阅读说明：本技术 马来酸卡比沙明在制备抗流感病毒药物中的应用 (Application of carbinoxamine maleate in preparation of anti-influenza virus medicine ) 是由 陆路 姜世勃 徐巍 刘腾 王茜 花晨 王聪 付玉红 李佩玉 于 2018-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及马来酸卡比沙明在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。经实验表明,所述马来酸卡比沙明在完全无毒性浓度时对不同型和亚型的流感病毒均有显著的抗流感活性,并呈剂量依赖性地抑制所有检测病毒株的复制,表明马来酸卡比沙明抗流感病毒活性具有一定的广谱性,本发明所述流感病毒包括甲型和乙型流感病毒,包括H1N1、H3N2、H7N9、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2或B型；本发明作用机制研究表明马来酸卡比沙明主要通过干扰流感病毒的内吞作用抑制病毒进入宿主细胞；所述的马来酸卡比沙明可制备用于预防和治疗流感的药物,为预防和治疗流感提供新的途径和手段。(The invention belongs to the technical field of medicines, and relates to application of carbinoxamine maleate in preparation of an anti-influenza A virus medicine. Experiments show that the carbinoxamine maleate has obvious anti-influenza activity on different types and subtypes of influenza viruses when in completely nontoxic concentration, inhibits the replication of all detected virus strains in a dose-dependent manner, and shows that the anti-influenza virus activity of the carbinoxamine maleate has certain broad spectrum, wherein the influenza viruses comprise influenza A viruses and influenza B viruses, including H1N1, H3N2, H7N9, H5N1, H7N1, H7N2, H7N3, H7N7, H9N2 or B viruses; the research of the action mechanism of the invention shows that the carbinoxamine maleate mainly inhibits the virus from entering the host cell by interfering the endocytosis of the influenza virus; the carbinoxamine maleate can be used for preparing a medicine for preventing and treating influenza, and provides a new way and means for preventing and treating the influenza.)

马来酸卡比沙明在制备抗流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及马来酸卡比沙明在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。

背景技术

现有技术公开了流感病毒能引起急性呼吸道感染性疾病，具有极高的发病率和较高的死亡率，对人类健康造成重大威胁。流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒，按其致病力及宿主类型的不同可以分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四种类型；其中甲型流感病毒(IAV)的宿主范围最广，致病率最强，同时研究发现有些乙型流感病毒株也能引起人类的感染，全球每年约有500万的人死于季节性流感的爆发。尽管大多数流感病毒感染是自限性的，但它们有时可能诱发严重甚至致命的疾病，例如肺炎和充血性心力衰竭。另外，由于甲型流感病毒表面抗原频繁发生的抗原漂移或转变，导致新型的重组禽流感病毒亚型不断出现继续威胁着人类生命；如，最近爆发的高致病性H5N1禽流感对人类和动物均造成严重威胁，其致死率高达60％；2013年4月，中国报道了一种新型的重组A型禽流感病毒(H7N9)，其在随后的此外5次重大疫情中造成至少1,564人死亡；此外，在过去的两年里，其他的高致病性重组禽流感病毒不断出现，包括H5N8，H5N6和H10N8，这表明在未来预防流感病毒感染方面将面临无法预测的情况。目前，由于抗病毒药物抵抗和疫苗脱逃，特别是高致病性流感病毒，致使针对流感感染的有效治疗药物仍显不足。因此，迫切需要开发新的抗病毒药物以预防和治疗流感病毒感染。

目前临床上使用的抗流感病毒药物主要有三类：1)M2离子通道抑制剂，包括金刚烷胺和金刚烷乙胺；2)神经氨酸酶抑制剂，包括奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦；3)RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂，法匹拉韦。然而，甲型流感病毒的不断演变和极速的耐药性，尤其是对金刚烷胺和奥司他韦，限制了这两类药物的使用。法匹拉韦是一种RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂，为广谱抗病毒药物，目前只在日本以抗流感病毒药物上市，未被广泛使用。因此，研究新型的抗流感病毒药物控制禽流感或人类大流行的流感病毒株成为了人类亟待解决的问题。

