阅读说明：本技术 分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒 (Method for preparing sample for analysis, method for analysis, and kit for preparing sample for analysis ) 是由 西风隆司 于 2019-08-23 设计创作，主要内容包括：提供分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒。本发明的课题在于更准确地进行连接方式特异性的唾液酸的修饰。一种分析用试样的制备方法,其用于进行试样中含有的糖链的分析,该制备方法具备：进行第1反应的步骤,所述第1反应用于在糖链结合有唾液酸的情况下对第1连接方式的唾液酸进行内酯化,并对与第1连接方式不同的第2连接方式的唾液酸进行与内酯化不同的修饰；进行第2反应的步骤,对第1反应中生成的内酯进行开环；以及,再次进行第1反应的步骤。(Provided are a method for preparing an analysis sample, an analysis method, and a kit for preparing an analysis sample. The present invention addresses the problem of more accurately modifying sialic acid specifically for the mode of ligation. A method for preparing a sample for analysis, which is used for analyzing sugar chains contained in the sample, the method comprising: a step of performing a1 st reaction for lactonizing sialic acid in a1 st linkage form when sialic acid is bonded to a sugar chain, and modifying sialic acid in a 2 nd linkage form different from the 1 st linkage form differently from lactonization; a step of carrying out a 2 nd reaction for ring-opening the lactone produced in the 1 st reaction; and, a step of carrying out the reaction 1 again.)

分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试 剂盒

技术领域

本发明涉及分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒。

背景技术

唾液酸是在生物体内大量存在的糖。唾液酸在生物体内包含在与蛋白质结合的糖链中，多存在于糖链的非还原末端。因此，唾液酸由于在这种糖蛋白分子中配置在分子的外侧、可被其他分子直接识别，因此具有重要的作用。

唾液酸与邻接的糖之间的连接方式(linkage type)有时会不同。例如已知人的N-连接型糖链(N型糖链)主要为α2,3-和α2,6-的连接方式，O-连接型糖链(O型糖链)、鞘糖脂在前述连接方式的基础上还有α2,8-和α2,9-的连接方式。根据这种连接方式的区别，唾液酸可以被不同的分子识别、具有不同的作用。此外，已知随着癌变，所表达的糖蛋白中的唾液酸的连接方式会变化，也期待作为癌症的生物标记物来利用。进而，已知糖链修饰对生物药物的效果的影响，在生物药物的质量管理中，唾液酸的连接方式的分析也是重要的。

然而，含有唾液酸的唾液酸糖链的基于质谱法的分析由于唾液酸具有负电荷而难以以正离子模式电离、唾液酸容易分解而并不容易。专利文献1中记载了在非水系的溶剂中对糖链的唾液酸进行酰胺化来稳定化这一点。然而，专利文献1的方法无法将唾液酸的连接方式区别地进行修饰，进而糖链的质量原本不会根据唾液酸的连接方式而改变，因此无法通过质谱分析将连接方式区别并进行分析。

为了将唾液酸的连接方式区别并进行分析，提出了进行连接方式特异性修饰的化学修饰法。这种化学修饰法利用α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸相比更容易通过脱水缩合剂引发分子内脱水的性质，在通过分子内脱水对α2,3-唾液酸进行内酯化的同时使α2,6-唾液酸与醇或胺等亲核试剂反应。由此，根据唾液酸的连接方式而生成不同质量的分子，因此可以通过质谱分析将唾液酸的连接方式区别并进行分析。专利文献2和非专利文献1对游离糖链加入含有异丙胺和脱水缩合剂的溶液，对α2,3-唾液酸进行内酯化，对α2,6-唾液酸进行酰胺化。

现有技术文献

专利文献

[专利文献1]日本特开2013-68594号公报

[专利文献2]日本特许第6135710号公报

非专利文献

[非专利文献1]Nishikaze T,Tsumoto H,Sekiya S,Iwamoto S,Miura Y,TanakaK."Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic AcidDerivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling"AnalyticalChemistry,(美国),ACS Publications,2017年2月21日、Volume 89,Issue 4,pp.2353-2360

发明内容

发明要解决的问题

发明人发现，在进行专利文献2和非专利文献1中记载的方法时，特别是对于O-连接型糖链，反应特异性降低，α2,6-唾液酸的一部分有时会内酯化。

用于解决问题的方案

基于本发明的优选的实施方式的分析用试样的制备方法用于进行试样中含有的糖链的分析，该制备方法具备：进行第1反应的步骤，前述第1反应用于在前述糖链结合有唾液酸的情况下对第1连接方式的唾液酸进行内酯化，并对与前述第1连接方式不同的第2连接方式的唾液酸进行与内酯化不同的修饰；进行第2反应的步骤，对前述第1反应中生成的内酯进行开环；以及，再次进行前述第1反应的步骤。

