谷氨酰胺荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 谷氨酰胺荧光探针及其制备方法和应用 (Glutamine fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 崔佳燕 黄瑾 马磊 黄维维 邱子言 于 2021-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了具有通式(I)的谷氨酰胺荧光探针及其制备方法和用途。该类探针的结构模块包括：谷氨酰胺、连接链和荧光报告基团。本发明的谷氨酰胺荧光探针可作为工具分子,对细胞内谷氨酰胺通量进行实时监测。更优地,此类结构的荧光探针可显示动物肿瘤模型病灶部位对谷氨酰胺的摄取情况,反映体内肿瘤的分布以及大小,丰富小动物活体成像及人类癌症筛查中对肿瘤的检测手段。(The invention discloses a glutamine fluorescent probe with a general formula (I) and a preparation method and application thereof. The structural module of the probe comprises: glutamine, a linker and a fluorescent reporter group. The glutamine fluorescent probe can be used as a tool molecule for monitoring the glutamine flux in cells in real time. Preferably, the fluorescent probe with the structure can display the glutamine uptake condition of the lesion site of the animal tumor model, reflect the distribution and the size of tumors in vivo and enrich the detection means of the tumors in small animal living body imaging and human cancer screening.)
技术领域
本发明涉及化合物
技术领域
，特别涉及药物化学领域，具体是指谷氨酰胺荧光探针及其制备方法和用途。背景技术
癌细胞是癌症产生的根源。癌细胞与正常细胞相比，有无限增殖、可转化和易转移等特点。癌细胞需要大量摄取营养物质来满足自身无限增殖的特性。
癌细胞代谢著名的“Warburg效应”指出，癌细胞能够高速消耗葡萄糖。已经开发的用于人体的FDG-PET(葡萄糖放射性示踪剂-正电子发射断层扫描)可根据癌细胞的葡萄糖代谢情况来示踪癌细胞，从而精准定位癌细胞和组织。但是，FDG-PET并不总是能提供较为准确的临床诊断结果。
谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，是机体血液循环中含量最高的游离氨基酸。谷氨酰胺的碳可用于氨基酸和脂肪酸的合成，谷氨酰胺的氮可用于嘌呤和嘧啶的合成。血液中高水平的谷氨酰胺为癌细胞提供碳源和氮源，支持癌细胞内的生物合成、能量代谢和稳态平衡，促进肿瘤生长。2021年4月7日，美国范德堡大学医学中心的研究团队在Nature杂志发表了题为Cell-programmed nutrient partitioning in the tumour microenvironment的研究论文指出癌细胞更偏向于摄取谷氨酰胺而非葡萄糖，颠覆了100年来开发和完善的癌症代谢模型以及人们对癌症的基本认知。
目前，癌细胞内谷氨酰胺的检测手段主要包括以下几种：高效液相色谱法、酶联免疫分析法和谷氨酰胺/谷氨酸转换测试法。高效液相色谱法需经过多项样品前处理步骤，样品制备复杂。酶联免疫分析法涉及抗体的使用，实验过程耗时长，对温度的要求高。谷氨酰胺/谷氨酸转换测试法涉及谷氨酰胺酶的使用，对试剂盒的保存及运输要求高。因此，目前没有一项处理简单、成本低廉、易存储、易检测的方法用于癌细胞内谷氨酰胺的检测。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺失，提供可用于实时监测细胞内谷氨酰胺通量、反映动物肿瘤模型中肿瘤大小以及分布的谷氨酰胺荧光探针及其制备方法和用途。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了谷氨酰胺荧光探针，其主要特点是，具有通式(1)的谷氨酰胺荧光探针，该探针包括谷氨酰胺(Gln)、连接链和荧光报告基团F：