基于现有技术的现状，本发申请的发明人拟筛选利用FDA批准的已经在先前的临床试验中被证明是安全的临床中使用的现有治疗非感染性疾病药物用于制备新的抗病毒药物药物，尤其涉及一种马来酸卡比沙明在制备抗流感病毒药物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，针对临床上治疗流感病毒药物不足，提供新型的抗流感病毒抑制剂，为临床上流感的治疗提供一类安全高效毒副作用小的小分子化合物；尤其涉及一种马来酸卡比沙明在制备抗流感病毒药物中的应用。

本发明所述的马来酸卡比沙明(CAM)在无毒性范围内能够有效地抑制甲型和乙型流感病毒的活性，可进一步开发为治疗流感病毒感染疾病的药物，使其具有更广泛的应用前景。

本发明中，筛选了一个FDA批准的含有1,280个化合物的药物库，获得了一种式I结构的抗组胺药马来酸卡比沙明(CAM)，经实验证实其对甲型流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)具有强大的抑制活性；

所述的马来酸卡比沙明(CAM)(商品名：Palgic，Histex PD，Karbinal ER，Carboxine)为作用于H1受体的抗组胺药物，属于人工合成的小分子化合物，在1950年被美国FDA批准用于治疗花粉症，鼻炎，荨麻疹以及哮喘等，但迄今未见有CAM直接用于抗流感病毒方面的应用的博导。本发明通过实验评估了CAM在体外和体内针对不同型和亚型的流感病毒的抗病毒活性，尤其是能显著的抑制小鼠对甲型流感病毒株H7N9的感染，并研究其潜在作用机制，结果显示，CAM具有抗流感病毒的用途，该CAM具有成为抗流感病毒药物的前景。

本发明中，所述化合物CAM能抑制甲型流感病毒H1N1、H3N2、H7N9以及乙型流感病毒在宿主细胞中的复制；

所述化合物CAM能靶向于流感病毒的内吞阶段，从而抑制病毒进入宿主细胞，具有明显的抗病毒活性，可用于开发成抗流感的药物。

本发明所述化合物CAM为FDA已经批准的临床使用药物，具有安全高效毒副作用小的特点。

本发明提供了马来酸卡比沙明在制备抗流感病毒药物中的新用途；所述流感病毒包括甲型和乙型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H7N9、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2或B型；所述马来酸卡比沙明在完全无毒性浓度时对不同型和亚型的流感病毒均有显著的抗流感活性，并呈剂量依赖性地抑制所检测病毒株的复制，实验结果表明马来酸卡比沙明抗流感病毒活性具有广谱性；

本发明中进行了作用机制研究，结果表明，马来酸卡比沙明主要通过干扰流感病毒的内吞作用抑制病毒进入宿主细胞，制备用于预防和治疗流感的药物。

更进一步，本发明的马来酸卡比沙明可制备新型抗甲型和乙型流感病毒药物，为预防和治疗流感提供了一种新的途径和手段。

本发明所述化合物CAM可利用现代药学领域的常规方法制备成多种药学上可接受的剂型，如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、注射液等，用于流感的治疗。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1.化合物CAM均能抑制甲型流感H1N1、H3N2、H7N9病毒株以及乙型流感病毒对细胞的感染，具有广谱的抗病毒活性。

2.化合物CAM对细胞的毒性较小，对MDCK细胞的CC50值分别为240.52±12.53μM。CAM对甲型流感H1N1、H3N2、H7N9病毒株以及乙型流感病毒的IC₅₀从4.24到15.54μM不等，安全指数在15～68之间，可作为安全有效的抗流感病毒药物应用。