进一步优选的实施方式中，在前述第2反应中，对前述第2连接方式的唾液酸被内酯化而生成的前述内酯进行开环。

进一步优选的实施方式中，还具备：进行前述第2反应和前述第1反应的操作仅以1次以上的规定次数交替重复进行。

进一步优选的实施方式中，前述第2反应通过使供于前述第1反应后的前述试样与pH为8以上的碱性溶剂接触来进行。

进一步优选的实施方式中，包括前述第1反应和前述第2反应的多次反应中的至少一次反应在前述糖链结合或吸附于固相载体的状态下进行。

进一步优选的实施方式中，前述试样含有O型糖链。

进一步优选的实施方式中，前述修饰为酯化或酰胺化。

进一步优选的实施方式中，对由前述第1反应生成的内酯进行与前述修饰不同的修饰。

进一步优选的实施方式中，前述第1连接方式的唾液酸为α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一种，前述第2连接方式的唾液酸为α2,6-唾液酸。

基于本发明的优选的实施方式的分析方法具备：通过上述分析用试样的制备方法制备分析用试样的步骤；以及，对所制备的前述分析用试样进行分析的步骤。

进一步优选的实施方式中，所制备的前述分析用试样通过质谱分析和色谱中的至少一种进行分析。

基于本发明的优选的实施方式的分析用试样的制备用试剂盒具备pH为8以上的碱性溶剂，在上述分析用试样的制备方法中使用。

发明的效果

根据本发明，能够更准确地进行连接方式特异性的唾液酸的修饰。

附图说明

图1是示出一个实施方式的分析方法的流程的流程图。

图2是示出分别由现有的分析用试样的制备方法(上半部分)和一个实施方式的分析用试样的制备方法(下半部分)得到的分析用试样的质谱。

具体实施方式

以下，参照附图对本发明的具体实施方式进行说明。

图1是示出本实施方式的分析用试样的制备方法的分析方法的流程的流程图。在步骤S1001中，准备含有糖链的试样。

含有糖链的试样没有特别限定，可以含有选自由游离糖链、糖肽和糖蛋白以及糖脂组成的组中的至少一种的分子。本实施方式的分析用试样的制备方法由于适宜在糖链中的唾液酸的连接方式的分析中使用，因此试样中的糖链优选含有N-连接型糖链、O-连接型糖链、糖脂型糖链等有可能在末端具有唾液酸的糖链。发明人发现，在选择性地对α2,6-唾液酸进行酰胺化的现有的连接方式特异性的唾液酸的修饰中，在O-连接型糖链中α2,6-唾液酸有时会内酯化，从而进行本发明。因此，试样中的糖链优选含有具备α2,6-唾液酸的O-连接型糖链。然而，即使是其他糖链，在连接方式特异性的唾液酸的修饰中有可能发生意外的内酯化的情况下，也可以应用本发明并获得同样的效果。

在试样含有游离糖链的情况下，可以使用自糖蛋白、糖肽、糖脂游离的糖链。作为使糖链自糖蛋白、糖肽、糖脂游离的方法，可以采用使用O-糖苷酶、N-糖苷酶、鞘糖脂内切糖苷酶(Endoglycoceramidase)等的酶处理、肼分解、基于碱处理的β脱离等化学游离方法。使O-连接型糖链自糖肽和糖蛋白的肽链等游离的情况下，可适宜使用非还原β脱离法等上述化学游离方法，由于氨基甲酸铵法可抑制由剥离导致的分解，因此更适宜使用。此外，可以利用3AQ(3-氨基喹啉；3-aminoquinoline)、2AA(2-氨基苯甲酸；2-aminobenzoic acid)等适当进行糖链的还原末端的标签化等修饰。在使糖链游离的处理前，可以进行后述的糖肽或糖蛋白的肽链的切断。

试样含有糖肽或糖蛋白的情况下，可以对糖肽或糖蛋白适当进行用于引发二甲酰胺化、胍基化等对氨基进行封闭的反应的处理。由此，可以抑制在与位于主链的末端的氨基、羧基之间发生的分子内脱水缩合等副反应。此外，肽链的氨基酸的残基数多的糖肽或糖蛋白优选通过酶的切断等来将肽链切断而使用。例如制备质谱分析用的试样的情况下，肽链的氨基酸残基数优选为30以下，更优选为20以下，进一步优选为15以下。另一方面，在要求明确糖链所结合的肽的来源的情况下，肽链的氨基酸残基数优选为2以上，更优选为3以上。

