水稻组蛋白去乙酰化酶基因hda710在延迟叶片衰老中的应用
阅读说明：本技术 水稻组蛋白去乙酰化酶基因hda710在延迟叶片衰老中的应用 (Application of rice histone deacetylase gene HDA710 in delaying leaf senescence ) 是由 苏震 徐文英 赵楠楠 魏强 张群莲 于 2019-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了水稻组蛋白去乙酰化酶基因HDA710在延迟叶片衰老中的应用。本发明提供了水稻HDA710蛋白的新用途,即在调控植物的叶片衰老进程中的应用。过表达HDA710基因的转基因植株,叶绿素含量升高、电导率降低,符合其叶片晚衰的特征。低表达HDA710基因的转基因植株,符合叶片早衰的特征。本发明为促进表观遗传和遗传变异在作物育种中的应用提供了新的方向。(The invention discloses application of a rice histone deacetylase gene HDA710 in delaying leaf senescence. The invention provides a new application of rice HDA710 protein, namely an application in regulating and controlling the leaf senescence process of plants. The transgenic plant over expressing the HDA710 gene has the advantages of high chlorophyll content and low conductivity, and accords with the characteristics of late leaf senescence. The transgenic plant of the low expression HDA710 gene accords with the characteristics of the premature leaf senescence. The invention provides a new direction for promoting the application of epigenetic and genetic variation in crop breeding.)
技术领域
本发明涉及水稻组蛋白去乙酰化酶基因HDA710在延迟叶片衰老中的应用。
背景技术
表观遗传学的改变能够在各种生物学过程中重新编程转录组。组蛋白的去乙酰化在植物发育和响应各种逆境胁迫中起着重要的调控作用。在水稻中，已经报道有18个组蛋白去乙酰化酶基因。其中HDA710/OsHDAC2属于I型的组蛋白去乙酰化酶。
叶片衰老是植物发育的重要阶段，在农业生产中，早期的叶片衰老限制了植物光合作用周期，从而影响了作物的产量。水稻作为世界主要粮食作物，主要包含两个亚种，之前有研究表明，在籼稻和粳稻中的叶片衰老存在区别，籼稻的叶片衰老要早于粳稻，但是对于其中具体的机制研究还不清楚。
不同品种的遗传变异为改善作物的农艺性状提供了宝贵的资源，并可以拓宽作物表型变异的来源。随着3K水稻基因组项目的完成，丰富的遗传资源能够帮助我们更好地建立基因和表型之间的关联，对于研究衰老等农艺性状有很大的帮助。
发明内容
本发明的目的是提供水稻组蛋白去乙酰化酶基因HDA710在延迟叶片衰老中的应用。
HDA710蛋白又称为HDA710/OsHDAC2蛋白。HDA710蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物衰老进程相关的由其衍生的蛋白质；
(a3)来源于水稻且与(a1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且与植物衰老进程相关的蛋白质。
HDA710基因为编码HDA710蛋白的基因。HDA710基因又称为HDA710/OsHDAC2基因。
HDA710基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：
(b1)编码区如序列表中序列2第140-1669位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)序列表中序列2第140-2031位核苷酸所示的DNA分子；
(b3)序列表中序列2所示的DNA分子；
(b4)来源于水稻且与(b1)或(b2)或(b3)至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
本发明提供了一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物导入HDA710基因，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物衰老进程减缓。与所述受体植物相比，所述转基因植物具有晚衰的表型。
HDA710基因具体可通过重组表达载体导入受体植物。重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到受体植物中。
可用现有的植物表达载体构建含有HDA710基因的重组表达载体。
所述衰老进程减缓体现为叶绿素含量高和/或电导率低。
所述衰老进程减缓体现为叶片叶绿素含量高和/或叶片电导率低。
所述晚衰体现为叶绿素含量高和/或电导率低。
所述晚衰减缓体现为叶片叶绿素含量高和/或叶片电导率低。
本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中HDA710蛋白的含量和/或活性，从而促使植物的衰老进程减缓。从而促使植物晚衰。