3.化合物CAM作用于流感病毒初始进入阶段，从而抑制病毒进入宿主细胞。同时，其能解决针对靶点M2离子通道和神经氨酸酶的耐药性，是一个潜在有效的抗病毒药物。

附图说明

图1化合物CAM的化学结构式。

图2化合物CAM对MDCK细胞的毒性检测。

图3化合物CAM抗流感病毒的活性，其中，A.化合物CAM对甲型流感病毒株A/Shanghai/37T/2009(H1N1)的抑制活性；B.化合物CAM对甲型流感病毒株A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的抑制活性；C.化合物CAM对甲型流感病毒株A/Guizhou/54/1989(H3N2)的抑制活性；D.化合物CAM对乙型流感病毒株B/Shanghai/2017(BY)的抑制活性。

图4，化合物CAM的体内抗病毒活性检测，其中，A.化合物CAM对小鼠感染高致病性甲型流感病毒H7N9的存活率的影响；B.阳性对照奥司他韦(OSE)组和阴性对照PBS组对小鼠感染高致病性甲型流感病毒H7N9的存活率的影响。

图5，检测在流感病毒感染后的不同时间点干预CAM的抗病毒活性，化合物CAM作用于流感病毒的感染早期。

图6，化合物CAM对病毒吸附入侵的影响，其中，A.化合物CAM对H7N9假病毒感染的抑制活性；B.化合物CAM对VSV假病毒感染的抑制活性。

图7，化合物CAM对红细胞凝集和子代病毒释放的影响，其中，A.化合物CAM对红细胞凝集的影响；B.化合物CAM对神经氨酸酶活性的影响。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合实验和结果对化合物CAM在抗甲型和乙型流感病毒中的应用进一步说明。

本发明所用的材料：

细胞与病毒：犬肾上皮细胞(MDCK细胞)和293T细胞生长于含10％胎牛血清，100U/L青霉素、链霉素的DMEM培养基；流感病毒A/Shanghai/37T/2009(H1N1),A/Puerto Rico/8/1934(H1N1),A/Guizhou/54/1989(H3N2),A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)和B/Shanghai/2017(BY)由上海市公共卫生临床中心馈赠；质粒H7N9HA、VSV-G和pNL4-3R-E-Luc用于假病毒的制备；pNL4-3R-E-Luc是在pNL4-3进行移码突变使其不表达Env蛋白和Vpr蛋白，并***荧光素酶报告基因的一个重组质粒；所有与活病毒相关试验在生物安全3级设施中进行。

实施例1化合物CAM体外抗流感病毒的活性检测

本发明体外抗病毒实验中涉及多种亚型的甲型和乙型流感病毒，包括A/Shanghai/37T/2009(H1N1),A/Puerto Rico/8/1934(H1N1),A/Guizhou/54/1989(H3N2)和B/Shanghai/2017(BY)，具体方法如下：

MDCK细胞按2×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层。每孔加入50μl梯度稀释的化合物和50μl 100TCID₅₀的流感病毒液混合后感染细胞，37℃孵育8h后。弃混合液，加入DMEM(含2μg/mlTPCK)空白培养基每孔200μl，继续培养48h。结合CCK-8法，通过化合物对细胞的保护作用测定化合物的抗病毒活性，并进一步计算半数有效浓度IC₅₀；

试验结果表明，化合物CAM能抑制多种亚型的流感病毒感染，如图2所示，化合物CAM对甲型流感病毒H1N1、H3N2和H7N9以及乙型流感病毒B/Shanghai/2017(BY)均有显著地抑制作用，且存在着明显的剂量依赖关系；CAM对流感病毒的抑制率随着浓度的增加而增加，对不同型和亚型的流感病毒半数有效浓度IC₅₀为4.24到15.54μM不等，选择性安全指数为15～68之间(如表1所示)，化合物CAM实验结果与阳性化合物利巴韦林相一致。