作为将糖肽或糖蛋白的肽链切断时的消化酶，可使用胰蛋白酶、Lys-C、精氨酸内肽酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶E等。可以将这些消化酶中的2种以上组合使用。切断肽链时的条件没有特别限定，可采用与所使用的消化酶相应的适当的规程。在该切断前，可以进行试样中的蛋白质和肽的改性处理、烷基化处理。改性处理、烷基化处理的条件没有特别限定。

需要说明的是，上述肽链的切断处理可以在通过本实施方式的分析用试样的制备方法对糖链中含有的唾液酸进行内酯化的任一反应的前后、在使经内酯化的唾液酸稳定化后进行。此外，可以通过化学切断等而非酶切断来将肽链切断。

步骤S1001结束后，进入步骤S1003。

(选择性内酯化反应)

在步骤S1003中，进行如下的反应(选择性内酯化反应)，即，该反应用于使试样与用于进行选择性内酯化的反应溶液(以下称为内酯化反应溶液)接触，在糖链结合有唾液酸的情况下对α2,3-唾液酸进行内酯化，并对α2,6-唾液酸进行与内酯化不同的修饰。选择性内酯化反应除了α2,3-唾液酸以外，还可以适宜地对α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸进行内酯化。

进行用于从选择性内酯化反应后的试样中去除内酯化反应溶液的操作。用于去除内酯化反应溶液的操作可通过离心等自结合于固相载体的糖链分离出内酯化反应溶液并使用洗涤溶液进行洗涤，或者通过离心浓缩使试样干固等，只要使选择性内酯化反应所需的试剂的浓度足够低即可，没有特别限定。

需要说明的是，只要能在后述的步骤S1009后得到以充分的反应特异性进行了选择性内酯化的反应产物，则对于反应溶液的去除何时进行、进行几次，没有特别限定。反应溶液的去除可以在步骤S1003～步骤S1011中的至少一个之后适当进行。

内酯化反应溶液含有脱水缩合剂以及含有醇、胺或它们的盐的亲核试剂。调整这些脱水缩合剂和亲核试剂的种类、浓度，以便根据唾液酸的连接方式选择性地引发脱水反应或亲核反应。

由α2,3-唾液酸的羧基的分子内脱水产生的内酯为六元环，有可能由α2,6-唾液酸的羧基的分子内脱水产生的内酯为七元环。因此，产生比七元环稳定的六元环的α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸相比更容易内酯化。此外，α2,3-唾液酸的羧基与α2,6-唾液酸的羧基相比位于位阻较大的位置，因此与α2,6-唾液酸相比的话，大的分子较不容易与α2,3-唾液酸反应。根据这种由唾液酸的连接方式带来的分子结构的区别，调整脱水缩合剂和亲核试剂的种类、浓度，以便根据唾液酸的连接方式进行不同的修饰。不过，本实施方式的分析用试样的制备方法即使在选择性内酯化反应中意外发生了内酯化，也可以如后所述通过将内酯开环再次进行选择性内酯化反应来提高反应特异性，因此不需要以一次选择性内酯化反应获得完全的反应特异性。

(选择性内酯化反应中的脱水缩合剂)

脱水缩合剂优选含有碳二亚胺。这是由于，如果使用碳二亚胺，则与使用鏻系脱水缩合剂(所谓的BOP试剂)、脲鎓系脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况相比，存在于位阻大的部位的羧基的酰胺化等不易进行。作为碳二亚胺的例子，可列举出：N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺(BEC)、N,N’-二叔丁基碳二亚胺、1,3-二对甲苯酰基碳二亚胺、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺、双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基甲基)碳二亚胺(BDDC)、它们的盐。

(选择性内酯化反应中的添加剂)

为了促进利用脱水缩合剂的脱水缩合且抑制副反应，优选在碳二亚胺的基础上还使用亲核性高的添加剂。作为亲核性高的添加剂，优选使用1-羟基苯并***(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-苯并***(HOAt)、4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)、N-羟基-琥珀酰亚胺(HOSu)、6-氯-1-羟基-苯并***(Cl-HoBt)、N-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)等。

(选择性内酯化反应中的亲核试剂)

作为亲核试剂使用的胺优选含有含2个以上碳原子的伯烷基胺或仲烷基胺。伯烷基胺优选为乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等。仲烷基胺优选为二甲胺、乙基甲胺、二乙胺、丙基甲胺、异丙基甲胺等。从使如α2,3-唾液酸的羧基这样存在于位阻大的部位的羧基不易被酰胺化的角度来看，优选使用异丙胺这种具有支链烷基的胺。在内酯化反应溶液的亲核试剂使用胺的情况下，根据唾液酸的连接方式，对α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基进行酰胺化。