本发明还保护HDA710蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)调控植物衰老进程；
(c2)促使植物衰老进程减缓；
(c3)促使植物晚衰。
本发明还提供了一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物导入抑制HDA710基因表达的核酸分子，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物衰老进程提前。与所述受体植物相比，所述转基因植物具有早衰的表型。
抑制HDA710基因表达的核酸分子具体可为HDA710基因的反义基因。转录产生反义RNA的基因称之为反义基因(antisense gene)。
抑制HDA710基因表达的核酸分子具体可通过重组表达载体导入受体植物。重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到受体植物中。
可用现有的植物表达载体构建含有抑制HDA710基因表达的核酸分子的重组表达载体。
本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：抑制植物中HDA710基因的表达，从而促使植物的衰老进程提前。从而促使植物早衰。
本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：降低植物中HDA710蛋白的含量和/或活性，从而促使植物的衰老进程提前。从而促使植物早衰。
本发明还保护抑制HDA710基因表达的核酸分子的应用，为如下(d1)或(d2)：
(d1)促使植物衰老进程提前；
(d2)促使植物早衰。
所述衰老进程提前体现为叶绿素含量低和/或电导率高。
所述衰老进程提前体现为叶片叶绿素含量低和/或叶片电导率高。
所述早衰体现为叶绿素含量低和/或电导率高。
所述早衰体现为叶片叶绿素含量低和/或叶片电导率高。
以上任一所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
所述单子叶植物具体可为禾本科植物。
所述禾本科植物具体可为水稻属植物。
所述水稻属植物具体可为粳稻，例如日本晴。
构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物。
所述植物表达载体具体可为载体pCAMBIA1300。
本发明提供了水稻HDA710蛋白的新用途，即在调控植物的叶片衰老进程中的应用。植物叶片衰老主要体现为叶绿素含量和电导率。过表达HDA710基因的转基因植株，叶绿素含量升高、电导率降低，符合其叶片晚衰的特征。低表达HDA710基因的转基因植株(即通过导入反义基因抑制HDA710基因表达的转基因植株)，符合叶片早衰的特征。即过表达HDA710基因可促使植物叶片衰老进程明显延缓。
本发明的发明人通过水稻宏基因组浏览器(RPAN)对水稻组蛋白去乙酰化酶基因HDA710/OsHDAC2的序列多态性进行查看，发现HDA710基因在籼稻和粳稻中的差异及其明显，在籼稻中基因区域和基因下游区域存在两个片段的缺失。进一步，本发明的发明人利用对应的表型性状，对品种(日本晴、9311和特青)和表型进行关联分析，发现存在缺失的品种趋向于叶片早衰。
本发明为促进表观遗传和遗传变异在作物育种中的应用提供了新的方向。
附图说明
图1为重组质粒35S::HDA710-sense和重组质粒35S::HDA710-antisense的元件示意图。
图2为实施例1中HDA710基因的相对表达水平结果。
图3为实施例1中植株表型的结果。
图4为实施例1中叶绿素含量的结果。
图5为实施例1中电导率的结果。
图6为水稻去乙酰化酶基因HDA710在籼稻和粳稻品种中序列差异。
图7为图6所示两个HDA710片段缺失片段对应的品种的衰老表型情况。
图8为实施例2中植株表型的结果。
图9为实施例2中叶绿素含量的结果。
图10为实施例2中电导率的结果。
注：图4、图5、图9和图10中，p-value<0.001用***表示，p-value<0.01用**表示，用p-value<0.05用*表示。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置四次重复实验，结果取平均值。水稻日本晴属于粳稻。水稻9311属于籼稻。水稻特青属于籼稻。
实施例1、HDA710基因转基因植株的制备和鉴定
一、重组质粒的构建
1、提取水稻日本晴的总RNA，以总RNA为模板进行反转录，得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用sense-vector-F和sense-vector-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
sense-vector-F：5’-gCTCTAgAATggACCCCTCgTCggC-3’；
sense-vector-R：5’-ggggTACCCTCATACATAAAAACgTAggAA-3’。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶XbaI和KpnI进行双酶切，回收酶切产物。
4、取载体pCAMBIA1300，用限制性内切酶XbaI和KpnI进行双酶切，回收载体骨架。
5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得重组质粒35S::HDA710-sense。根据测序结果，对重组质粒35S::HDA710-sense进行结构描述如下：在载体pCAMBIA1300的XbaI和KpnI酶切位点之间***了序列表的序列2第140-2031位核苷酸所示的DNA分子。序列表的序列2中，第140-1669位核苷酸为HDA710基因的开放阅读框。