其中，
Gln基团的结构为
Linker的结构为其中n为1～8的整数，或者，Linker不存在；
F为荧光报告基团，结构为
较佳地，所述的谷氨酰胺荧光探针为以下化合物中的一种，
本发明还提供了所述的谷氨酰胺荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
Fmoc-Gln(Trt)首先与2-氯三苯甲基氯树脂发生偶联反应，生成Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC树脂，反应溶剂为DMF或DCM；脱去Fmoc基团后，树脂与Fmoc-Linker反应，生成Fmoc-Linker-Gln(Trt)-2-CTC树脂，反应溶剂为DMF或DCM；脱去Fmoc基团后，树脂与荧光报告基团反应，反应溶剂为DMF或DCM；最终裂解树脂得到相应的谷氨酰胺荧光探针。
本发明的谷氨酰胺荧光探针可作为工具分子，对细胞内谷氨酰胺通量进行实时监测。更优的，此类结构的荧光探针可显示动物肿瘤模型病灶部位对谷氨酰胺的摄取情况，反映体内肿瘤的分布以及大小，丰富小动物活体成像中对肿瘤的检测手段。
附图说明
图1为未加入谷氨酰胺荧光探针和加入谷氨酰胺荧光探针后4小时的细胞内荧光显示图。
图2a和2b分别为使用谷氨酰胺荧光探针前后的成像对比图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的谷氨酰胺荧光探针进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1谷氨酰胺荧光探针1的制备
Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin的制备
将2-氯三苯甲基氯树脂(1g,0.4mmol/g～3mmol/g)在10mL DCM中溶胀1h，过滤，DCM洗涤3次。加入Fmoc-Gln(Trt)(2g,3.4mmol)，DIPEA(0.85g,6.6mmol)，在DCM中室温反应2h。反应结束后，过滤除去偶联液，DCM洗涤3次。
Fmoc-Acp-Gln(Trt)-2-CTC resin的制备
向上一步所得树脂中加入10mL 20％的哌啶/DMF溶液，反应30min。茚三酮检测为阳性时，表明反应结束。反应结束后，过滤，用DMF洗涤5次。加入Fmoc-6-氨基己酸(1.7g,4.9mmol)，HOBt(0.79g,5.9mmol)，DIC(0.74g,5.9mmol)，在DMF中室温反应2h。茚三酮检测为阴性时，表明反应结束。反应结束后，过滤除去偶联液，DMF洗涤3次。
FITC-Acp-Gln(Trt)-2-CTC resin的制备
向上一步所得树脂中加入10mL 20％的哌啶/DMF溶液，反应30min。茚三酮检测为阳性时，表明反应结束。反应结束后，过滤，用DMF洗涤5次。加入FITC(0.66g,1.7mmol)，在DMF溶液中室温避光反应2h。茚三酮检测为阴性时，表明反应结束。反应结束后，过滤除去偶联液，DMF洗涤3次。甲醇洗涤2次，收缩树脂。
FITC-Acp-Gln的制备
向上一步所得树脂中，加入10mL TFE:DCM＝1:3(V/V)溶液，室温反应2h，过滤，DCM洗涤3次，浓缩所得滤液，加入10mL TFA:H2O＝95:5(V/V)溶液，室温反应2h，乙醚重结晶即得到荧光探针1。
化合物FITC-Acp-Gln，C32H32N4O9S，黄色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(1H,s),7.73(1H,d,J＝8Hz),7.30(1H,d,J＝8Hz),7.19(2H,m),6.57(4H,m),4.18(1H,m),3.39(2H,m),2.14(4H,m),1.93(1H,m),1.74(1H,m),1.56(4H,m),1.34(2H,m).MS(ESI):m/z 649.20[M+H]+。
实施例2谷氨酰胺荧光探针2的制备
Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin的制备