作为亲核试剂使用的醇没有特别限定，例如可以使用甲醇和乙醇等。在内酯化反应溶液的亲核试剂使用醇的情况下，根据唾液酸的连接方式，对α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基进行酯化。

需要说明的是，亲核试剂可以含有上述亲核试剂的盐。

(关于脱水缩合剂和亲核试剂的浓度)

内酯化反应溶液的脱水缩合剂的浓度例如优选为1mM～5M，更优选为10mM～3M。将碳二亚胺与Oaxyma、HOAt或HOBt等亲核性高的添加剂并用的情况下，优选各自的浓度为上述范围。内酯化反应溶液的亲核试剂的浓度优选为0.01～20M，更优选为0.1M～10M。选择性内酯化反应时的反应温度优选为-20℃～100℃左右，更优选为-10℃～50℃。

(进行选择性内酯化反应的相)

选择性内酯化反应反应可以以液相或固相实施。以液相进行反应的情况下，优选在二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等非水系溶剂中进行反应。通过在非水溶剂中进行反应，存在抑制副反应的倾向，在以糖肽、糖蛋白作为试样的情况下是适宜的。液相反应中的各成分的浓度没有特别限定，可以根据脱水缩合剂、胺的种类等而适当确定。

以固相进行选择性内酯化反应的情况下，固相载体只要可以将糖链、糖肽、糖蛋白等固定，则没有特别限定。例如为了将糖肽、糖蛋白固定，可以使用具有环氧基、甲苯磺酰基、羧基、氨基等作为配体的固相载体。此外，为了将糖链固定，可以使用具有酰肼基、氨氧基等作为配体的固相载体。也优选使糖链吸附于亲水相互作用色谱(以下称为HILIC)用的载体、即固定相，进一步优选该HILIC用的载体含有酰胺基。通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，使得反应后的反应溶液的去除变容易，可以高效进行唾液酸的修饰。

选择性内酯化反应后的试样可以根据需要而通过公知的方法等进行纯化、脱盐、增溶、浓缩、干燥等处理。在图1的流程图所示的各反应的前后也同样。

步骤S1003结束后，进入步骤S1005。

(开环反应)

在步骤S1005中，进行使试样与溶剂(以下称为开环反应用溶剂)接触、使在选择性内酯化反应中生成的内酯开环的反应(开环反应)(以下在记载为开环反应的情况下，在没有特别提及的情况下，是指步骤S1005的开环反应)。如上所述，在进行了选择性内酯化反应时，至少在O-连接型糖链中，有时α2,6-唾液酸会内酯化。通过该开环反应，使意外内酯化的α2,6-唾液酸的内酯开环。另一方面，对于在选择性内酯化反应中进行了酰胺化等与内酯化不同的修饰的唾液酸，原样维持该修饰。在此，“意外内酯化”是指，由于一次的选择性内酯化反应的反应特异性不充分，应进行与内酯化不同的修饰的唾液酸被内酯化。

(关于开环反应用溶剂)

开环反应用溶剂没有特别限定，可以使用任意的溶剂。即使开环反应用溶剂使用水，虽然有时会花费数十小时，但也可以通过水解引发内酯的开环反应。对于开环反应用溶剂，为了高效制备分析用试样，优选以更短的时间使内酯开环。从该角度来看，开环反应用溶剂优选为碱性溶剂，更优选为pH为8以上的碱性溶剂，进一步优选为pH为10以上的碱性溶剂。虽然对内酯的水解而言碱性溶剂比酸性溶剂更适宜，但从迅速进行开环反应的角度来看，开环反应用溶剂也优选为酸性溶剂，更优选为pH为6以下的酸性溶剂，进一步优选为pH为4以下的酸性溶剂。

开环反应用溶剂从防止引发与唾液酸的意外反应的角度来看，优选不含醇、胺或其盐。然而，只要可以在后述的步骤S1009后得到以充分的反应特异性进行了选择性内酯化的反应产物，则可以含有醇、胺或其盐。含有胺的情况下，更优选未形成盐的胺。作为适宜的例子，开环反应用溶剂从容易购得、属于强碱等角度来看，优选为氢氧化钠水溶液。该氢氧化钠水溶液从操作的危险性等角度来看，更优选为5重量％以下的浓度。作为其他例子，开环反应用溶剂优选含有属于强碱的季烷基铵阳离子或四甲基胍。

(用于引发开环反应的时间)

使供于选择性内酯化反应后的试样与开环反应用溶剂接触的时间没有特别限定，也取决于开环反应用溶剂的种类，优选为10分钟以下，对于高效制备分析用试样而言优选为数秒或更短的短时间。在如后所述将试样固定于固相的情况下，可以通过进行开环反应用溶剂的数秒等的液体流通等来引发开环反应。

(进行开环反应的相)