6、以步骤1得到的cDNA为模板，采用antisense-vector-F和antisense-vectot-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
antisense-vector-F:5’-ggggTACCATggACCCCTCgTCg-3’；
antisense-vectot-R:5’-gCTCTAgACTCATACATAAAAACgTAggAA-3’。
7、取步骤6得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶KpnI和XbaI进行双酶切，回收酶切产物。
8、取载体pCAMBIA1300，用限制性内切酶KpnI和XbaI进行双酶切，回收载体骨架。
9、将步骤7得到的酶切产物和步骤8得到的载体骨架连接，得重组质粒35S::HDA710-antisense。
重组质粒35S::HDA710-sense和重组质粒35S::HDA710-antisense的元件示意图见图1。
二、拟转基因植株的制备
1、将重组质粒(重组质粒35S::HDA710-sense或重组质粒35S::HDA710-antisense)导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
2、用水稻日本晴种子制备胚性愈伤组织。
3、取步骤1得到的重组农杆菌，接种至液体AAM培养基，培养至OD600nm约等于0.1。
4、取步骤2得到的胚性愈伤组织，浸泡于步骤3得到的菌液中，轻轻晃动约1.5min，然后取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，吹干。
5、取步骤4得到的愈伤组织，依次进行共培养、筛选培养、诱导分化和生根培养，得到再生植株，又称拟转基因植株。筛选培养时采用的抗生素及其浓度为：50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄青霉素。诱导分化和生根培养时培养基中含有50mg/L潮霉素B和200mg/L羧苄青霉素。
重组质粒35S::HDA710-sense进行上述步骤得到的再生植株，命名为拟过表达植株。
重组质粒35S::HDA710-antisense进行上述步骤得到的再生植株，命名为拟低表达植株。
6、对拟转基因植株进行PCR鉴定。如果显示预期大小的扩增产物，PCR鉴定为阳性，该植株为T0代转基因植株。
PCR引物如下(靶片段位于潮霉素抗性基因，靶片段约为947bp)：
HPT-F：5’-TACTTCTACACAGCCATC-3’；
HPT-R:5’-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’。
7、取步骤6筛选到的T0代转基因植株，自交并收获种子(该种子即T1代种子)，将种子培育为植株即为T1代植株。
8、取T1代植株，自交并收获种子(该种子即T2代种子)，将种子培育为植株即为T2代植株。
9、取T1代植株以及抽样的T2代植株，进行PCR鉴定(方法同步骤6)。对于某一T1代植株，如果其自交得到的T2代植株均为转基因植株，该T1代植株为纯合的转基因植株，该植株的自交后代为一个转基因株系。
拟过表达植株得到的转基因株系为株系S1、株系S2。
拟低表达植株得到的转基因株系为株系A1、株系A2。
三、实时荧光定量RT-PCR鉴定
供试植株：水稻日本晴(Nipponbare)、株系S1的T3代植株、株系S2的T3代植株、株系A1的T3代植株、株系A2的T3代植株。
供试植株在平行条件下正常培养。
1、取生长四周的供试植株的叶片，提取总RNA，以总RNA为模板进行反转录，得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR。以18sRNA基因为内参基因。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。设置三个生物学重复，结果取平均值。
用于鉴定过表达株系中HDA710基因的引物如下：
sense-F：5'-AGTACCAGAACCGATGGCAG-3'；
sense-R：5'-GTTGATGGCCATCGAATTTG-3'。
用于鉴定低表达株系中HDA710基因的引物如下：
antisense-F：5'-AGGCAATACTGGACGTGGAG-3'；
antisense-R：5'-TTCGCCTGAAAGTTCCATCT-3'。
用于鉴定18sRNA基因的引物如下：
18s-F：5'-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3'；
18s-R：5'-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。
HDA710基因的相对表达水平见图2。过表达株系(株系S1、株系S2)植株的HDA710基因表达量显著高于水稻日本晴，低表达株系(株系A1、株系A2)植株的HDA710基因表达水平显著低于水稻日本晴。
四、性状鉴定
供试植株：水稻日本晴(Nipponbare)、株系S1的T3代植株、株系S2的T3代植株、株系A1的T3代植株、株系A2的T3代植株。
供试植株在大田中在平行条件下正常管理。
1、观察植株表型。
出苗104天植株的照片见图3A。
出苗104天植株的旗叶的照片见图3B。
出苗104天植株的倒二叶的照片见图3C。
与水稻日本晴相比，过表达株系(株系S1、株系S2)植株的叶片更绿，具有晚衰的表型。与水稻日本晴相比，低表达株系(株系A1、株系A2)植株的叶片发黄，具有早衰的表型。
