2)中，所述大鼠肝微粒体蛋白的浓度为1.3mg/mL。

作为优选，步骤(2)中，所述氯化镁的浓度为0.5mM。

作为优选，步骤(2)中，所述β-NADP的浓度为1.2mM。

作为优选，所述山楂类标准品选自金丝桃苷，异槲皮苷，绿原酸和表儿茶素中的一种。

因此，本发明具有如下有益效果：本发明将在线电化学与质谱技术巧妙结合起来，以及与肝微粒体体外孵育代谢相比较，能便捷高效地模拟出山楂中的主要活性成分的代谢产物。

附图说明

图1为本发明仿生代谢的流程图。

图2为在0.1-1.5V电位范围内金丝桃苷的伏安质量图。

图3为山楂中金丝桃苷的氧化途径图。

图4为在0.1-1.3V电位范围内异槲皮苷的伏安质量图。

图5为山楂中异槲皮苷的氧化途径图。

图6为在0.1-2.3V电位范围内绿原酸的伏安质量图。

图7为山楂中绿原酸的氧化途径图。

图8为在0.1-2.9V电位范围内表儿茶素的伏安质量图。

图9为山楂中表儿茶素的氧化途径图。

图10为金丝桃苷在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。

图11为异槲皮苷在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。

图12为绿原酸在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。

图13为表儿茶素在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明以下实施例参照图1所示的仿生代谢的流程图进行，实施例中的高效液相色谱与质谱联用条件设置如下：

色谱柱：Agilent SB-C₁₈反向色谱柱(1.8μm，2.1mm×100mm i.d.),柱温：30℃，进样量：2.0μL，流速0.4mL/min，流动相：A：0.01％甲酸水，B：甲醇。梯度洗脱：0～2min，30％～50％A；2～3min，50％～80％A；3～4min，80％～100％A；4～9min，100％～100％A；然后再用30％B平衡3min。以负离子模式运行，质量范围设定为m/z 100-1700。毛细管电压,3500V；雾化器气压,45psig；干燥气流速,12L/min；干燥气温度,350℃；鞘气的温度和流速为350℃和11L/min；喷嘴电压1000V；skimmer电压,65V；碰撞能,175V；八级杆RF,750V。

实施例1.金丝桃苷的仿生代谢的影响

(1)样品溶液的制备步骤：

在中性介质中，将100μM金丝桃苷溶解于由50％乙腈和50％水组成的20mM甲酸铵缓冲液中，并通过20-22％LC-MS级氨水调节pH至7.4。摇匀。通过0.22μm滤膜过滤，并转移至注射器中。

(2)谷胱甘肽在线捕获氧化产物步骤：

为了用GSH鉴定可能的加合物，修改了上述设置。电化学和质谱条件保持不变，但是在50％乙腈和50％水组成的20mM甲酸铵缓冲液(pH 7.4)中添加300μM GSH，通过T-片以10μL/min的流速加入到电化学流出物中。

实验结果见图2和图3，图2为在0.1-1.5V电位范围内金丝桃苷的伏安质量图,在0V、0.7V和1.3V的恒定电位下产生的Ⅰ相迷迭香酸质谱图和在0V、0.6V和2.0V的恒定电位下产生的Ⅱ相迷迭香酸质谱图。图3为山楂中金丝桃苷的氧化途径图。

从上述数据可以发现，在700mV的电位下，观察到相对较低强度的两种氧化产物m/z477和m/z 505。在1300mV的施加电压下，观察到m/z 653离子峰。金丝桃苷在m/z 463处被检测为[M-H]^-离子。m/z 477和m/z 505比金丝桃苷m/z 463分别增加了14和42个原子质量单位，推测其可能是金丝桃苷甲基化和乙酰化代谢产物。而m/z 653可能是甲基化的金丝桃苷单葡糖苷酸。

电化学系统对金丝桃苷的代谢研究提供了良好的应用，用于产生活化的氧化产物并进一步诱导基于氧化还原的加合物形成。随后，将I相氧化代谢物与GSH共价缀合，形成预期的II相GSH加合物。从图2可以看出，金丝桃苷可以和GSH之间通过迈克尔加成反应产生m/z 768的加合物。

实施例2.异槲皮苷的仿生代谢的影响

在实施例1的基础上，将标准品金丝桃苷替代为异槲皮苷，其余条件不变。

实验结果见图4和图5，图4为在0.1-1.3V电位范围内异槲皮苷的伏安质量图,在0V、0.6V和1.0V的恒定电位下产生的Ⅰ相异槲皮苷质谱图和在0V、0.4V和1.0V的恒定电位下产生的Ⅱ相异槲皮苷质谱图。图5为山楂中异槲皮苷的氧化途径图。

从上述数据可知，该光谱显示异槲皮苷在m/z＝463处产生强峰，其强度在氧化过程中随电位升高而降低。在600mV时，在m/z 477和m/z 505处出现较小的离子峰，随着电位上升至1V，在m/z＝331处显示相对低丰度离子峰。异槲皮苷及其氧化产物的结构显示在图5中，推测其可能是异槲皮苷甲基化(m/z 477)，异槲皮苷乙酰化(m/z 505)和羟甲基化槲皮素(m/z 331)代谢产物。峰的相对丰度表明异槲皮苷氧化产物的相对不稳定性。