开环反应可以以液相或固相实施。在将试样固定于固相的状态下进行选择性内酯化反应的情况下，可以将供于选择性内酯化反应的试样维持在固定于固相的状态下进行开环反应。此外，也可以将试样供于选择性内酯化反应后固定于固相来进行开环反应。

以固相进行选择性内酯化反应的情况下，作为固相载体，可以使用与关于选择性内酯化反应所述的同样的物质。对于试样在固相载体上的固定，可以使用与关于选择性内酯化反应所述的条件。对于试样自固相载体的游离，可以采用关于后述的稳定化反应所述的条件。通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，使得开环反应后的开环反应用溶剂的去除等变容易，可以高效进行唾液酸的修饰。

步骤S1005结束后，进入步骤S1007。

在步骤S1007中，再次进行选择性内酯化反应，对于在步骤S1003进行的选择性内酯化反应中意外内酯化的唾液酸，通过步骤S1007的选择性内酯化反应，对其至少一部分进行与内酯化不同的修饰。对于在选择性内酯化反应中有意进行内酯化的α2,3-唾液酸等特定连接方式的唾液酸，在每次选择性内酯化反应时内酯化，在每次开环反应时开环。

步骤S1007结束后，进入步骤S1009。

在步骤S1009中，进一步仅以规定次数交替重复进行步骤S1005和步骤S1007。通过开环反应和接着开环反应进行的选择性内酯化反应，使意外内酯化的唾液酸的内酯开环，基于一次的选择性内酯化反应的反应特异性而再次被修饰。由于进行了除内酯化以外的修饰的唾液酸会在之后的反应中以原样残留，因此通过重复反应，意外内酯化的唾液酸会逐渐减少。因此，通过重复进行开环反应和选择性内酯化反应的组合，可以准确进行连接方式特异性选择性内酯化反应。

在步骤S1009中重复选择性内酯化反应的次数(以下称为重复次数)没有特别限定。由于重复次数越多，多次选择性内酯化反应整体的反应特异性越高，因此重复次数优选为1次以上，更优选为2次以上。如果重复次数过多，则制备分析用试样的效率会变差，因此重复次数可以适当设定为100次以下、10次以下等。

步骤S1009结束后，进入步骤S1011。

需要说明的是，在步骤S1007中可得到以所期望的反应特异性进行了选择性内酯化的试样的情况下，步骤S1009可以省略。

(关于稳定化反应)

在步骤S1011中，进行如下的反应(以下称为稳定化反应)，即，所述反应使试样与用于进行使形成了内酯的唾液酸稳定化的修饰的反应溶液(以下称为稳定化反应溶液)接触、使进行了内酯化的唾液酸稳定化。稳定化反应对在选择性内酯化反应中形成了内酯的α2,3-唾液酸等进行与步骤S1003中对α2,6-唾液酸所进行的修饰不同的修饰，取得分析用试样。

需要说明的是，可以省略步骤S1011，通过质谱分析、色谱或它们的组合等对进行了选择性内酯化的试样进行分析。

在稳定化反应中，对在选择性内酯化反应中形成了内酯的唾液酸进行修饰的反应的种类没有特别限定，可以进行酰胺化、酯化等。酰胺化、酯化优选对内酯中含有的碳所构成的羧基进行。在通过酰胺化进行修饰的情况下，使稳定化反应溶液中含有氨、胺或它们的盐。在通过酯化进行修饰的情况下，使稳定化反应溶液中含有醇。

在使用质谱分析对稳定化反应后得到的分析用试样进行分析的情况下，在步骤S1011中根据唾液酸的连接方式对内酯进行修饰，以便形成不同质量的修饰体。换言之，在步骤S1003中使第1连接方式的唾液酸生成内酯，使与第1连接方式不同的第2连接方式的唾液酸生成与内酯不同的修饰体A。该情况下，步骤S1011使第1连接方式的唾液酸生成具有与修饰体A不同的质量的修饰体B。在此，修饰体A与修饰体B的质量之差以根据分析用试样的质谱分析中的质量分辨率能够充分区别的程度设定得较大。在上文中，优选第1连接方式的唾液酸含有α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一种，第2连接方式的唾液酸含有α2,6-唾液酸。

在使用色谱对稳定化反应后得到的分析用试样进行分析的情况下，如果在步骤S1011中根据唾液酸的连接方式形成具有不同取代基的修饰体，则可促进基于色谱的分离，是优选的。