2、检测叶绿素含量
出苗104天，取植株的旗叶叶片，称量20mg(鲜重)磨成粉末，然后浸泡于4℃、80％丙酮溶液中过夜，然后12000rpm离心10min，收集上清，用酶标仪测定646nm和663nm的波长。
叶绿素a(mg/ml)＝12.21A663nm-2.81A646nm；
叶绿素b(mg/ml)＝20.13A646nm-5.03A646nm；
叶绿素含量＝叶绿素a+叶绿素b。
计算每克鲜重的叶片中的叶绿素含量，单位为mg/g FW。
设置6个生物学重复，结果取平均值。
结果见图4和表1。
表1
重复1
重复2
重复3
重复4
重复5
重复6
平均值
株系A1
0.1009
0.2191
0.1732
0.1343
0.1691
0.1815
0.1915
株系A2
0.1736
0.1672
0.1888
0.1734
0.2199
0.2258
0.163
水稻日本晴
0.2749
0.2613
0.2986
0.3528
0.395
0.3947
0.3296
株系S1
0.4853
0.67
0.7429
0.5669
0.6249
0.6312
0.6202
株系S2
0.5226
0.5527
0.5752
0.6047
0.6861
0.6807
0.6037
3、检测电导率
出苗114天，取植株的旗叶叶片，浸泡于400mM甘露醇溶液中70rpm振荡3小时，此后测量初始电导率S1,然后100℃煮10分钟，然后测量最终电导率S2,然后计算相对电导率REC。REC(％)＝(S1/S2)*100。
设置4个生物学重复，结果取平均值。
结果见图5和表2。
表2
REC(％)
重复1
重复2
重复3
重复4
平均值
株系A1
15.0277
22.04424
15.29988
25.34364
19.42887
株系A2
14.31818
13.63095
16.90476
30.26397
14.9513
水稻日本晴
11.2945
12.64456
13.17104
11.34492
12.11376
株系S1
5
5.171806
10.36154
11.76318
8.074131
株系S2
8.248276
9.021497
7.348259
10.73016
8.837048
实施例2、
一、利用RPAN网站挖掘籼稻和粳稻差异关键基因并与表型关联
去乙酰化酶基因HDA710在网站RPAN(http://cgm.sjtu.edu.cn/3kricedb/)网站进行搜素，找到在水稻五个亚种[JAP(粳稻),IND(籼稻),AUS(籼稻类似品种),ARO(粳稻类似品种),ADM(籼稻和粳稻中间品种)]中出现的频率。HDA710基因的两个片段在不同品种的缺失情况通过RPAN网站的UCSC浏览器进行人工查看找到，见图6。从Rice SNP-SeekDatabase(https://snp-seek.irri.org/_download.zul)网站上下载2266个品种的表型数据，对有HDA710基因片段缺失的品种用超几何分布进行表型关联，见图7。
二、水稻日本晴、水稻9311和水稻特青的性状比较
水稻日本晴属于粳稻。水稻9311属于籼稻。水稻特青属于籼稻。与粳稻日本晴相比，籼稻9311和籼稻特青的HDA710基因存在两个片段缺失，分别位于内含子区域和3’端非转录区域。
供试植株：水稻日本晴(Nipponbare)、水稻9311(9311)、水稻特青(TQ)。
供试植株在大田中在平行条件下正常管理。
1、观察植株表型。
出苗104天植株的旗叶的照片见图8A。
出苗104天植株的倒二叶的照片见图8B。
2、检测叶绿素含量
出苗108天，使用SPAD-502叶绿素仪直接测量植株旗叶叶片的叶绿素含量。SPAD-502叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm和940nm来确定叶片当前叶绿素的相对含量，自动计算出数值，单位为SPAD。
水稻日本晴设置16个生物学重复，结果取平均值。
水稻9311设置7个生物学重复，结果取平均值。
水稻特青设置15个生物学重复，结果取平均值。
结果见表3和图9。
表3
3、检测电导率
出苗114天，取植株的旗叶叶片，浸泡于400mM甘露醇溶液中70rpm振荡3小时，此后测量初始电导率S1,然后100℃煮10分钟，然后测量最终电导率S2,然后计算相对电导率REC。REC(％)＝(S1/S2)*100。
设置4个生物学重复，结果取平均值。
结果见图10和表4。
表4
重复1
重复2
重复3
重复4
平均值
日本晴
11.2945
12.64456
13.17104
11.34492
12.11376
9311
38.13853
33.62989
37.29323
49.66346
39.68128
TQ
80.5
81.47208
74.13636
78.52792
78.65909
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 水稻组蛋白去乙酰化酶基因HDA710在延迟叶片衰老中的应用
<130> GNCYX192696
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 509
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 1
Met Asp Pro Ser Ser Ala Gly Ala Gly Gly Asn Ser Leu Ala Ser Ala
1 5 10 15
Ser Cys Gly Asp Ala Gln Lys Arg Arg Val Cys Tyr Phe Tyr Asp Pro
20 25 30
Glu Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro His