表1化合物CAM抑制流感病毒活性

实施例2化合物CAM的细胞毒性检测

化合物CAM对细胞毒性的检测采用CCK-8法；具体方法如下：

MDCK细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层，将DMEM梯度稀释的CAM加入到96孔板中，每孔100μl，继续培养72h，每孔加入20μL含CCK-8溶液，37℃孵育1h，采用多功能酶标仪(Ultra 384,Tecan,NC)检测450nm处吸光度，以细胞的存活率作为CAM对MDCK细胞的毒性的指标；试验结果显示，化合物CAM细胞毒性小，安全性较高，如图2所示，化合物CAM对细胞的毒性较小，在250μM的浓度范围内对MDCK细胞几乎没有毒性，其半数毒性浓度(CC₅₀)为240.52±12.53μM(图3)；本发明的实验研究中选用的最高药物浓度在200μM以内，是在安全无毒性浓度范围内。

实施例3化合物CAM体内抗流感病毒的活性检测

本发明进一步评价CAM对流感病毒的体内抑制活性，采用4～8周的C57BL/6雌性鼠被甲型流感病毒H7N9感染后1h干预CAM，检测感染14天后的存活率，具体方法如下：

利用10LD50的甲型流感病毒A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)接种4～8周龄的C57BL/6雌性鼠，。在感染1h后，分别以高剂量(10mg/kg/天)和低剂量(1mg/kg/天)腹腔内注射CAM，持续干预5天，以神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦(OSE)(1mg/kg/天)作为阳性对照组，PBS组作为阴性对照，感染流感病毒后2、4、6、8、10、12和14天计算小鼠的存活率；试验结果表明化合物CAM对感染流感病毒的小鼠具有保护作用；

进一步评价化合物CAM体内抗甲型流感病毒H7N9的活性，使用4～8周龄的C57BL/6小鼠接种10LD50的甲型流感病毒H7N9，结果表明小鼠腹腔内注射CAM 5天能剂量依赖性地保护小鼠免受感染H7N9引起的死亡(如图4所示)，结果表明CAM在治疗或预防流感病毒感染方面具有良好的临床应用潜力。

实施例4化合物CAM在甲型流感病毒感染的早期阶段抑制病毒感染

本发明通过改变CAM作用时间进行研究，以确定化合物CAM干扰病毒生命周期中的阶段，通过如下方法：

MDCK细胞按2×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层，使用MOI＝0.1的甲型流感A/Shanghai/37T/2009(H1N1)病毒株感染细胞，分别在细胞感染后的0、0.5、1、2、4和12h干预处理CAM，最后在病毒感染10h后，利用上述描述的CCK-8的方法检测化合物CAM的抗病毒作用；试验结果显示，化合物CAM作用于病毒的感染早期，

基于流感病毒的生命周期包括几个阶段，为了确定化合物CAM作用于病毒生命周期的哪个阶段，本发明采用不同时间点加药的方式进行实验研究，使用甲型流感病毒感染MDCK细胞，分别在感染后0、0.5、1、2、4和12h将CAM加入MDCK细胞中，如图5所示，当在0h和0.5h干预时，CAM分别对甲型流感病毒H1N1感染具有很强的抑制作用，随着干预时间延长，它们对病毒的抑制活性逐渐降低，在感染后4h干预，CAM对流感病毒的抑制率仅有23％，结果表明，CAM在流感病毒的感染早期发挥抗病毒作用，可能是病毒的进入阶段。

实施例5化合物CAM抑制H7N9假病毒吸附入侵宿主细胞

本发明采用H7N9假病毒体系检测化合物CAM对病毒吸附入侵宿主细胞的影响；H7N9假病毒体系是指用H7N9HA、和pNL4-3R-E-Luc质粒共转染293T细胞，组装成的假病毒含有包膜蛋白血凝素HA，介导病毒的吸附入侵，且无病毒的自我复制能力，只具有单轮感染性，生物安全性高，可以在生物安全2级实验室完成；涉及的VSV假病毒是用VSV-G质粒代替H7N9HA包装出来的假病毒，作为阴性对照；具体方法如下：