作为稳定化反应的例子，有专利文献2中记载的内酯的开环和之后的酰胺化。该情况下，例如通过试样与碱性溶剂、酸性溶剂等的接触来使内酯开环。然后，可以通过使含有甲胺、乙胺等伯烷基胺等胺或它们的盐以及脱水缩合剂的稳定化反应溶液与试样接触来进行被开环了的唾液酸的酰胺化。在此，脱水缩合剂可以含有六氟磷酸鏻(PyBOP)等鏻系脱水缩合剂、脲鎓系脱水缩合剂。此外，从提高酰胺化效率的角度来看，可以将N-甲基吗啉(NMM)加入稳定化反应溶液。

作为稳定化反应的其他例子，可举出通过使稳定化反应溶液与试样接触而一次性进行从唾液酸的内酯化体到酰胺化体的转换。该情况下，使含有甲胺、乙胺等伯烷基胺等胺或它们的盐的稳定化反应溶液与试样接触。通过设定为pH为8以上、优选为10以上等碱性条件，可以容易地引发上述转换。脱水缩合剂在该情况下不是特别必要，可以含有在稳定化反应溶液中。

(关于进行稳定化反应的相)

稳定化反应可以以液相或固相进行。只要能够使试样与稳定化反应溶液接触，则引发稳定化反应时的试样的状态没有特别限定，优选在使试样中含有的糖链结合或吸附于固相载体的状态下接触稳定化反应溶液。

以固相进行反应的情况下，作为固相载体，可以使用关于选择性内酯化反应所述的同样的物质。对于试样在固相载体上的固定，可以采用关于选择性内酯化反应所述的条件。

使稳定化反应溶液作用于固定于固相载体的试样进行内酯的修饰后，通过化学方法、酶反应等使试样自载体游离并进行回收即可。例如可以通过PNGase F等糖苷酶、胰蛋白酶等消化酶将固定于载体的糖蛋白、糖肽以酶的方式切断或以化学方式切断进行回收，也可以通过弱酸性溶液使结合于具有酰肼基的固相载体的糖链游离并进行回收。HILIC可以通过以乙腈等作为溶剂的稳定化反应溶液进行稳定化反应，通过水等水系溶液使试样洗脱。

通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，使得反应溶液的去除、脱盐纯化更为容易，能够将试样的制备简化。此外，使用固相载体的情况下，以糖蛋白、糖肽的状态固定试样，在稳定化反应后，进行利用PNGase F等糖苷酶等的切断的话，也可以以游离糖链的形式将内酯化反应后的试样回收。

步骤S1011结束后，进入步骤S1013。

在步骤S1013中，通过质谱分析、色谱或它们的组合对试样进行分析。通过上述选择性内酯化反应，使得如α2,6-唾液酸这样不易内酯化的糖链与α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸、α2,9-唾液酸等容易内酯化的糖链的质量不同。因此，可以通过质谱分析根据唾液酸的连接方式将这些糖链分离。

质谱中的电离的方法没有特别限定，可以使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾(ESI)法、纳米电喷雾电离(nano-LSI)法等。电离的方法特别优选MALDI法。质谱分析中的电离可以使用正离子模式和负离子模式中的任一种。质谱可以以多级进行，由此可以适宜地分析除唾液酸的连接方式以外的糖链的结构、肽链的结构。

此外，可以根据选择性内酯化反应和稳定化反应的结果所产生的修饰体的特性，用色谱等除质谱分析以外的分析方法等进行分析。液相色谱中使用的色谱柱没有特别限定，可以适当使用C30、C18、C8、C4等疏水反相柱、碳柱、HILIC用的正相柱等。对于通过多次分离来精密进行试样中的成分的分析而言优选在进行液相色谱后通过质谱分析进行测定。该情况下，更优选以在线控制在质谱仪中直接通过ESI等对来自液相色谱图的洗脱液进行电离。

步骤S1013结束后，结束处理。

(关于分析用试样的制备用试剂盒)

提供适宜在本实施方式的分析用试样的制备方法中使用的分析用试样的制备用试剂盒(以下称为制备用试剂盒)。制备用试剂盒只要含有例如pH为8以上的碱性溶剂等上述开环反应用溶剂，则其内容没有特别限定，可以含有试剂、除试剂以外的质谱分析中使用的任意的消耗品。通过使用制备用试剂盒制备分析用试样，可以更高效地制备分析用试样。

根据上述实施方式，可获得如下的作用效果。

(1)本实施方式的分析用试样的制备方法具备：进行选择性内酯化反应的步骤，所述选择性内酯化反应用于在糖链结合有唾液酸的情况下对第1连接方式(α2,3-等)的唾液酸进行内酯化，并对与第1连接方式不同的第2连接方式(α2,6-等)的唾液酸进行与内酯化不同的修饰；进行开环反应的步骤，对在选择性内酯化反应中生成的内酯进行开环；以及，再次进行选择性内酯化反应的步骤。由此，能够更准确地进行连接方式特异性的唾液酸的修饰。