35 40 45
Arg Val Arg Met Thr His Ala Leu Leu Ala His Tyr Gly Leu Leu Ala
50 55 60
Pro Ala Lys Met Gln Val Leu Arg Pro Leu Pro Ala Arg Asp Arg Asp
65 70 75 80
Leu Cys Arg Phe His Ser Asp Asp Tyr Val Ala Phe Leu Arg Ala Val
85 90 95
Thr Pro Glu Thr Gln Phe Asp Gln Ile Arg Ser Leu Arg Arg Phe Asn
100 105 110
Val Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Ala Tyr Cys Gln
115 120 125
Thr Tyr Ala Gly Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Lys Leu Asn His Gly
130 135 140
Thr His Asp Ile Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Leu His His Ala Lys
145 150 155 160
Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala
165 170 175
Ile Leu Glu Leu Leu Lys Leu His Glu Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile
180 185 190
Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asn
195 200 205
Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Phe Gly Asp Tyr Phe Pro Gly
210 215 220
Thr Gly Asp Ile Arg Asp Ile Gly Tyr Ser Glu Gly Lys Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Leu Asn Val Pro Leu Asp Asp Gly Ile Asp Asp Asp Ser Tyr Gln Ser
245 250 255
Ile Phe Lys Pro Ile Ile Ser Lys Val Met Glu Met Tyr Arg Pro Gly
260 265 270
Ala Val Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu
275 280 285
Gly Cys Phe Asn Leu Ser Gly Lys Gly His Ala Glu Cys Val Lys Phe
290 295 300
Met Arg Ser Phe Asn Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr
305 310 315 320
Thr Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Cys Tyr Glu Thr Gly Val Ala
325 330 335
Leu Gly Glu Glu Leu Arg Glu Lys Leu Pro Tyr Asn Glu Tyr Tyr Glu
340 345 350
Tyr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Leu Tyr Val Ala Ala Ser Asn Met Glu
355 360 365
Asn Arg Asn Thr Asn Lys Gln Leu Glu Glu Ile Lys Cys Asn Ile Leu
370 375 380
Asp Asn Leu Ser Lys Leu Gln His Ala Pro Ser Val Gln Phe Glu Glu
385 390 395 400
Arg Ile Pro Glu Thr Lys Leu Pro Glu Pro Asp Glu Asp Gln Asp Asp
405 410 415
Pro Asp Glu Arg His Asp Pro Asp Ser Asp Met Leu Leu Asp Asp His
420 425 430
Lys Pro Met Gly His Ser Ala Arg Ser Leu Ile His Asn Ile Gly Val
435 440 445
Lys Arg Glu Ile Thr Glu Thr Glu Thr Lys Asp Gln His Gly Lys Arg
450 455 460
Leu Thr Thr Glu His Lys Val Pro Glu Pro Met Ala Asp Asp Leu Gly
465 470 475 480
Ser Ser Lys Gln Val Pro Thr Ala Asp Ala Asn Ser Met Ala Ile Asn
485 490 495
Ala Pro Gly Asn Ala Lys Asn Glu Pro Gly Ser Ser Leu
500 505
<210> 2
<211> 2105
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