将2-氯三苯甲基氯树脂(1g,0.4mmol/g～3mmol/g)在10mL DCM中溶胀1h，过滤，DCM洗涤3次。加入Fmoc-Gln(Trt)(2g,3.4mmol)，DIPEA(0.85g,6.6mmol)，在DCM中室温反应2h。反应结束后，过滤除去偶联液，DCM洗涤3次。
Rhodamine B-Gln(Trt)-2-CTC resin的制备
向上一步所得树脂中加入10mL 20％的哌啶/DMF溶液，反应30min。茚三酮检测为阳性时，表明反应结束。反应结束后，过滤，用DMF洗涤5次，备用。将Rhodamine B(2.4g,4.8mmol)，PyAOP(2.5g,4.8mmol)，HOAt(0.68g,4.8mmol)，DIPEA(1.2g,4.8mmol)，溶解于DMF中，室温搅拌10min，加入上述树脂，室温反应2h。茚三酮检测为阴性时，表明反应结束。反应结束后，过滤除去偶联液，DMF洗涤3次。甲醇洗涤2次，收缩树脂。
Rhodamine B-Gln的制备
向上一步所得树脂中，加入10mL TFE:DCM＝1:3(V/V)溶液，室温反应2h，过滤，DCM洗涤3次，浓缩所得滤液，加入10mL TFA:H2O＝95:5(V/V)溶液，室温反应2h，乙醚重结晶即得到荧光探针2。
化合物Rhodamine B-Gln，C33H39N4O5 +，暗红色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(1H,m),7.49(1H,m),7.38(1H,m),7.29(1H,m),7.20(2H,m),6.87(2H,m),6.79(2H,m),4.33(1H,m),3.64(8H,m),2.34(2H,m),1.85(2H,m),1.27(6H,t),1.17(6H,t).MS(ESI):m/z571.29[M]+。
实施例3
将上述制备得到的谷氨酰胺荧光探针用于癌细胞内谷氨酰胺的通量的实时检测。
实验前，将非小细胞肺癌细胞A549以100000个/孔接种在35mm共聚焦显微镜专用玻底培养皿中，并用DMEM完全培养基进行培养，细胞培养基中含有胎牛血清(体积比：10％)、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)。将培养皿置于含体积比为5％CO2的37℃培养箱中培养24小时。用PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4)洗涤A549细胞三次。加入1mL Hoechst33258染色液以及细胞膜红色荧光探针Dil，置于含体积比为5％CO2的37℃培养箱中培养20-30分钟。弃去染色液，用PBS洗涤A549细胞三次。加入含谷氨酰胺荧光探针(FITC-Acp-Gln，4mM)的DMEM培养基，置于含体积比为5％CO2的37℃培养箱中培养。4小时后，弃去培养基，用PBS洗涤A549细胞三次，置于转盘共聚焦显微镜(Nikon CSU-W1 SoRa)下观察细胞内谷氨酰胺荧光摄取情况。
结果如图1所示，当未加入谷氨酰胺荧光探针时，细胞内无明显的绿色荧光；当加入谷氨酰胺荧光探针后4小时，细胞内出现了明显的绿色荧光，说明细胞有效摄取了谷氨酰胺，并且该探针可用于细胞内谷氨酰胺通量的检测。
实施例4
将上述制备得到的谷氨酰胺荧光探针用于动物肿瘤模型中肿瘤分布及大小的成像。
使用能够稳定表达荧光素酶的A549-luc细胞构建裸鼠肺转移模型。选取6周龄雌性裸鼠，将100μL含5×106个A549-luc细胞悬液以尾静脉注射的方式注射进小鼠体内。正常喂养3周后，向每只小鼠腹腔注射0.5mg/kg谷氨酰胺荧光探针(Rhodamine B-Gln)，体内循环6个小时。6小时后首先向每只小鼠腹腔注射2mg荧光素酶底物D-luciferin，反应10min可在小动物活体成像系统中使用生物发光检测小鼠肺部的转移情况，随后使用荧光检测肺转移部位谷氨酰胺的摄取情况。
结果如图2a和2b所示，图2a中使用荧光素酶底物D-luciferin清楚地显示裸鼠肺转移模型造模成功。图2b中使用谷氨酰胺荧光探针成像显示部位与荧光素成像显示部位高度重合，说明谷氨酰胺荧光探针可用于肿瘤模型中肿瘤分布及大小的检测。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。
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