(2)本实施方式的分析用试样的制备方法在开环反应中，对第2连接方式的唾液酸经内酯化而生成的内酯进行开环。由此，能够防止第2连接方式的唾液酸以内酯体的形式供于稳定化反应、质谱分析等分析。

(3)本实施方式的分析用试样的制备方法还具备：将进行开环反应和选择性内酯化反应的操仅以1次以上的规定次数交替重复进行的步骤。由此，能够降低意外内酯化的唾液酸的比例，更准确地进行连接方式特异性的唾液酸的修饰。

(4)在本实施方式的分析用试样的制备方法中，开环反应通过使供于选择性内酯化反应的试样与pH为8以上的碱性溶剂等接触来进行。由此，能够利用内酯容易发生开环的碱性条件，高效进行分析用试样的制备。

(5)在本实施方式的分析用试样的制备方法中，能够使包括选择性内酯化反应和开环反应的多次反应中的至少一次反应在糖链结合或吸附于固相载体的状态下进行。由此，能够使反应溶液的去除、脱盐纯化等容易，高效进行分析用试样的制备。

(6)在本实施方式的分析用试样的制备方法中，第2连接方式的唾液酸的修饰为酯化或酰胺化。由此，能够制备第2连接方式的唾液酸经稳定化的分析用试样。

(7)在本实施方式的分析用试样的制备方法中，对由选择性内酯化反应生成的内酯进行与第2连接方式的唾液酸的修饰不同的修饰。由此，能够制备第1连接方式的唾液酸经稳定化的分析用试样。

(8)本实施方式的分析方法具备：通过本实施方式的分析用试样的制备方法制备分析用试样的步骤；以及，对所制备的分析用试样进行分析的步骤。由此，能够以良好的精度地区别唾液酸的连接方式来分析糖链。

(9)在本实施方式的分析方法中，所制备的分析用试样可以通过质谱分析和色谱中的至少一种进行分析。由此，能够根据连接方式特异性地产生的质量的差、色谱中对分离的影响，区别唾液酸的连接方式来分析糖链。

(10)本实施方式的分析用试样的制备用试剂盒可以具备pH为8以上的碱性溶剂。由此，能够迅速地供应、制备开环反应用溶剂。

本发明并不限定于上述实施方式的内容。可在本发明的技术构思的范围内想到的其他方式也落在本发明的范围内。

实施例

以下示出本实施方式的实施例，但本发明并不限定于下述的实施例。需要说明的是，在下文中，％的记载在没有特别提及的情况下表示重量％。

作为试样中含有的结构已知的糖链，使用以非还原β脱离从牛胎球蛋白中切出的O-连接型糖链，分析以何种水平的准确度进行了连接方式特异性的唾液酸的修饰。

<非还原β脱离处理>

将溶解为10μg/μL的胎球蛋白20μL与30mg的氨基甲酸铵混合，通过旋涡混合器充分搅拌使其中的至少一部分溶解。将溶解有胎球蛋白的溶液在60℃的培养箱中培养20小时，进行非还原β脱离。然后，将在试样中加入500μL的H₂O并在70℃下进行减压离心浓缩的操作重复3次，将多余的氨基甲酸铵去除。

<O-连接型糖链在酰肼珠上的固定>

使供于非还原β脱离后的试样与由具有酰肼基作为配体的珠形成的固相载体(糖链纯化试剂盒BlotGlyco(SUMITOMO BAKELITE Co.,Ltd.)的内容物)结合。糖链与固相载体的结合按照糖链纯化试剂盒BlotGlyco的标准规程进行。

<酰肼珠上的连接方式特异性修饰>

针对固定于酰肼珠的试样，分别使用现有的方法(现有方法)和上述实施方式的方法(改良方法)进行唾液酸的连接方式特异性修饰。

(现有方法)

将结合糖链后的载体用200μL的DMSO洗涤3次。然后，在载体中加入含有异丙胺的100μL的选择性内酯化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、500mM EDC-HCl、500mM Oxyma)，边以800rpm轻轻搅拌边反应1.5小时(由此，使α2,6-唾液酸转换成异丙基酰胺、使α2,3-唾液酸转换成内酯体)。通过离心去除选择性内酯化反应溶液后，用200μL的甲醇进行1次洗涤。然后，为了使内酯断裂，用200μL的1％甲胺水溶液将载体洗涤3次。接着，用200μL的甲醇进行2次洗涤以及用200μL的DMSO进行3次洗涤。然后，为了对内酯体进行甲基酰胺化，将100μL的稳定化反应溶液(1M甲胺盐酸盐、250mM PyBOP、15％NMM)加入载体，在室温下1小时搅拌。然后，分别用200μL的DMSO、200μL的甲醇和200μL的水各进行3次洗涤。