在不同电压下，通过增加相应m/z信号的信号强度来识别所形成的GSH加合物。在图4观察到，添加GSH后，形成若干小峰，包括m/z 635和m/z 768。m/z 635处的峰可能是GSH和羟甲基化槲皮素的GSH加合物，而m/z 768可以解释为异槲皮苷GSH加合物。

实施例3.绿原酸的仿生代谢的影响

在实施例1的基础上，将标准品金丝桃苷替代为绿原酸，其余条件不变。

实验结果见图6和图7，图6为在0.1-2.3V电位范围内绿原酸的伏安质量图,在0V、1.4V和1.9V的恒定电位下产生的Ⅰ相绿原酸质谱图和在0V、1.3V和2.1V的恒定电位下产生的Ⅱ相绿原酸质谱图。图7为山楂中绿原酸的氧化途径图。

从上述数据可知，在负离子模式下检测到绿原酸m/z 353为去质子化[M-H]^-离子。通过质谱峰值变化，检测到4种氧化产物，分别为m/z 179，191，307，366。从精确质量推导出分子式和氧化模式，对形成的代谢物进行初步鉴定，其结构图如图7所示。m/z 179和191，可能是绿原酸水解产物咖啡酸和奎尼酸。而m/z 307和m/z 366在绿原酸的基础上减少46和增加13个原子质量单位，推测其可能是绿原酸脱羧和甲基化产物。

经由高压泵将GSH溶液注入电化学流出物中，在EC/MS中监测绿原酸加合物的形成。很明显，在没有施加电压的情况下，仅观察到m/z 353处的绿原酸及其咖啡酸和奎尼酸代谢物。加压后，检测到m/z 484，497和658，其分别指向咖啡酸，奎尼酸和绿原酸的GSH加合物。

实施例4.表儿茶素的仿生代谢的影响

在实施例1的基础上，将标准品金丝桃苷替代为表儿茶素，其余条件不变。

实验结果见图8和图9，图8为在0.1-2.9V电位范围内表儿茶素的伏安质量图,在0V、1.1V和2.5V的恒定电位下产生的Ⅰ相表儿茶素质谱图和在0V、0.4V和1.1V的恒定电位下产生的Ⅱ相表儿茶素质谱图。图9为山楂中表儿茶素的氧化途径图。

从上述数据可知，电化学电池中表儿茶素的转化在1100mV的电势下开始实现。而在2500mV电压下，出现的相对低丰度的m/z 334。从精确质量推导出的分子式和氧化途径，形成的代谢物如图9所示。在负离子模式下检测到表儿茶素为去质子化的[M-H]^-离子(m/z289)，观察到m/z 303氧化产物的增益为14个质量单位，在这种情况下，表明一甲基化表儿茶素的存在。m/z 334与表儿茶素相差45个质量单位，可能是是羧基化表儿茶素代谢产物。

为了获得关于电化学氧化模式的补充信息，在存在GSH时进行共价键加合。在400mV电位下，观察到m/z 594，这可以解释为表儿茶素与GSH的共价加合物。在1100mV的电位下，m/z 610可能是一甲基化表儿茶素与GSH加合物的结果。

实施例5.肝微粒体体外孵育研究的影响

肝微粒体体外孵育在含有100μM标准品(金丝桃苷、异槲皮苷、绿原酸、表儿茶素)，1.3mg/mL来自SD大鼠的肝微粒体，0.5mM氯化镁，1.2mMβ-NADP的50mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.4)中进行。最终体积为500μL。将混合物在37℃下预热5分钟并通过加入氯化镁和β-NADP引发反应。在37℃下孵育90分钟后，加入500μL的乙腈以终止反应。然后在室温下以13000rpm离心5分钟，并将上清液通过0.22μm滤膜过滤，并储存在-20℃直至分析。

实验结果见图10-13，图10为金丝桃苷在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。图11为异槲皮苷在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。图12为绿原酸在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。图13为表儿茶素在肝微粒体体外孵育产生的一相和二相代谢物的TIC/EIC图。

上述数据表明，肝微粒体结果显示出与纯仪器方法的较高相似性。金丝桃苷体外孵育通过甲基化形成了m/z 477甲基化金丝桃苷代谢物。然后金丝桃苷与GSH发生共轭，形成m/z 768加成产物。异槲皮苷在大鼠肝微粒体模型中主要代谢途径为甲基化，生成m/z331羟甲基化槲皮素和m/z 477一甲基化异槲皮苷。通过GSH加成，检测到异槲皮苷加合物(m/z768)。绿原酸的体外肝微粒体中部分代谢产物与EC/MS结果相同，产生了m/z 191奎尼酸和m/z 367一甲基化绿原酸代谢产物。而与GSH加成中，同时检测到绿原酸原型和奎尼酸的加合物。表儿茶素的孵育样品中筛选出1个原型(m/z 289)和1个甲基化代谢产物(m/z303)。并且表儿茶素与GSH共轭形成加合物m/z 594，其结果与电化学流出物中产生的所有体外代谢物吻合。但是，由于电化学电解池和体内实验中代谢物形成机制的差异，可能导致大鼠肝微粒体和电化学氧化之间的定性和定量差异，这也解释了肝微粒体方法中缺失的部分代谢产物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。