atcgcggcat cgctcgcctc ctctgcttcg cttccttctc cagcaagcac ccgaccacaa 60
cacacacgcg agctcctcga cctcgagaga gagagaaaac ccaaccccga attcggcggc 120
ggaggcggag gcagcggcga tggacccctc gtcggcgggc gccggcggca actcgctggc 180
gtcggcgtcg tgcggcgacg cgcagaagcg gcgggtgtgc tacttctacg atccggaggt 240
gggcaactac tactacgggc agggtcaccc gatgaagccc caccgcgtga ggatgaccca 300
cgcgctgctc gcccactacg gcctcctcgc cccggccaag atgcaggtgc tccgcccgct 360
ccccgcccgc gaccgcgacc tctgccgctt ccactccgac gactacgtcg ccttcctccg 420
cgccgtcacc ccggagaccc agttcgacca gatccgctcc ctccgccgct tcaacgtcgg 480
cgaggactgc cccgtcttcg acggcctcta cgcctactgc cagacctacg cgggggcctc 540
cgtcggcgcc gccgtcaagc tcaaccacgg cacccacgac atcgccatca actggtccgg 600
cgggttgcac cacgccaaga agtccgaggc ctccggcttc tgctacgtca acgacatcgt 660
cctcgccatc ctcgagctcc tcaagctcca tgagcgagtt ctgtatattg atattgatat 720
ccatcatgga gatggagttg aggaggcatt ctacacaaca aacagggtta tgacagtctc 780
atttcacaag tttggggatt atttcccggg aacaggggac atccgcgata ttgggtattc 840
agaagggaag tattactgcc tgaatgtccc gctggatgat ggaattgatg atgacagcta 900
ccagtccatc ttcaagccga tcatcagcaa agtcatggag atgtatcgtc ctggtgcagt 960
cgtgcttcag tgcggcgctg attcgttgtc cggtgatagg ttgggctgtt tcaatctctc 1020
aggcaaaggt catgctgaat gtgttaagtt catgaggtct ttcaatgttc cgttgcttct 1080
tcttggtggt ggtggatata ccataagaaa tgttgcacgc tgctggtgtt acgagacagg 1140
agttgcactt ggtgaagagc tacgggagaa gttgccttat aacgagtatt atgaatattt 1200
tggtccagaa tacagtcttt acgttgcagc aagtaacatg gagaacagaa atacaaacaa 1260
gcaattggag gaaataaaat gcaacattct ggacaatctc tcaaaacttc aacatgctcc 1320
tagtgtccaa tttgaagagc gaattcctga aacaaagcta cctgagccag atgaagatca 1380
agatgatcca gatgaaaggc acgaccctga ctctgatatg ctgttggatg atcacaaacc 1440
tatgggacac tcagcaagaa gccttattca caacatcgga gttaagagag aaattactga 1500
aacagagacc aaagatcagc atggtaagag attaacaact gaacataaag taccagaacc 1560
gatggcagac gatcttggtt cctccaagca agttcctact gcggatgcaa attcgatggc 1620
catcaacgcg ccaggcaacg ccaagaatga accgggaagc tcactatgaa ctaacccact 1680
tcaggccacc agctcttatg ccacggattc ctgcatgcta ttagttactt actccgaggt 1740
gttgtatgac tgtttcttct gtaggagttt acaaattaca actgtttctt ttgttgaaga 1800
attccaaagt gtccaggcaa tactggacgt ggagacatta gtctgatcaa tgtactgcag 1860
agtacagaac atgtaacatg aaccaagtta cagtgtatag tcttttagac tgttagatgg 1920
aactttcagg cgaaatgcct gtgcctactt gtgtgtgctc tctgttggtt gtttttcgtt 1980
aaaatatttt gttccggttt atcatgtact tcctacgttt ttatgtatga gttgttttaa 2040
agagacaaat aaatctattt tttaatttat aatagttaat acttaattaa ttatgtgcta 2100
gtaaa 2105
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