(改良方法)

将结合糖链后的载体用200μL的DMSO洗涤3次。然后，在载体中加入含有异丙胺的100μL的选择性内酯化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、500mM EDC-HCl、500mM Oxyma)，边以800rpm轻轻搅拌边反应0.5小时。通过离心去除选择性内酯化反应溶液后，用200μL的甲醇进行1次洗涤。然后，使用200μL的1％异丙胺水溶液作为开环反应用溶剂，用该水溶液将载体洗涤3次，由此使内酯断裂。接着，用200μL的甲醇进行2次洗涤以及用200μL的DMSO进行3次洗涤。然后，在载体中再次加入含有异丙胺的100μL的选择性内酯化反应溶液，边以800rpm轻轻搅拌边反应0.5小时。之后与上述同样进行基于利用1％异丙胺水溶液洗涤载体的内酯断裂，然后，进一步加入含有异丙胺的100μL的选择性内酯化反应溶液，边以800rpm轻轻搅拌边反应0.5小时。然后，为了使内酯断裂，用200μL的1％甲胺水溶液将载体洗涤3次。接着，用200μL的甲醇进行2次洗涤以及用200μL的DMSO进行3次洗涤。然后，将100μL的稳定化反应溶液(1M甲胺盐酸盐、250mM PyBOP、15％NMM)加入载体，在室温下1小时搅拌。然后，分别用200μL的DMSO、200μL的甲醇和200μL的水各进行3次洗涤。

<糖链自酰肼珠的游离和糖链的标签化、质谱分析>

按照BlotGlyco的标准规程的方法使稳定化反应后的糖链试样自载体游离。具体而言，将20μL的H₂O和180μL的2％乙酸/乙腈加入载体，不盖盖地在70℃下加热1.5小时，由此使溶剂蒸发、使糖链游离。然后，用50μL的H₂O进行3次洗脱将糖链回收。所回收的糖链用Stage Tip Carbon进行脱盐纯化，通过减压离心浓缩使其干固。Stage Tip Carbon是将Empore Disk-Carbon(3M制造)切成直径约1mm并装入200μL的吸头而得的碳吸头。脱盐纯化在Stage Tip Carbon中加入100μL的乙腈(ACN)后，通过离心排出。然后，使用1M NaOH、1MHCl、H₂O、80％ACN 0.1％三氟乙酸(TFA)溶液和H₂O，按顺序进行同样的操作，进行柱载体的洗涤和平衡化。然后，将含有游离的糖链的溶液加入色谱柱，通过离心排出该溶液。进一步将加入150μL的H₂O后通过离心排出的操作重复3次，进行洗涤。最后，将加入20μL的80％ACN0.1％TFA溶液并通过离心排出的操作重复2次，使糖链洗脱。将2次的洗脱液合并，通过SpeedVac(Thermo Fisher Scientific)去除溶剂并干固。

使干固的试样再溶解于10μL的H₂O，将1μL滴加到聚焦板(focus plate)上，加入0.5μL作为基质的溶解于50％ACN的100mM 3AQ/CA(3--氨基喹啉/对香豆酸)、2mM磷酸二氢铵后，在75℃的加热块上反应1.5小时，进行基于3AQ的糖链的还原末端的标签化。反应结束后，将板冷却至室温，通过MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance、Shimadzu/Kratos)以负离子模式进行飞行时间型质谱分析。

图2是进行上述质谱得到的(a)现有方法和(b)改良方法的负离子质谱。由于胎球蛋白的O-连接型糖链的结构已明确，因此将糖链的结构与峰对应记载。在该糖链中的α2,3-唾液酸进行了甲基酰胺化、α2,6-唾液酸进行了异丙基酰胺化的情况下，会在m/z 1242.13附近观测到峰(参见箭头A1)。由(a)现有方法得到的质谱中，与该峰相比，相对于该m/z值具有与-28Da对应的差的m/z1214.4所对应的峰以更高的强度被观测到。该m/z 1214.4的峰相当于α2,6-唾液酸意外进行内酯化而得的错误反应产物(本来仅要进行异丙基酰胺化(iPA化)的峰由于进行了甲基酰胺化(MA化)而生成的峰)。(b)改良方法中得到的质谱中，来源于该错误反应产物的峰的强度降低，与α2,6-唾液酸正确iPA化的反应产物对应的峰以较强的强度被观测到。

对于选择性内酯化反应，尽管现有方法的反应时间与改良方法的总反应时间都同样为1.5小时，但改良方法中错误反应产物的比例减少，这必然是由于在改良方法中在各选择性内酯化反应之间进行了使内酯断裂的操作。