MDCK细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养至80～90％，将50μl 2倍倍比稀释的化合物CAM与50μl假病毒混合物共同加入到细胞中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养12h后，弃去培养上清，加入含有2％FBS的DMEM培养基继续培养，48h后，弃培养上清，按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测病毒的感染能力，每孔加入50μl的细胞裂解液，至于振荡器上振荡20min，接着吸取40μl 96孔板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后同时加入40μl的荧光素酶底物；用酶标仪测荧光素酶的化学发光值，根据化学发光值的大小，判断化合物CAM抑制病毒吸附进入的活性，

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

其中，E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值；本发明中，化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)作为化合物的抗流感病毒活性的指标；试验结果显示，化合物CAM抑制H7N9假病毒进入宿主细胞；

本发明进一步检测CAM对流感假病毒吸附入侵宿主细胞的影响，以研究化合物CAM抗流感病毒的作用机制，如图6所示的H7N9和VSV假病毒感染抑制实验显示，化合物CAM能明显地抑制H7N9假病毒进入MDCK细胞，且具有浓度依赖性，表明化合物CAM可能通过作用于流感病毒的表明抗原血凝素(HA)发挥的抗流感病毒作用。

实施例6化合物CAM对流感病毒引起的血凝和子代病毒释放的影响

本发明利用血凝抑制实验检测化合物CAM对流感病毒包膜蛋白HA1的影响，流感病毒的包膜蛋白HA介导病毒进入宿主细胞，它是由HA1和HA2两个亚基组成，分别具有协助流感病毒吸附到宿主细胞以及病毒在内吞进入过程中膜融合的功能，在此基础上，本实施例中采用血凝抑制实验检测CAM是否影响流感病毒吸附靶细胞；具体方法如下：

向96孔V型血凝板的前1～9孔中加25μl 2倍稀释的化合物，第10孔加入25μl的抗体作阳性对照组，第11～12孔中加入25μl PBS缓冲液，作为阴性对照组和空白对照组；在第1～11孔中加入25μl 4个血凝单位的2009H1N1和H7N9病毒抗原混匀，第12孔补加25μl PBS缓冲液，室温静置几分钟；每孔加入50μl的1％鸡红细胞混悬液，于4℃静置约1h，观察及拍下红细胞凝集情况；

同时，为了检测化合物CAM对子代病毒的释放，本发明采用神经氨酸酶的抑制实验，原理为：底物4-methylumbelliferyl-N-acetyba-D-neuraminicacid(4-MUNANA)可被流感病毒包膜蛋白神经氨酸酶NA催化产生荧光物质，此荧光物质的最大激发波长为340nm，最大发射波长为440nm，采用多功能酶标仪测定该荧光即可实现化合物CAM对神经氨酸酶抑制作用的检测，具体方法如下：

在96孔荧光酶标板内每孔加入15μl病毒液和5μl 2倍倍比稀释的化合物CAM的混合液，37℃孵育30min，然后每孔加入30μl 20μM 4-MUNANA，稀释液为32.5mM MES，4mMCaCl₂，pH＝6.5。于微孔板振荡器上振动1min，37℃避光孵育1h。最后用多功能酶标仪测定荧光值，计算出抑制率，

抑制率(％)＝(F_NA-F_sam)/(F_NA-F_bla)×100％

试验结果显示，化合物CAM不影响流感病毒HA1和神经氨酸酶的活性；

进一步，本发明检测CAM是否影响流感病毒的吸附和子代病毒的释放研究化合物CAM的抗病毒作用靶点，流感病毒的HA1亚基能够导致鸡红细胞的凝集，而CAM干预后并不能抑制病毒诱导的鸡红细胞凝集现象的产生(如图7A所示)，表明CAM不作用于流感病毒的HA1亚基，即不能阻碍流感病毒吸附宿主细胞；另外，如图7B和C所示的神经氨酸酶抑制实验的结果显示，化合物CAM不能抑制流感病毒包膜蛋白神经氨酸酶的活性，结果表明化合物CAM既不影响流感病毒对宿主细胞的吸附，也不能阻止子代病毒的释放，其作为一种新型抗流感病毒抑制剂，在临床应用中具有很好前景，可制备抗流感病毒药物。